甘蔗ROC16的轉(zhuǎn)基因研究

1、甘蔗roc16的轉(zhuǎn)基因研究gene transfer to sugarcane roc16摘 要甘蔗(saccharum officenarum l.)是我國(guó)最主要的糖類(lèi)經(jīng)濟(jì)作物，其生產(chǎn)率的大小將直接影響到蔗農(nóng)的收入和國(guó)民經(jīng)濟(jì)的穩(wěn)定發(fā)展。但是在實(shí)際的甘蔗生產(chǎn)過(guò)程中，各種病蟲(chóng)害的侵害將大大降低甘蔗的產(chǎn)量和品質(zhì)。在眾多的病蟲(chóng)害中，常見(jiàn)的甘蔗害蟲(chóng)是甘蔗螟蟲(chóng)（piatraea saacharalis f.）也是最主要的蟲(chóng)害。本研究在于將修飾的豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（sck）及蘇云金桿菌毒蛋白基因（bt）導(dǎo)入甘蔗roc16種質(zhì)中。探索獲得了農(nóng)桿菌介導(dǎo)roc16轉(zhuǎn)基因研究的相關(guān)科學(xué)數(shù)據(jù)：誘導(dǎo)甘蔗roc16

2、愈傷組織的最佳2，4-d濃度為2.5 mg/l（誘導(dǎo)率為91.7%）介于roc16愈傷組織會(huì)因2，4-d濃度過(guò)高而不易誘導(dǎo)芽分化，在實(shí)際的愈傷誘導(dǎo)中，采用了1 mg/l（誘導(dǎo)率為72.9%）。采用2 mg/l 6-ba+1 mg/l kt+200 mg/l car進(jìn)行芽的高濃度培養(yǎng)基中誘導(dǎo)刺激分化15天，再轉(zhuǎn)入0.5 mg/l 6-ba+0.25 mg/l kt+200 mg/l car的低濃度培養(yǎng)基中15天，最后轉(zhuǎn)入1 mg/l 6-ba+0.5 mg/l kt+200 mg/l car培養(yǎng)基中持續(xù)分化，可解決roc16在常規(guī)濃度下（1 mg/l 6-ba+0.5 mg/l kt+200 m

3、g/l car）難以誘導(dǎo)芽分化問(wèn)題。關(guān)鍵詞：甘蔗；roc16；農(nóng)桿菌；轉(zhuǎn)基因；sck基因；bt基因abstractthe sugar cane is the most main carbohydrate industrial crop in my country, its productivity will directly affect the size of national economic income/stable development , but in actual sugarcane production process, various insect violations w

4、ill greatly reduce the sugarcane yield and quality, in many of the insect pest, common cane cane is stemborer and one of the most important pests. this research is to modify cowpea trypsin inhibitor sck gene and gene roc16 sugarcane bt germplasm.the exploration obtained the agricultural bacillus to

5、lie between leads the roc16 transgene research the related scientific data: induction sugar cane roc16 injuries the organization the best 2,4-d density is 2.5mg/l (inductivity is 91.7%), roc16 between callus because 2,4-d high concentration and easily induced bud points actual injuries in the induct

6、ion, has used 1mg/l (inductivity is 72.9%). using 2mg/l 6 - ba + 1mg/l kt/car on 200mg + high concentrations of bud differentiation medium induced stimulus for 15 days, again into 0.5 mg/l 6 - ba + 0.25 mg/l kt 200mg + / car of low concentration medium for 15 days, finally 1mg/l to 6 - ba + 0.5 mg/l

7、 kt 200mg + / car medium continuous differentiation. roc16 can solve in conventional concentration (1mg/l 6 - ba + 0.5 mg/l kt/car) 200mg + to induce bud differentiation question.but after roc16 genetic transformation to provide the scientific basis.key words: sugarcane, roc16, agrobacterium-mediate

8、d, transgenic, sck gene, bt gene目錄1前言11.1甘蔗概況11.2甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展12材料與方法32.1材料32.1.1植物材料32.1.2菌種和質(zhì)粒32.1.3試劑32.1.4主要儀器設(shè)備32.2方法32.2.1技術(shù)路線32.2.2 cpti基因的修飾42.2.3植物表達(dá)載體的構(gòu)建42.2.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甘蔗42.2.5愈傷組織的獲得和分化53結(jié)果與分析73.1 ms1培養(yǎng)基中2,4-d濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果73.2分化培養(yǎng)結(jié)果73.3轉(zhuǎn)基因抗性植株的篩選84討論94.1外植體的選擇94.2外植體的切割94.3菌液濃度的控制94.4乙酰丁香酮（as）的

9、影響94.5篩選105結(jié)論11參考文獻(xiàn)12致謝13附錄141.前言1.1 甘蔗概況甘蔗(saccharum officenarum l.)屬于禾本科(poaceae)甘蔗屬(saccharum)，生長(zhǎng)于熱帶和亞熱帶地區(qū)。中國(guó)種植甘蔗已有3000多年歷史，是我國(guó)制糖的主要原料。我國(guó)甘蔗種植面積居于世界第三位，僅次于巴西和印度。目前，我國(guó)有359家糖廠，07/08榨季我國(guó)食糖總產(chǎn)量1484.11萬(wàn)噸，其中甘蔗糖廠340家，甘蔗糖為1368萬(wàn)噸，所占比例高達(dá)92.2%。主要分布在廣西、云南、廣東、海南、福建等13個(gè)省區(qū)1。甘蔗中含有豐富的糖分、水分及各種維生素、脂肪、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、鈣、鐵等物質(zhì)，是

10、人們?nèi)粘Ｉ钏夭豢缮俚恼{(diào)味品，同時(shí)也是機(jī)體最重要的供能物質(zhì)。甘蔗除了是重要的制糖原料外，還是重要的能源物質(zhì)，蔗糖可以通過(guò)微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)酒精，也可以通過(guò)化工技術(shù)獲得工業(yè)酒精。隨著石油的快速枯竭，世界各國(guó)都在努力尋找新型可再生能源。因此，采用甘蔗來(lái)生產(chǎn)酒精是可再生的清潔能源物質(zhì)，可以替代石油燃燒，并且不污染環(huán)境。1.2 甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展甘蔗是我國(guó)最主要的糖類(lèi)經(jīng)濟(jì)作物，其生產(chǎn)率的大小將直接影響到蔗農(nóng)的收入和國(guó)民經(jīng)濟(jì)的穩(wěn)定發(fā)展。但是在實(shí)際的甘蔗生產(chǎn)過(guò)程中，各種病蟲(chóng)害的侵害將大大降低甘蔗的產(chǎn)量和品質(zhì)。甘蔗生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)受到鱗翅目和同翅目等多種害蟲(chóng)的危害，在眾多的病蟲(chóng)害中，常見(jiàn)的甘蔗害蟲(chóng)是甘

11、蔗螟蟲(chóng)（piatraea saacharalis f.）?；瘜W(xué)農(nóng)藥防除害蟲(chóng)成本高和環(huán)境污染重。將抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入甘蔗，由其自身合成抗蟲(chóng)或殺蟲(chóng)物質(zhì)防除害蟲(chóng)，特別是針對(duì)能源甘蔗的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因育種，由于不存在食用安全性問(wèn)題，具有重大的經(jīng)濟(jì)與環(huán)境效益2。能獲得真正的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因甘蔗植株，并使抗蟲(chóng)基因能夠高效表達(dá)和穩(wěn)定遺傳。主要用于甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化的抗蟲(chóng)基因由蘇云金桿菌毒蛋白基因(簡(jiǎn)稱bt基因)、蛋白酶抑制劑基因及雪花蓮凝集素(gna)基因。1997年arencibia用電激法將camv35s 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的來(lái)自btkd-1(bacillus thuringiensis var. kurstaki hd-1)的cr

12、yia(b)殺蟲(chóng)毒蛋白基因的2.05 kb n 末端片段轉(zhuǎn)化甘蔗，轉(zhuǎn)基因甘蔗對(duì)小蔗螟幼蟲(chóng)表現(xiàn)出很高的殺蟲(chóng)活性3。1998年arencibia又用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)bt基因植株4。2001年braga等將bt基因轉(zhuǎn)入甘蔗獲得了對(duì)螟蟲(chóng)有抗性的轉(zhuǎn)化植株5。2006年weng用伴隨甘蔗模式密碼子的人工合成cryiac基因(s-cryiac)，在玉米泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，經(jīng)微1彈轟擊導(dǎo)入甘蔗yt79-177和roc16的胚狀體愈傷組織，免疫分析確定有18個(gè)轉(zhuǎn)基因株系表達(dá)s-cryiac，飼喂于其上的蛀莖蟲(chóng)一周內(nèi)全部死亡，而對(duì)照品種的葉莖則遭受?chē)?yán)重蟲(chóng)害5。falco and silva-filco 采用基因

13、槍法將大豆孔尼茲胰島素抑制劑(skti)和包曼-布銳克抑制劑(sbbi)基因在ubi-l啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下導(dǎo)入甘蔗基因組并得到表達(dá)，獲得了可在一定程度上抵抗甘蔗鉆心蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植株，田間抗性不甚理想，鉆心蟲(chóng)仍能對(duì)其產(chǎn)生危害7。2002年setamou等將ubi-gna 導(dǎo)入甘蔗cp65-457 中，在用其葉子喂養(yǎng)墨西哥稻螟的抗蟲(chóng)試驗(yàn)中，幼蟲(chóng)存活率、成蟲(chóng)率、雌蟲(chóng)產(chǎn)卵力均比對(duì)照明顯下降，這表明gna對(duì)墨西哥稻螟的抗性是全面的，但該轉(zhuǎn)基因甘蔗并未從根本上控制害蟲(chóng)的發(fā)生8。國(guó)內(nèi)陳平華等9、長(zhǎng)孫東亭等10利用基因槍法將外源抗蟲(chóng)基因gna導(dǎo)入甘蔗，獲得了一批經(jīng)初步檢測(cè)為陽(yáng)性的再生植株。1998年enriquez

14、-obregon等將攜帶bar基因的c58c1菌株感染甘蔗分生組織切片，獲得10-30的轉(zhuǎn)化率11。1998年arencibia等首次以eha101與甘蔗懸浮培養(yǎng)愈傷組織共培養(yǎng)獲得gus及southern檢測(cè)陽(yáng)性植株4。1998年elliott等用帶有熒光的蛋白(gfp)基因的aglo轉(zhuǎn)化甘蔗胚性愈傷組織獲得gfp表達(dá)及外源基因整合的轉(zhuǎn)化植株12。在我國(guó)，最早用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的是陳如凱13，但其最終只得到含kan的愈傷組織，并未得到苗。王自章等以根癌農(nóng)桿菌eha105菌株介導(dǎo)將海藻糖合酶基因遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗胚性愈傷組織，得到93株抗性植株，經(jīng)檢測(cè)有3株呈陽(yáng)性，這是國(guó)內(nèi)首次獲得轉(zhuǎn)化基因菌株14,15。

15、在國(guó)內(nèi)外的甘蔗相關(guān)轉(zhuǎn)基因研究中，對(duì)于roc22的轉(zhuǎn)基因研究技術(shù)比較成熟，而對(duì)于roc16的研究比較少，并且只做到roc16的愈傷組織誘導(dǎo)。并沒(méi)有較為成熟的roc16轉(zhuǎn)基因技術(shù)，本論文將對(duì)roc16的愈傷組織誘導(dǎo)及芽體的誘導(dǎo)進(jìn)行研究，獲得較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，解決roc16芽體分化較難的問(wèn)題，從而提高轉(zhuǎn)基因率。22.材料與方法2.1 材料2.1.1 植物材料實(shí)驗(yàn)所選用的材料采自云南省農(nóng)科院甘蔗研究所種植的云南主栽品種roc16。已在大田生長(zhǎng)6個(gè)月。2.1.2 菌種和質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌(agrobacterium tumefaciens)菌株lba4404，由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所朱禎實(shí)驗(yàn)室

16、提供。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycin phosphotransferase, hpt)基因hpt為植物選擇標(biāo)記基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體pcdmarusck-hpt，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌lba4404，附kan和str的lb平板培養(yǎng)基上篩選獲得工程菌單菌落。2.1.3 試劑卡那霉素(kan)、乙酰丁香酮(as)、鏈霉素(str)、潮霉素(hyg)、羧芐青霉素(car)、頭孢霉素(cef)等均購(gòu)自云科生物工程公司，6-ba、kt瓊脂糖、低熔點(diǎn)瓊脂糖分別購(gòu)自sigma公司，尼龍膜(nc膜)為lkb公司產(chǎn)品，其它常規(guī)化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?.1.4 主要儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)、光照培養(yǎng)箱、-20低溫冰箱

17、(siemens)、立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽鍋、高壓滅菌鍋、紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)、dna和rna電泳設(shè)備、人工氣候箱、恒溫?fù)u床、電子天平、顯微鏡、電磁爐、大型臺(tái)式冷凍離心機(jī)等。2.2 方法2.2.1 技術(shù)路線 首先甘蔗胚性愈傷組織的獲得，其次農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甘蔗胚性愈傷組織，再次是轉(zhuǎn)化植株(誘導(dǎo)分化)培養(yǎng)，最后是轉(zhuǎn)化子的篩選和培養(yǎng)。.2.2 cpti基因的修飾 cpti 基因作為外源基因表達(dá)時(shí)，在胞漿中易受其他類(lèi)型蛋白酶的作用而降解 。為提高植物抗蟲(chóng)水平，采用三引物pcr技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位修飾,在cpti基因5末端和3末端增加了信號(hào)肽和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的編碼序列，獲得了修飾基因sck 。修飾的cpt

18、i蛋白在n端加了25個(gè)氨基酸的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)，c端加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)kdel。在轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞內(nèi)，n端的信號(hào)肽序列可以將新3材料與方法合成的抗蟲(chóng)融合蛋白引入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，信號(hào)肽被細(xì)胞內(nèi)的識(shí)別機(jī)制識(shí)別并被切除。外源抗蟲(chóng)蛋白(cpti)被雙層脂質(zhì)膜包裹，處于細(xì)胞的惰性環(huán)境中，避免了在細(xì)胞胞漿中快速降解 。2.2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建該載體（圖1）在兩個(gè)mar序列之間連上了一個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的sck基因和bt基因由玉米泛素啟動(dòng)子啟動(dòng)。圖1. 農(nóng)桿菌中所含的表達(dá)載體示意圖2.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甘蔗采集甘蔗時(shí)，最佳的時(shí)期是6-8月，部位為幼嫩葉鞘16。采集好后，剝?nèi)ネ獠咳~片，用75%的酒精擦拭表面，在無(wú)

19、菌條件下剝?nèi)ネ鈱樱羧∮啄廴~鞘，切成薄片狀，接于ms1培養(yǎng)基上：ms+2,4-d1 mol/l+蔗糖30 g/l+瓊脂7 g/l+活性炭0.5 g/l ph 5.8，置于散射光下，26-28培養(yǎng)20-25天。外植體培養(yǎng)采用梯度試驗(yàn)選擇出最佳誘導(dǎo)濃度，2,4-d濃度梯度設(shè)置40.5、1、1.5、2和2.5 mg/l 5個(gè)梯度。每個(gè)處理18片左右外植體，重復(fù)3皿。然后計(jì)算5個(gè)濃度下roc16愈傷組織的生長(zhǎng)率和褐化率，計(jì)算公式：生長(zhǎng)率= 長(zhǎng)出胚性愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)100%。2.2.5 愈傷組織的獲得和分化將得到的胚性愈傷組織挑出后，轉(zhuǎn)移到活化培養(yǎng)基上：ms+2, 4-d 1 mol/l

20、+蔗糖30 g/l+瓊脂7 g/l ph5.8，28活化培養(yǎng)4天左右，取出后，在無(wú)菌條件下進(jìn)行吹干處理。挑取單孢農(nóng)桿菌至yep液體培養(yǎng)基中，添加kan(50 mg/l)和str(25 mg/l)，于兩天前28黑暗條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)100ml錐形瓶菌體，檢測(cè)檢測(cè)yep培養(yǎng)基在od600條件下的菌液濃度為0.614，接著吸取1ml轉(zhuǎn)搖到8個(gè)錐形瓶含有200 ml的yep培養(yǎng)基中約18h，在od600條件下的菌液濃度分別為0.414、0.386、0.442、0.412、0.498、0.470、0.503和0.476。取出菌液于離心管中，5000 rpm，離心5分鐘，棄上清，將沉淀重懸于

21、等體積的添加了200 mol/las的mr液體培養(yǎng)基中：1/5ms大量元素+ms其它成分+2, 4-d1 mg/l+l0 mmol/l果糖+10 mmol/l葡萄糖+30 g/l蔗糖ph5.3，侵染已經(jīng)在超凈臺(tái)中做過(guò)吹干處理的愈傷組織。侵染時(shí)間設(shè)定為30 min。侵染后用漏勺濾去菌液于超凈臺(tái)上晾干30分鐘左右，轉(zhuǎn)至含有200 mol/las的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上：ms+2, 4-d1 mol/l+蔗糖30 g/l+瓊脂7 g/l ph5.8，21暗培養(yǎng)4天左右后轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基中：ms+6-ba1 mg/l+kt0.5 mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂7 mg/l ph5.8，抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的同時(shí)誘導(dǎo)芽

22、的分化，在分化培養(yǎng)基中，添加了car500 mg/l。28光下培養(yǎng)，三周左右浸染過(guò)的胚性愈傷組織便能分化出小苗，期間需要經(jīng)常剔除褐化和被農(nóng)桿菌嚴(yán)重污染的組織塊。由于roc16愈傷組織會(huì)因2，4-d濃度過(guò)高而不易誘導(dǎo)芽分化，一直采用1mg/l 6-ba+0.5 mg/l kt+200 mg/l car培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，無(wú)法使其分化出芽。于是進(jìn)行以下試驗(yàn)設(shè)計(jì)：先采用2 mg/l 6-ba+1 mg/l kt+200 mg/l car進(jìn)行芽的高濃度培養(yǎng)基中誘導(dǎo)刺激分化15天，再轉(zhuǎn)入0.5 mg/l 6-ba+0.25 mg/l kt+200 mg/l car的低濃度培養(yǎng)基中15天，最后轉(zhuǎn)入1

23、mg/l 6-ba+0.5 mg/l kt+200mg/l car培養(yǎng)基中持續(xù)分化。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組3皿，每皿誘導(dǎo)愈傷組織20枚。并且用持續(xù)使用1mg/l 6-ba+0.5mg/l kt+200mg/l car培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)5材料與方法作為對(duì)照。設(shè)置對(duì)照組3皿，每皿誘導(dǎo)愈傷組織20枚。本實(shí)驗(yàn)采用的是獲得小苗后再進(jìn)行潮霉素篩選，即小苗長(zhǎng)到3-4 cm高時(shí)，在超凈臺(tái)內(nèi)選取分化較好、生長(zhǎng)健壯的甘蔗分化苗進(jìn)行分株，于抗性篩選培養(yǎng)基：ms+6-ba1 mg/l+蔗糖30 g/l+瓊脂7 mg/l ph 5.8內(nèi)篩選，培養(yǎng)基中添加濃度為50 mg/l的潮霉素。置于28培養(yǎng)室中培養(yǎng)。63.結(jié)果與分析3.1

24、 ms1培養(yǎng)基中2,4-d濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果從5個(gè)濃度的2,4-d梯度中，分別挑選一皿愈傷組織來(lái)作比較。圖2反映的是處于5個(gè)梯度中的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)情況。圖2. 不同濃度2，4-d誘導(dǎo)roc16愈傷組織照片a. 0.5 mg/ l；b. 1 mg/ l；c. 1.5 mg/ l；d. 2 mg/ l；e. 2.5 mg/ l表1不同2,4-d濃度誘導(dǎo)愈傷組織統(tǒng)計(jì)結(jié)果處理外植體數(shù)2,4-d濃度(mg/l)愈傷組織數(shù)生長(zhǎng)率(%)平均生長(zhǎng)率(%)褐化數(shù)褐化率(%)平均褐化率(%)1616160.576443.837.525.035.49101256.362.57564.51616161.010121362

25、.575.081.272.964337.52518.827.11616161.511121468.875.087.577.154231.22512.522.9iv1616162.012141175.087.568.877.14252512.531.222.9v1616162.514141687.587.510091.722012.512.508.3在誘導(dǎo)甘蔗胚性愈傷組織時(shí)，我們通常采用的激素是2，4-d。不同濃度的2，4-d對(duì)甘蔗胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率是不同的。在探索誘導(dǎo)roc16的愈傷組織時(shí)，我們不僅要獲得較高的誘導(dǎo)率外，還要考慮濃度過(guò)高后會(huì)導(dǎo)致芽體誘導(dǎo)分化困難的問(wèn)題。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中誘導(dǎo)甘蔗ro

26、c16愈傷組織的最佳2，4-d濃度為2.5mg/l（誘導(dǎo)率為91.7%），為避免芽體誘導(dǎo)分化困難，在實(shí)際的愈傷誘導(dǎo)中，采用了1 mg/l（誘導(dǎo)率為72.9%）。3.2 分化培養(yǎng)結(jié)果介于roc16在1 mg/l 6-ba+0.5 mg/l kt+200 mg/l car的分化培養(yǎng)基中持續(xù)7結(jié)果與分析分化30 d后，并無(wú)分化跡象，愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)越來(lái)越多，未見(jiàn)分化出芽體。所以改用高低中濃度的分化培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行誘導(dǎo)分化。表2 roc16芽體誘導(dǎo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果處理愈傷組織數(shù)分化出芽體愈傷數(shù)分化率(%)平均分化率(%)高低中18181817161494.488.977.887.0*中等濃7

27、5.633.318.5注：“*” 為極顯著（p0.01）通過(guò)做成組數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)，由表2可以看出在中等濃度的分化培養(yǎng)基中持續(xù)分化的平均分化率相當(dāng)?shù)?，而在高低中濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行高低濃度誘導(dǎo)培養(yǎng)，可以極顯著提高平均分化率。而且由實(shí)驗(yàn)證明，在進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的roc16轉(zhuǎn)基因過(guò)程中，使用該方法可以提高分化率。3.3 轉(zhuǎn)基因抗性植株的篩選將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因和高低中濃度誘導(dǎo)后，獲得了一些甘蔗小苗和還在分化的芽體，將已經(jīng)分化出的小苗挑選出來(lái)接入到壯苗培養(yǎng)基中壯苗，而把仍舊在分化的芽體繼續(xù)轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過(guò)壯苗培養(yǎng)后，獲得比較健壯的roc16甘蔗小苗169株，接入到含有50mg/l的潮霉素篩選培養(yǎng)基中篩選（

28、圖3）。在對(duì)照組中，未經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因過(guò)程的小苗處于50mg/ l的潮霉素中時(shí)已經(jīng)全部褐化，實(shí)驗(yàn)組還有小部分還在繼續(xù)生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)篩選后存活的小苗將做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)鑒定。圖3.抗性植株的潮霉素篩選 a對(duì)照組 b實(shí)驗(yàn)組84. 討論4.1 外植體的選擇甘蔗幼嫩葉鞘是分化頻率較高的部位。最佳的采集時(shí)期是6-8月，大于8個(gè)月之后的材料就會(huì)太老，盡量不要作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體。因?yàn)檫@樣誘導(dǎo)的愈傷組織活性不高，愈傷組織周?chē)鷷?huì)產(chǎn)生一圈褐化帶，容易在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中死亡或不分化，從而降低了誘導(dǎo)率。本研究所使用的甘蔗外植體只在最初采集時(shí)用酒精擦拭表面，剝離后并未用升汞或者酒精消毒，操作簡(jiǎn)單，污染率低，誘導(dǎo)出的愈傷長(zhǎng)勢(shì)較好，生

29、長(zhǎng)率較高。4.2 外植體的切割取甘蔗幼嫩葉鞘用刀片切割后誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，所切外植體要足夠薄并且一定要完整，這樣既可以節(jié)省材料，又容易誘導(dǎo)出愈傷組織。在超凈臺(tái)上切割時(shí)動(dòng)作要快，將外植體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中時(shí)動(dòng)作也要快，避免外植體被吹干及污染，造成浪費(fèi)及影響誘導(dǎo)率。在實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)因?yàn)樗械耐庵搀w厚度不一而影響分化率。也會(huì)因?yàn)榍械牟煌暾黾雍只省?.3 菌液濃度的控制在制備農(nóng)桿菌菌液時(shí)把握好培養(yǎng)時(shí)間非常重要，在接近所需濃度時(shí)，應(yīng)該提前進(jìn)行濃度測(cè)驗(yàn)，避免超高。菌液濃度過(guò)低或過(guò)高都不利于侵染，菌液濃度過(guò)低，證明農(nóng)桿菌量不足，侵染時(shí)農(nóng)桿菌附著在植物細(xì)胞上的數(shù)量就少，影響轉(zhuǎn)化效率；農(nóng)桿菌濃度過(guò)高，由于菌的毒害作用

30、或生長(zhǎng)過(guò)快等導(dǎo)致植物材料的壞死，從而也降低了轉(zhuǎn)化效率。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)要準(zhǔn)確控制好菌液濃度是非常困難的，其影響菌液濃度的因素實(shí)在太多，就是同一濃度的菌液轉(zhuǎn)搖到同等體積的相同培養(yǎng)基中，在相同時(shí)間的轉(zhuǎn)搖過(guò)程后，所獲得的菌液濃度也會(huì)出入很大。4.4乙酰丁香酮（as）的影響as對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能力有明顯的影響，可增加農(nóng)桿菌在培養(yǎng)植物細(xì)胞的附著，提高轉(zhuǎn)化效率。不加入as的農(nóng)桿菌侵染液，其轉(zhuǎn)化率幾乎為零，可見(jiàn)as對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響是相當(dāng)大的。as主要是可以誘導(dǎo)農(nóng)桿菌vir基因的活化，進(jìn)一步激活vir區(qū)基因的表達(dá)，vir基因的表達(dá)控制著t-dna的轉(zhuǎn)移。在轉(zhuǎn)化中添加乙酰丁香酮是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)化率提高的至關(guān)重要

31、的因素。但是我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，添加as對(duì)于進(jìn)行轉(zhuǎn)化的愈傷組織也有一定的毒害作用，加入后會(huì)增加愈傷組織的褐化率，也會(huì)影響分化。 9討論4.5 篩選抗性植株的篩選可以分為兩種。一種是在誘導(dǎo)芽體的分化培養(yǎng)基中就開(kāi)始加入潮霉素，直到篩選出抗性苗。這種方法效率比較高，工作量小，費(fèi)用昂貴。另一種是在誘導(dǎo)出苗后才加入潮霉素進(jìn)行篩選。此方法工作量大，所需費(fèi)用少。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在做roc16的轉(zhuǎn)基因研究時(shí)，為了要保證愈傷組織能誘導(dǎo)出更多的小苗，可以降低2，4-d的濃度，尋找0.5 mg/l-1 mg/l之間的適當(dāng)值作為誘導(dǎo)參數(shù)。這樣降低了2，4-d在愈傷組織塊中的含量，可以使芽體分化率提高，但是降低

32、了愈傷組織的芽體誘導(dǎo)率。當(dāng)然，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法也存在一些不足之處，最大的問(wèn)題是農(nóng)桿菌對(duì)單子葉植物特別是禾本科植物不敏感，從而限制了它的適用范圍。同時(shí)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化能否取得成功對(duì)基因型的依賴性也比較強(qiáng)。由于農(nóng)桿菌是一個(gè)生物有機(jī)體，因此其功能受環(huán)境及其作用對(duì)象的影響要比其它理化方法復(fù)雜得多。105.結(jié)論在本實(shí)驗(yàn)中，使用不同濃度的2，4-d進(jìn)行roc16愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中，獲得的最佳2，4-d濃度為2.5 mg/l（誘導(dǎo)率為91.7%）。但是選用高濃度的2,4-d會(huì)使愈傷組織中含有過(guò)多的2，4-d，將不利于后期芽體的誘導(dǎo)分化。選用2，4-d濃度為1 mg/l（誘導(dǎo)率為72.9%），雖然誘導(dǎo)率不高，

33、但是便于后期芽體分化，適合作roc16的轉(zhuǎn)基因研究愈傷誘導(dǎo)濃度。在誘導(dǎo)roc16芽體分化的試驗(yàn)中，采用高濃度（2 mg/l 6-ba+1 mg/l kt+200 mg/l car）低濃度（0.5 mg/l 6-ba+0.25 mg/l kt+200 mg/l car）中濃度（1 mg/l 6-ba+0.5 mg/l kt+200 mg/l car）的激素誘導(dǎo)時(shí)，roc16愈傷組織芽體分化率為87%，比對(duì)照組分化率18.5%高出68.5%?？梢约帮@著地提高甘蔗roc16芽體誘導(dǎo)分化率。11參考文獻(xiàn)1 周普國(guó),中國(guó)蔗糖業(yè)生產(chǎn)與發(fā)展策略.中國(guó)糖網(wǎng).2005,2(6):12-152 張顯勇,楊本鵬,張

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