被子植物開花時間和花器官發(fā)育的表觀遺傳調控研究進展

1、園 藝 學 報 2014，41（6）：12451256 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20131108；修回日期：20140410 基金項目：中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目（2571014EA03）；林木遺傳育種國家重點實驗室（東北林業(yè)大學）創(chuàng)新項目（C201016）；黑龍江省自然科學基金項目（C201016）；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才專項資金項目（2013RFLXJ015） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：qijiangx

2、u；Tel 被子植物開花時間和花器官發(fā)育的表觀遺傳調控研究進展 李 巍，徐啟江* （東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，生命科學學院，哈爾濱 150040） 摘 要：成花轉換是被子植物生活周期中的關鍵發(fā)育過程，植物通過調控基因表達模式而整合多條內外開花信號實現(xiàn)成花誘導。近幾十年來，學者們?yōu)殛U釋植物成花轉換的分子機制做了大量的分子遺傳學研究。其中，影響植物生長發(fā)育的表觀遺傳修飾是調控成花轉換過程的重要分子機制之一。表觀遺傳調控是植物在適宜環(huán)境條件下實現(xiàn)開花誘導和花器官發(fā)育的決定性因素。綜述了有關開花時間和花器官發(fā)育的表觀遺傳學研究進展，包括染色質重塑、組蛋白甲基

3、化和miRNAs。 關鍵詞：被子植物；表觀遺傳；染色質重塑；miRNA；開花時間；花器官發(fā)育 中圖分類號：S 68；Q 945.6 文獻標志碼：A 文章編號：0513-353X（2014）06-1245-12 Epigenetic Research Progress on Flowering Time and Flower Organ Development in Angiosperms LI Wei and XU Qi-jiang* （The State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，College of Life Sciences

4、，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China） Abstract：The floral transition is a critical developmental process in angiosperms life cycle. Plants integrate multiple endogenous and environmental signals through gene expression pattern changes to result in flowering. Over the past few decades，e

5、xtensive molecular genetic studies have elucidated the molecular mechanisms governing the floral transition. One key molecular mechanism for this transition involves epigenetic modifications that affect a number of aspects of plant growth and development. Epigenetic control is determinative in plant

6、s for coordinating the switch to flowering under favorable internal and external conditions and achieving reproductive success. In this review，research progress on the epigenetic regulation associated with flowering time and floral organ development. These epigenetic modifications include chromatin

7、remodeling，histone methylation，and the miRNAs that mediate epigenetic modifications. Key words：angiosperms；epigenetic；chromatin remodeling；miRNAs；flowering time；floral organ development 1246 園 藝 學 報 41卷 被子植物，即有花植物，是植物界進化最高級、種類最多、分布最廣的類群，約有35萬種。植物開花過程是個復合的多步驟過程，適當?shù)拈_花時間對植物的成功繁殖很重要。植物開花時間和花器官發(fā)育受到眾多基因的復

8、雜調控，其中包括花器官特征基因、開花整合因子和一些進化保守的microRNAs（miRNAs）。隨著分子生物學技術不斷進步和發(fā)展，人們已經(jīng)從眾多模式植物如擬南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、矮牽牛（Petunia hybrida）、金魚草（Antirrhinum majus）等分離并鑒定了包括miRNAs在內的許多影響植物開花時間和花器官發(fā)育的基因與調控因子。表觀遺傳學（epigenetics）是指DNA序列未發(fā)生變化，但是基因表達卻發(fā)生了可遺傳的改變。不僅是基因組序列包含遺傳信息，其修飾也可以記載遺傳信息。表觀遺傳現(xiàn)

9、象包括DNA甲基化、RNA干擾、組蛋白修飾等。近年來在開花基因座C（FLOWERING LOCUS C，F(xiàn)LC）表觀遺傳調控過程中發(fā)現(xiàn)兩個長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），即冷誘導的長鏈基因內反義RNA（cold induced long antisense intragenic RNA，COOLAIR）和冷輔助內含子非編碼RNA（cold assisted intronic noncoding RNA，COLDAIR），二者通過寒冷誘導，促進春化過程的發(fā)生。這兩個IncRNAs的研究為春化作用調控機制提供了新思路。目前發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在表觀遺傳學的調控

10、中也起到重要作用。同時，作為開花負調控因子，F(xiàn)LC是調控植物開花時間的關鍵基因，通過FLC染色質修飾而實現(xiàn)對其調控作用。表觀遺傳是被子植物開花信號通路中的重要機制，對開花及花器官發(fā)育產生關鍵調控作用，深入解析表觀遺傳調控開花的機理，將為通過表觀遺傳途徑調控花發(fā)育奠定理論基礎。本文中主要綜述了染色體重塑、組蛋白甲基化和miRNA（包括miRNA172、miRNA156、miRNA159、miRNA169、miRNA319及miRNA167/160）對被子植物開花時間及花器官發(fā)育調控機制的研究進展。 1 染色體重塑對植物春化的影響 在真核生物中，染色質是由DNA和組蛋白一起被壓縮成的一個高度有序的

11、結構。核小體是染色質的基本結構單位，其核心是由H2A、H2B、H3、H4各兩個分子所組成的組蛋白八聚體，每一個核小體中都有146 bp的DNA纏繞在組蛋白八聚體上，核小體之間由組蛋白H1和DNA結合。染色質重塑（chromatin remodeling）就是基因表達調控過程中出現(xiàn)的一系列染色質結構變化的總稱。 春化作用（vernalization）為低溫（一般4 ，14 15 d）誘導開花，它只是誘導植物開花的必要條件，而不是充分條件，經(jīng)過春化處理的幼苗在常溫下不會立即開花，需要數(shù)周以后才能開花，低溫誘導和開花之間這種明顯的時間間隔表明植物細胞有記憶功能經(jīng)春化處理的植物回到常溫后，F(xiàn)LC mR

12、NA水平仍然很低，這種低水平不會因有絲分裂而改變。 在春化之前FLC位點的染色質是有強轉錄活性的，在冷處理之前FLC的表達水平和激活型組蛋白修飾H3K4三甲基化水平很高。催化H3K4甲基化的甲基轉移酶Set1/COMPASS（complex of proteins associated with Set1）復合體與啟動子和轉錄早期的RNA聚合酶復合物結合，給FLC染色體打上“活性”標簽，而且這個標簽會被RNA聚合酶相關因子1（RNA-polymerase associated factor 1，PAF1）識別進行激活轉錄。在寒冷環(huán)境下，F(xiàn)LC染色質從“激活”到“抑制”狀態(tài)發(fā)生明顯轉變，并伴隨著

13、抑制型組蛋白的修飾H3K9和H3K27甲基化的增加。在這個過程中有3個重要因子VERNALIZATION INSENSITIVE 3（VIN3）、VERNALIZATION 1（VRN1）和VRN2起作用（Gendall et al.，2001；Levy et al.，2002；Sung & Amasino，2004），并推測VRN1、VRN2和VIN3對FLC基因表達調控是通過調節(jié)FLC 基因染色質中組蛋白不同化學修飾狀態(tài)實現(xiàn)的。人們普遍認為植物同源結構域（plant homeodomain，PHD）參與蛋白質蛋白質相互作用，常見于染色質重塑復合體各個成員的分子結構中（Sung & Amas

14、ino，2004）。VIN3編碼的PHD結構域蛋白與染色質空間結構的6期 李 巍等：被子植物開花時間和花器官發(fā)育的表觀遺傳調控研究進展 1247 變化有關（Sung & Amasino，2004）。在vin3突變體中FLC含量沒有下降，證明了VIN3在形成FLC染色質抑制狀態(tài)起到了重要作用。VRN1和VRN2蛋白通過維持由VIN3引起的H3K9和H3K27甲基化來維持FLC的抑制狀態(tài)。VRN2編碼鋅指結構蛋白，通過對組蛋白氨基端特異氨基酸脫乙?；图谆揎検谷旧|保持沉默狀態(tài)。VRN1編碼一種植物特有的DNA結合蛋白（Levy et al.，2002），改變染色質結構。 春化過程中，F(xiàn)LC的

15、表達活性逐漸減弱，植物同源域多梳蛋白抑制復合體2（plant homeodomain- polycomb repressive complex 2，PHD-PRC2）結合到FLC上。最近的研究表明，PRC2作為一種組蛋白甲基轉移酶，主要促進H3K27三甲基化。除了PRC2的核心部分，PHD-PRC2還含有植物特異性組分，可以提高PRC2組蛋白甲基轉移酶活性。同時在冷處理過程中，F(xiàn)LC位點的H3K27me3水平不斷上升。雖然H3K27me3對于維持FLC沉默是必要的，但是還不夠，在vernalization1（vrn1）突變體中，春化結束后FLC活性得到恢復，即使高甲基化水平的H3K27仍然存在

16、（Bastow et al.，2004）。H3K27me3不能直接引起染色體的壓縮或者抑制轉錄，但是可以抑制起始FLC轉錄的蛋白因子對FLC啟動子序列的識別。PRC2自身結合H3K27me3，可以對未修飾的新合成蛋白質進行甲基化處理，從而使這個標記在整個細胞分裂過程中穩(wěn)定遺傳。但是，PcG（polycomb group）蛋白復合體缺乏與DNA結合的能力，那么它們是如何結合到FLC這樣的靶基因上的？大量試驗證明，兩個非編碼的RNA參與了春化誘導的PHD-PRC2與FLC結合。調節(jié)FLC表觀沉默的lncRNA COLDAIR，其轉錄本長1.1 kb，由FLC正義鏈第1個內含子形成，具有5帽子結構，

17、但是缺少3多聚腺苷酸（poly A）結構。研究顯示PHD-PRC2復合體的催化亞基卷葉蛋白（CURLY LEAF，CLF）可以結合到COLDAIR RNA上（Heo & Sung，2011）。這個過程可以幫助PHD-PRC2與FLC結合。對COLDAIR進行RNA干涉會減少CLF與FLC的結合，最終損害冷處理后FLC沉默的維持。第2個非編碼RNA即COOLAIR，也來自于FLC（Swiezewski et al.，2009），由RNA聚合酶（RNA polymerase，Pol）轉錄，是植物體內天然存在的FLC反向轉錄本，具有典型的5帽子結構和3 poly A結構。像COLDAIR一樣，COO

18、LAIR的表達也會在冷處理后顯著上調。在春化過程中，F(xiàn)LC編碼區(qū)3端下游啟動子啟動COOLAIR表達。根據(jù)剪切方式的不同，COOLAIR分為近端和遠端兩種類型。COOLAIR轉錄本在近端和遠端分別有兩個多聚腺苷酸化位點。在COOLAIR遠3端的聚腺苷酸化與FLC的高豐度表達相關。在近3端與FLC的低豐度表達相關。兩個自主途徑基因FCA和FPA編碼RNA結合蛋白，促進了COOLAIR轉錄本近多聚腺苷酸化位點3端的形成，清除了激活型組蛋白修飾（FLC的H3K4me3）（Hornyik et al.，2010；Liu et al.，2010a），最終引起FLC轉錄水平下調促進開花。 2 miRNA調

19、控植物開花時間 2.1 miRNA的合成 miRNA是由內源基因編碼、長度約21 23 nt的非編碼小RNA分子，作為負調控因子主要在轉錄后水平上調節(jié)基因的活性（Httenhofer et al.，2002），通過與靶基因的互補位點結合而降解或抑制靶mRNA的翻譯。植物存在大量的miRNAs家族，miRNA在調控植物發(fā)育方面發(fā)揮著廣泛的作用。從成花誘導到花器官特征屬性的形成，miRNA在整個花發(fā)育過程均發(fā)揮著關鍵作用（Llave et al.，2002；Park et al.，2002；Reinhart et al.，2002）。miRNA通常由獨立的轉錄單位編碼，由核酸內切酶Dicer加工而

20、成，Dicer酶特異性的對具有發(fā)夾結構的70 90 nt的雙鏈RNA前體（pre-miRNA）進行剪切，產生miRNA/miRNA*二聚體，而后miRNA選擇性的整合到AGO（argonaute）等蛋白質上而形成RNA誘導沉默復合體（RNA induced silencing complex，RISC）。此時miRNA*從AGO復1248 園 藝 學 報 41卷 合物中脫離，RISC通過抑制靶基因的翻譯或者對靶基因進行切割，從而調控基因的表達。在擬南芥中的10個AGO家族蛋白，其中AGO1是miRNA合成途徑中最重要的因子。 2.2 miRNA172調控擬南芥開花時間 擬南芥MIR172基因組

21、包含5類：MIR172a、MIR172b、MIR172c、MIR172d和MIR172e?；趍iR172對開花調控機理的研究，miR172已成為翻譯抑制最好的例子（Chen，2004）。最近的研究顯示miR172可以通過降解靶基因mRNA（Jung et al.，2007；Wollmann et al.，2011）來進行調控。在擬南芥中，miR172調控具有miR172結合位點的APETALA2（AP2）類轉錄因子基因，包括AP2、TARGET OF EAT1（TOE1）、TOE2、TOE3、SCHLAFMUTZE（SMZ）和SCHNARCHZAPFEN（SNZ）。 Aukerman和Sak

22、ai（2003）首次發(fā)現(xiàn)miR172對于開花時間的調控作用。miR172b過表達突變體植株（eat-D）是早花突變體。與35S：miR172早花表型相比，miR172的靶基因TOE1過表達導致了晚花表型。這個觀察證明了TOE1是控制開花時間的抑制因子。與此相同，toe1的缺失突變體導致開花稍微提前，這個表型在TOE2基因的缺失突變體中加強了。然而toe1 toe2雙突變體開花時間仍然比miR172過表達突變體晚，意味著除了TOE1和TOE2還有其他因子抑制開花。最近的研究表明SMZ和SNZ過表達突變體開花比野生型晚，雖然smz snz雙突變體的開花時間沒有受到顯著影響（Mathieu et a

23、l.，2009），但是toe1 toe2 smz snz四突變體開花比toe1 toe2雙突變體早很多。但是四突變體開花卻比35S：miR172株系晚，證明除了AP2家族，仍然有其他基因起到抑制作用。 AP2家族基因通過編碼轉錄抑制子來控制開花時間。AP2可以直接結合到開花途徑的整合因子SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1（SOC1）和花分生組織決定基因APETALA1（AP1）啟動子上（Yant et al.，2010）。染色質免疫沉淀測序（chromatin immunoprecipitation-sequencing，ChIP-Seq）分析發(fā)現(xiàn)AP2蛋白也

24、結合到TOE3啟動子上（Yant et al.，2010），證明在AP2家族基因之間存在反饋調節(jié)環(huán)。另一個AP2家族蛋白SMZ直接結合到光周期途徑開花時間調控因子FLOWERING LOCUS T （FT）下游1.5 kb處，并抑制其轉錄。在莖尖分生組織中，除了SOC1和FT，SMZ也直接結合到AP1上（Mathieu et al.，2009）。由于在toe1 toe2雙突變體中FT的表達上調，所以FT被認為是TOE1和TOE2蛋白的靶基因（Jung et al.，2007）。 除了TOE3，AP2家族基因的轉錄水平隨著種子萌發(fā)不斷下降（Aukerman & Sakai，2003；Jung e

25、t al.，2007；Mathieu et al.，2009）。這種時空表達模式可能是由于miR172活性的增加。miR172隨著植物生長其表達量不斷增加，主要受到SBP（SQUAMOSA promoter binding protein）盒轉錄因子的轉錄調控，而且miR172自身也受到miR156的調控（Wu et al.，2009）。通過抑制AP2家族基因的活性，SBP轉錄因子調控MIR172b的轉錄促使植物開花。 Jung等（2007）研究表明日照長度也可以影響擬南芥中miR172的表達水平。在長日照（long day，LD）條件下，miR172的積累比短日照（short day，SD）

26、條件下多。相比光周期途徑constans（co）突變體中miR172水平在gigantea（gi）突變體中有所下降。雖然GI作用在CO上游，但是miR172積累量的減少不依賴于CO作用。這個事實表明CO可能通過獨立于miR172的作用途徑調控開花時間。 溫度是另一個影響開花時間的重要環(huán)境因素，同時也影響miR172的表達水平。Lee等（2010）檢測植物16 時miRNA水平，發(fā)現(xiàn)miR172是一個應答環(huán)境溫度的miRNA。最近的報道顯示，擬南芥的RNA結合蛋白FCA對環(huán)境溫度產生應答并促進pre-miR172的加工過程從而大量合成miR172，合成的miR172進而作用于開花調節(jié)因子FT誘導

27、開花（Jung et al.，2012b）。FCA-miR172 調節(jié)子為植物提供了一個在變動的環(huán)境溫度條件下對開花時間進行微調的自適應策略。 6期 李 巍等：被子植物開花時間和花器官發(fā)育的表觀遺傳調控研究進展 1249 2.3 miR156對植物開花時間的調控 植物的生長發(fā)育分為兩個階段：營養(yǎng)生長時期和生殖生長時期。營養(yǎng)生長時期主要是葉片的產生，生殖生長時期主要是開花和結果。營養(yǎng)生長時期又包括幼年期和成年期。miR156是植物生長周期轉變的主要調控基因，控制營養(yǎng)生長期到生殖生長期、幼年期到成年期的轉變。在擬南芥和玉米中，miR156被證明是最為保守的miRNA，主要調控植物幼年期的生長。 在

28、擬南芥基因組中，有10個等位基因編碼miR156，包括最新發(fā)現(xiàn)的MIR156i和MIR156j（Breakfield et al.，2012）。miR156直接抑制轉錄因子SQUAMOSAPROMOTER BINDING PROTEIN LIKE（SPL）家族成員的表達。Klein等（1996）首次在金魚草中發(fā)現(xiàn)了這些植物中特有轉錄因子，隨后證實這類蛋白均含有一個對結合DNA所必需的高度保守結構域（SBP-box）。幾乎所有的植物都含有SBP-box，其中有些含有miR156靶作用位點，這表明植物界中miR156和SBP-box靶基因對營養(yǎng)器的生長周期轉變起著重要的調控作用。擬南芥中17個家族

29、成員SPL1到SPL16（包括兩個編碼相同蛋白的基因SPL13A和SPL13B），其中11個基因含有miR156的靶作用位點。SPL3過表達突變體的早花表型是第一個證據(jù)，證明了SPL基因參與開花時間調控（Cardon et al.，1999）。隨著植物的生長，SPL3表達水平在不斷上升（Cardon et al.，1999）。此外，Schmid 等（2003）證明光誘導引起了SPL基因的上調。 miR156的表達量在胚胎和幼苗早期很高（Wu & Poethig，2006；Nodine & Bartel，2010），隨著植物的生長而表達量逐漸下降（Schmid et al.，2003；Wu &

30、Poethig，2006；Wang et al.，2009；Wu et al.，2009）。到目前為止，在幾個具有開花表型的突變體和轉基因植株中均檢測到miR156的表達（Wang et al.，2009）。然而在這些突變體中miR156的表達量都沒有受到影響，而且赤霉素和生長素也沒有影響miR156的表達（Wang et al.，2009）。這些研究結果表明，miR156的表達水平并不受影響植物開花時間的因子調控，miR156的表達水平主要依賴于植物的年齡。 長日照條件下，miR156的過量表達會引起幼年期的延長，延遲成年期的起始，同時下調SPL基因家族的表達（Klein et al.，19

31、96）。大多數(shù)miR156靶基因SPL的表達量隨著植物的生長逐漸增加（Cardon et al.，1999；Schmid et al.，2003；Wu & Poethig，2006；Wang et al.，2009；Wu et al.，2009；Yamaguchi et al.，2009），當靶基因的表達量積累到一定豐度就會啟動下游基因表達，從而誘導開花。這種表達模式反映了miR156對于植物的正常生長尤其是對開花時間很重要。當miR156的調控受到SPL基因上miR156靶位點突變的干擾，植物可以提早開花，同時SPL大量表達（Wu & Poethig，2006；Wang et al.，200

32、9）。SPL3的過表達可以促使植物提前開花，同時SPL3 mRNA在向開花轉變的過程中上升（Cardon et al.，2002）。SPL3有兩個同源基因SPL4和SPL5，SPL3過表達沒有導致花序分生組織基因LEAFY（LFY），APETALA1（AP1）和FRUITFULL（FUL）表達的上調，但是SPL4或者SPL5過表達導致了這3個基因表達量的增加。說明雖然SPL3、SPL4、SPL5基因序列相似，均調控花分生組織形成基因，但是作用是不一致的（Yamaguchi et al.，2009）。SPL9 的表達量遠遠低于SPL3，SPL9促進了成年期的形態(tài)特征形成。SPL10 也調控營養(yǎng)生

33、長階段的變化，但是其過表達的表現(xiàn)型與SPL9不同，因此可能與SPL9有不同的功能。 miR156/SPL模型以兩種不同方式調控開花時間：一是通過miR172調控消除AP2家族基因產生的開花抑制；二是通過直接促進開花整合因子和分生組織形成調控因子。SPL9直接結合到MIR172b的調控區(qū)域并誘導MIR172b表達（Wu et al.，2009）。miR172抑制AP2家族轉錄因子的表達，使植物應答適當?shù)拇碳亩T導開花。除了miR172，開花整合因子SOC1和它的同源基因AGAMOUS-LIKE 24（AGL24）也是SPL9的直接靶基因（Wang et al.，2009）。雖然FUL調節(jié)開花時

34、間的作用還不明確，但是FUL受到SPL9和SPL3的調控，也是SPL9和SPL3過表達突變體產生早1250 園 藝 學 報 41卷 花表型的原因（Wang et al.，2009；Yamaguchi et al.，2009）。最近也發(fā)現(xiàn)FT啟動子與SPL3之間的聯(lián)系，染色質免疫沉淀技術證明了SPL3蛋白可以直接結合到FT啟動子的GTAC基序上（Kim et al.，2012）。 因為pri-miR156a的表達量隨著植物的發(fā)育而逐漸下降（Wang et al.，2009），所以miR156積累水平的下降是由于其轉錄水平下降引起的。如果把已經(jīng)形成的葉片去掉，miR156的水平反而上升（Yang

35、et al.，2011）。證明葉原基是調控miR156積累量的信號之源。此外，環(huán)境溫度會影響miR156和miR172的積累量（Lee et al.，2010；Kim et al.，2012），證明環(huán)境因子通過影響這兩個miRNAs的積累量進而調節(jié)植物生長。 SPL積累的時空模式對于理解年齡途徑及植物生長與環(huán)境因子之間的復雜關系很重要。通過提高光周期途徑因子CO或FT活性從而促進SPL基因的表達，與miR156對SPL的調控途徑不同（Schmid et al.，2003；Wang et al.，2009）。這種作用模式可能直接受到花開整合因子SOC1和FT的調控（Jung et al.，201

36、2a）。在長日照條件下，F(xiàn)T和轉錄因子FD一起直接或通過SOC1調控SPL基因的表達，促進光周期途徑誘導植物開花。在短日照條件下，SOC1通過結合到SPL基因啟動子上，促進赤霉素途徑誘導植物開花（Jung et al.，2012a）。作為對環(huán)境溫度的應答，miR156-SPL3相互作用模塊和FT基因共同調控溫敏植物的開花時間（Kim et al.，2012）。因此，miR156對于開花植物的階段轉變、開花時機、花的形成起著重要的調節(jié)作用，同時也可以調控miR172等其他miRNA。 2.4 miRNA159對植物開花時間的調控 第3類小RNA miR159在赤霉素途徑中起著重要作用。擬南芥中，

37、由于在長日照條件下的Gibberellic Acid（GA）缺失突變體ga1沒有表現(xiàn)出顯著的開花表型，所以GA對于開花時間的影響一直被人們忽略了。但是在短日照條件下，ga1缺失突變體卻需要GA來促進開花（Wilson et al.，1992）。GA受體GIBBERELLIC INSENSITIVE DWARF1（GID1）的發(fā)現(xiàn)，引起了研究者對GA影響開花時間的重視。在長日照條件下，3個GID1受體功能冗余拷貝的三突變體表現(xiàn)出晚花表型（Griffiths et al.，2006；Willige et al.，2007），證明GA是長日照條件下調控開花時間的重要線索。 花序分生組織基因LFY參與

38、赤霉素途徑。GA信號受到LFY啟動子上GAMYB結合因子的調控，在短日照條件下GA提高了LFY啟動子活性（Blazquez et al.，1998；Blazquez & Weigel，2000）。在擬南芥GAMYBs家族中，MYB33結合到LFY啟動子的GAMYB結合域上，MYB33的表達可以導致GA外源性或內源性水平的增加，證明了GAMYBs對于GA調控的開花促進起到重要的作用（Gocal et al.，2001）。 在擬南芥中，MIR159a、MIR159b和MIR159c構成了miR159家族。這些miRNAs主要作用于GAMYB類轉錄因子，包括MYB33、MYB65和MYB101。在植

39、物分生組織中MYB33表達受到miR159強烈的抑制（Alonso-Peral et al.，2010）。短日照條件下，miR159過表達，植物開花延遲，而且MYB33和LFY水平降低（Achard et al.，2004）。這些觀察至少證明有一部分miR159通過赤霉素途徑調控開花時間。但是miR159表達量和GA之間的關系還不是很明確，需要進一步研究miR159與GA之間的調控模式。 3 miRNAs調控花器官的形成 3.1 miRNA159調控花藥的生長 被子植物中對于花藥的調控是保守的。在擬南芥、水稻和大麥（Hordeum vulgare）中，MIR1596期 李 巍等：被子植物開花時

40、間和花器官發(fā)育的表觀遺傳調控研究進展 1251 及其靶基因GAMYB-相關的基因對于花藥的正常生長是必須的（Achard et al.，2004）。GAMYB首次在大麥糊粉細胞中作為種子發(fā)育階段GA信號途徑的正調節(jié)因子被發(fā)現(xiàn)（Gubler et al.，1999）。隨后的研究揭示了GAMYB也作用在花發(fā)育階段（Murray et al.，2003）。在大麥中，HvGAMYB的過表達導致花藥長度的減少，并引起雄性不育（Murray et al.，2003）。GAMYB基因也在其它物種中被發(fā)現(xiàn)，例如擬南芥、水稻、燕麥（Avena sativa）等（Woodger et al.，2003；Achar

41、d et al.，2004；Tsuji et al.，2006），其作用和表達是高度保守的，而且都有保守的miR159結合位點。 擬南芥MYB33和MYB65都屬于GAMYB家族。AtMYB33的表達限制在小的花藥中。擬南芥中myb33/myb65雙突變體導致絨氈層肥大和花粉不育。miR159過表達減少了AtMYB33的表達量，引起花藥敗育，雄性不育并延遲了開花時間（Achard et al.，2004；Schwab et al.，2005）。Alonso-Peral 等（2010）發(fā)現(xiàn)miR159作為一個分子開關可以限制MYB33和MYB65在花藥中表達。 在水稻中，OsGAMYB表達也具有

42、花藥特異性，并與miR159表達呈負相關（Tsuji et al.，2006；Aya et al.，2009）。OsGAMYB的缺失突變體引起花藥和花粉的敗育（Kaneko et al.，2004）。OsGAMYB也可以直接調控小孢子的發(fā)育（Aya et al.，2009）。最近的研究發(fā)現(xiàn)了miR159與GAMYB在草莓（Fragaria ananassa）中的作用（Csukasi et al.，2012），兩類草莓的miR159家族成員Fa-miR159a和Fa-miR159b與Fa-GAMYB基因在果托的生長中相互作用，共同應答GA內源水平的變化。 3.2 miRNA319對花瓣生長的調控

43、 miR319基因家族是由3個成員（miR319a、miR319b和miR319c）組成。Li等（2011）發(fā)現(xiàn)，擬南芥miR159與miR319有17個相同的核苷酸，而且這兩個miRNA是由一個共同的祖先基因進化而來。然而，miR159和miR319有不同的表達模式并且作用于不同的基因，所以有不同的作用。miR159作用于幾個調控開花和花藥生長的GAMYB轉錄因子，但是miR319作用于調控葉片和花生長的TCP轉錄因子（Palatnik et al.，2007；Nag et al.，2009）。在花序中過量表達和沉默miR319a基因，TCP （TEOSINTE BRANCHED/CYCLO

44、IDEA/PCF）類轉錄因子的mRNA水平相對于野生型花序中的mRNA水平表現(xiàn)為下調表達和上調表達，表明miR319a可能通過結合并調節(jié)TCP類轉錄因子而在花發(fā)育過程中起作用。其中miR319a功能缺失突變體的花瓣寬度變小，花瓣和雄蕊長度減?。↘oyama et al.，2007；Nag et al.，2009；Sarvepalli & Nath，2011）。 3.3 miRNA167和miRNA160通過調控ARFs而控制花器官形成 生長素應答因子ARF（AUXIN RESPONSE FACTORS）通過結合到植物激素應答元件的啟動子上從而調控大量激素應答基因（Mockaitis & Est

45、elle，2008）。一些ARF蛋白已經(jīng)被證明調控花器官的形成，受到miRNAs的調控（Mallory et al.，2005；Wu & Poethig，2006；Wu et al.，2006；Chapman & Estelle，2009）。在已知的ARF基因中，ARF6和ARF8是miR167的靶基因，ARF10、ARF16和ARF17是miR160的靶基因（Mallory et al.，2005；Wu et al.，2006）。 ARF6和ARF8對胚珠和花藥的生長是必要的（Nagpal et al.，2005；Wu & Poethig，2006；Wu et al.，2006）。arf6

46、arf8雙缺失突變體導致了花藥和雌蕊的敗育，如雄蕊變短，花藥不開裂和胚珠珠被敗育。miR167的過表達導致ARF6和ARF8轉錄本水平下降，出現(xiàn)與arf6/arf8雙突變體相似的表型，花藥不開裂，不能釋放花粉。說明生長素應答因子ARF6和ARF8基因是miR167的直接靶點，miR167下調ARF6/ARF8對花粉發(fā)育很重要。水稻中，在花藥生長的晚期miR167含量達到很高水平，證明miR167調控花藥生長是保守的（Fujioka et al.，2008）。miR167界定ARF6和ARF8在雄蕊和胚珠中的正確表達區(qū)域（Wu et al.，2006），確保萼片、花瓣、花藥、雌蕊和胚珠的正常發(fā)育

47、，包括其外在形狀、內部細胞大小、花粉粒萌發(fā)率以及柱頭、胚軸的長短等性狀（Ru et al.，2006）。 1252 園 藝 學 報 41卷 試驗證明miR160負調控ARF10、ARF16和ARF17（Mallory et al.，2005；Liu et al.，2010b）。一個Ds轉座子插入在miR160的3調控區(qū)域的心皮缺失突變體（floral organs in carpels，foc）導致形成不規(guī)則形狀的花，育性下降（Mallory et al.，2005；Liu et al.，2010b）。在foc突變體中，由于miR160表達水平下降，導致ARF1、ARF16和ARF17轉錄水平

48、比野生型高。 3.4 miRNA169控制植物生殖器官的發(fā)育 被子植物花器官發(fā)育的ABCE模型指出，C功能基因在第3、4輪中表達，分別決定雄蕊和心皮的特征屬性。C功能基因的表達活性受到miR169的抑制。Cartolano等（2007）的研究發(fā)現(xiàn)，金魚草的FISTULATA（FIS）基因和矮牽牛的BLIND（BL）基因編碼miR169。FIS和BL將C類基因的活性限制在內兩輪花器官而調控雄蕊和心皮的發(fā)育。FIS和BL的缺失突變體導致在第2輪花器官中出現(xiàn)雄蕊化的花瓣。miR169調控NF-YA轉錄因子基因家族（Jones-Rhoades & Bartel，2004）。由于NF-YA轉錄因子可以促

49、進C類基因的表達，miR169被認為是通過對NF-YA轉錄后抑制從而抑制C類基因的活性。此外，Zhang 等（2011）發(fā)現(xiàn)miR169的過表達轉基因番茄植株Sly-miR169c的氣孔開張度減少，降低葉片水分流失，從而增強抗旱性。 miR169的靶基因是NF-YA類轉錄因子家族成員（此類轉錄因子與C功能基因PLE/pMADS3的CCAAT盒結合）（Cartolano et al.，2007）。在擬南芥中，盡管miR169也調控NFYA5基因，卻不能進一步抑制C功能基因的活性。由此推測，miR169主要在金魚草和矮牽牛中通過抑制C功能基因活性維持花的正常發(fā)育。 4 結論與展望 植物發(fā)育表觀遺傳

50、機制是表觀遺傳學的一個重要分支，近些年來發(fā)展迅速，成為當前植物學研究領域的一個熱點，主要是指在DNA序列未發(fā)生改變的情況下，DNA甲基化、染色質結構狀態(tài)、非編碼RNA等因素的改變，使基因功能發(fā)生可遺傳的變化，并最終導致表型變異的遺傳現(xiàn)象。染色質的修飾作用對于獲得穩(wěn)定的基因表達，進而形成長期的分子記憶很關鍵。春化途徑對植物開花時間的調節(jié)是通過改變開花抑制基因FLC的染色質結構來抑制其表達而促進開花，近期研究發(fā)現(xiàn)lncRNA COOLAIR和COLDAIR在染色質重塑方面的作用，為進一步研究春化途徑提供新的思路。同時，miRNAs也參與了對植物開花時間以及花器官發(fā)育的調控。 花發(fā)育是被子植物生命周

51、期中一個重要的綜合發(fā)育過程，涉及不同發(fā)育方式的轉換，包括開花誘導、信號傳遞、屬性決定、器官發(fā)生，既受環(huán)境因子（如光周期、溫度等）的誘導，又受到自身內部因素的調節(jié)，經(jīng)過一系列信號轉導過程，啟動成花決定過程中的控制基因。在復雜的基因互作網(wǎng)絡調控下，營養(yǎng)莖端分生組織（vegetative meristem，VM）轉變?yōu)榛ㄐ蚍稚M織（inflorescence meristem，IM），然后在IM的側翼形成花分生組織（floral meristem，F(xiàn)M），分化出花器官。從擬南芥（Arabidopsis thaliana）中鑒定出了180多個參與調控開花的基因，并確定存在6條調控開花的信號途徑：即光周

52、期途徑（photoperiod pathway）、春化途徑（vernalization pathway）、自主途徑（autonomous pathway）、赤霉素途徑（gibberellin pathway）、溫敏途徑（thermosensory pathway）和年齡途徑（aging pathway）（Fornara et al.，2010）。表觀遺傳是開花信號通路中的重要機制，對開花及花器官發(fā)育產生關鍵調控作用。miRNAs的表觀遺傳調控機制是植物分子發(fā)育生物研究的重要領域，例如miR172、miR156、miR159參與了開花誘導的信號轉導途徑，共同開啟花的發(fā)育過程（圖1）。 6期 李

53、巍等：被子植物開花時間和花器官發(fā)育的表觀遺傳調控研究進展 1253 圖1 擬南芥miRNAs調控成花轉換的分子機制 帶箭頭的直線表示激活作用，帶垂直短線的直線表示抑制作用。 Fig. 1 The molecular mechanisms of miRNAs regulating floral transition in Arabidopsis Lines with arrowheads represent activation，and with perpendicular bars represent repression. 除了miR156、miR172和miR159，還有其他miRNAs在

54、調控植物開花時間上起到重要作用。水稻的miR393靶基因編碼生長素受體OsTIR1和OsAFB2（Xia et al.，2012）。miR393含量增加不僅顯示出對生長素的低敏感性，也可以促進植物開花，證明生長素信號在開花時間的作用。miR399和它的靶基因PHOSPHATE2（PHO2）參與調控植物開花時間（Kim et al.，2011）。在擬南芥中，在常溫23 和16 時，miR399過表達突變體和pho2突變體呈現(xiàn)早花表型，可能是由于TWIN SISTER OF FT（TSF）的大量表達。近年來，組蛋白甲基化對于植物開花時間的調控作用受到更多的關注，Sui等（2013）發(fā)現(xiàn)H3K36甲

55、基化修飾參與了對水稻開花時間的調控。Sun等（2013）通過轉基因手段研究發(fā)現(xiàn)蘋果Md-miRNA156h在生長階段轉變、開花時間、育性及種子萌發(fā)等方面的作用。 目前對植物miRNA等表觀遺傳學的研究主要局限于幾種模式植物，例如擬南芥、矮牽牛、玉米、金魚草等，應該不斷拓寬植物花發(fā)育表觀遺傳學研究的領域，在園藝作物中進行更為深入的研究，了解染色質修飾特征和miRNA表達譜，鑒定與基因表達有關的轉錄因子、調控因子以及維持表觀遺傳狀態(tài)的調控通路，獲取DNA甲基化修飾、組蛋白修飾以及非編碼RNA等信息，幫助研究者更好地理解表觀遺傳學在園藝植物花發(fā)育中的作用機制，并了解這些調控基因表達的表觀遺傳機制如何對細胞分化發(fā)揮調控作用，以期為通過分子生物學手段調控園藝植物花期奠定理論基礎。 References Achard P，Herr A，Baulcombe D C，Harberd N P. 2004. Modulation of floral development by a gibberellin-regulat