濕態(tài)三角褐指藻UTEX640中大規(guī)模提取十二碳五烯酸(EPA)的研究ppt課件

1、Page 1LOGOE. Molina Grima, A. Robles Medina*, A. Gimnez Gimnez & M. J. Ibnez Gonzlez濕態(tài)三角褐指藻濕態(tài)三角褐指藻UTEX 640中大規(guī)模中大規(guī)模提取十二碳五烯酸提取十二碳五烯酸(EPA)的研討的研討組長：葛鵬鵬組長：葛鵬鵬文獻：帖航文獻：帖航翻譯：張軒昂，劉巖，張強利翻譯：張軒昂，劉巖，張強利PPT：賈冬冬：賈冬冬主講：李正浩主講：李正浩EPA即全順式即全順式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸是一種多不飽和脂二十碳五烯酸是一種多不飽和脂肪酸，屬于肪酸，屬于-3族多烯長鏈脂肪酸，無色，無味，常溫下以液態(tài)方族

2、多烯長鏈脂肪酸，無色，無味，常溫下以液態(tài)方式存在，易溶于有機溶劑。具有重要的生物學功能，在預防和治式存在，易溶于有機溶劑。具有重要的生物學功能，在預防和治療人類的心腦血管疾病、抗腫瘤、抑制肥胖、抗炎癥等方面具有療人類的心腦血管疾病、抗腫瘤、抑制肥胖、抗炎癥等方面具有重要的作用。重要的作用。三角褐指藻常見的外形有卵形，梭形和三出放射形，這三種外形三角褐指藻常見的外形有卵形，梭形和三出放射形，這三種外形在不同的生長環(huán)境下可以相互轉(zhuǎn)變。三角褐指藻的生長條件：在不同的生長環(huán)境下可以相互轉(zhuǎn)變。三角褐指藻的生長條件：1三角褐指藻對鹽度的順應(yīng)范圍很廣三角褐指藻對鹽度的順應(yīng)范圍很廣0.9-9.2%，最適鹽度為

3、，最適鹽度為2.5-3.2%。2最適溫度為最適溫度為10-20。3順應(yīng)的光照強度為順應(yīng)的光照強度為1000-8000lx。4在在pH值值7-10的環(huán)境下均能繁衍生長。的環(huán)境下均能繁衍生長。 采用以下三個步驟從三角褐指藻中提取多不飽和脂肪酸采用以下三個步驟從三角褐指藻中提取多不飽和脂肪酸EPA,20：5n-3：從濕態(tài)藻泥中直接皂化并提取脂肪酸，多不飽和脂肪酸：從濕態(tài)藻泥中直接皂化并提取脂肪酸，多不飽和脂肪酸PUFA的濃縮，高效液相色譜分別的濃縮，高效液相色譜分別EPA。濕態(tài)藻泥的直接皂化運用。濕態(tài)藻泥的直接皂化運用KOH乙醇乙醇96%，v:v溶液溶液1h，60，可以提取純度為，可以提取純度為91

4、%的的EPA。多不。多不飽和脂肪酸運用尿素飽和脂肪酸運用尿素甲醇溶液進展包埋，尿素與脂肪酸的比例為甲醇溶液進展包埋，尿素與脂肪酸的比例為4:1，28結(jié)晶，濃縮率可到達結(jié)晶，濃縮率可到達1.555.2/36.3，EPA的回收率為的回收率為79%。經(jīng)。經(jīng)過液相色譜純化的過液相色譜純化的EPA純度可到達純度可到達95.8%，運用反相色譜柱，運用反相色譜柱C18，內(nèi)，內(nèi)徑徑4.7cm x 30cm，流動相為甲醇，流動相為甲醇水水1%，AcH80:20w/w，高，高效液相色譜可回收上樣液中效液相色譜可回收上樣液中97%的的EPA。經(jīng)過這三個下游過程可回收三。經(jīng)過這三個下游過程可回收三角褐指藻中角褐指藻中

5、70%的的EPA。最后，對。最后，對EPA的投產(chǎn)進展了投資預算，一次高的投產(chǎn)進展了投資預算，一次高效液相色譜上樣效液相色譜上樣635mg的多不飽和脂肪酸可以純化出的多不飽和脂肪酸可以純化出326mg高度純化高度純化的的EPA2.46gd-1。 -3家族的多不飽和脂肪酸家族的多不飽和脂肪酸EPA20:5n-3具有重要的生物學功能，在預防和治療人具有重要的生物學功能，在預防和治療人類的心腦血管疾病、抗腫瘤、抑制肥胖、抗炎癥等方面具有重要的作用，因此類的心腦血管疾病、抗腫瘤、抑制肥胖、抗炎癥等方面具有重要的作用，因此EPA越來越越來越遭到人們的關(guān)注。遭到人們的關(guān)注。 制藥和臨床運用需求大量的高純度多

6、不飽和脂肪酸，但是目前，消費的高純度的營養(yǎng)制藥和臨床運用需求大量的高純度多不飽和脂肪酸，但是目前，消費的高純度的營養(yǎng)價值高不飽和脂肪酸還不能滿足臨床運用，這嚴重妨礙了價值高不飽和脂肪酸還不能滿足臨床運用，這嚴重妨礙了-3系類的多不飽和脂肪酸在預系類的多不飽和脂肪酸在預防和治療疾病中實驗調(diào)查。因此，快速可靠的不飽和脂肪酸提純方法被迫切的需求。防和治療疾病中實驗調(diào)查。因此，快速可靠的不飽和脂肪酸提純方法被迫切的需求。 許多的微澡中富含多種多不飽和脂肪酸。他們商業(yè)化消費脂肪酸與魚甘油做脂肪酸的許多的微澡中富含多種多不飽和脂肪酸。他們商業(yè)化消費脂肪酸與魚甘油做脂肪酸的來源相比的優(yōu)勢在于，藻類可以利用一

7、個低價值的可控的消費過程來提高細胞內(nèi)具有生物來源相比的優(yōu)勢在于，藻類可以利用一個低價值的可控的消費過程來提高細胞內(nèi)具有生物活性脂肪酸的含量。三角褐指藻由于它生長迅速，所以它是活性脂肪酸的含量。三角褐指藻由于它生長迅速，所以它是EPA的理想來源。戶外管道式的理想來源。戶外管道式光合反響器每天可消費光合反響器每天可消費EPA47.8 mgd- lL- l。還有一個額外的優(yōu)勢是。還有一個額外的優(yōu)勢是 二十二碳六烯酸和二十二碳六烯酸和花生四烯酸含量少，甚至可以忽略不計，這個重要的優(yōu)勢可以簡化花生四烯酸含量少，甚至可以忽略不計，這個重要的優(yōu)勢可以簡化EPA回收的過程?；厥盏倪^程。 有關(guān)于從微澡中提取有關(guān)

8、于從微澡中提取EPA的研討，發(fā)表的很少。的研討，發(fā)表的很少。Cohen和和Cohen (1991)從紫球藻中獲從紫球藻中獲取取EPA的用了五個步驟：脂質(zhì)提?。惶侵c磷脂的分別，糖脂類部分的甲酯化；尿素包埋的用了五個步驟：脂質(zhì)提?。惶侵c磷脂的分別，糖脂類部分的甲酯化；尿素包埋法吸附甲基酯脂肪酸；常壓反相色譜法分別。法吸附甲基酯脂肪酸；常壓反相色譜法分別。Cohen等人用其類似的一種方法從藍綠螺旋等人用其類似的一種方法從藍綠螺旋藻中提取出了純度為藻中提取出了純度為90%-亞麻酸。亞麻酸。 本文作者以前開發(fā)了一種從海洋等鞭金藻和三角褐藻中三步分別高純度提取本文作者以前開發(fā)了一種從海洋等鞭金藻和三角

9、褐藻中三步分別高純度提取EPA的方的方法。三步分別是法。三步分別是1從直接皂化的凍干生物質(zhì)中提取脂肪酸；從直接皂化的凍干生物質(zhì)中提取脂肪酸；2尿素包埋法分別多不尿素包埋法分別多不飽和脂肪酸；飽和脂肪酸；3經(jīng)過高效液相色譜法半制備分別多不飽和脂肪酸。這文研討的是用三經(jīng)過高效液相色譜法半制備分別多不飽和脂肪酸。這文研討的是用三步分別法從三角褐指藻中提取步分別法從三角褐指藻中提取EPA，另外，本文試圖研討了擴展利用高效液相色譜法制備，另外，本文試圖研討了擴展利用高效液相色譜法制備EPA的產(chǎn)量。的產(chǎn)量。運用戶外管道式光合反響器運用戶外管道式光合反響器(200L培育三角褐指藻稀釋率為培育三角褐指藻稀釋率

10、為0.04h-1，收獲時收獲時4000rmp，-18離心。藻泥中含有離心。藻泥中含有20.91.3的干藻粉，平均總脂的干藻粉，平均總脂肪酸含量為肪酸含量為9.4。480g藻泥藻泥100g干藻粉干藻粉+160gKOH+96乙醇乙醇：干藻粉乙醇乙醇：干藻粉=1495mlg-1氮氣維護氮氣維護 60攪拌浸提攪拌浸提1h以破碎細胞以破碎細胞 過濾，濾渣用過濾，濾渣用2L乙醇乙醇96%洗滌兩次洗滌兩次 上清上清+2L水，用水，用4L正己烷分五次萃正己烷分五次萃取去除不可皂化物質(zhì)有機相取去除不可皂化物質(zhì)有機相加加2L正己烷分八次萃取回正己烷分八次萃取回收游離脂肪酸收游離脂肪酸 HCl1:1將水相將水相pH

11、調(diào)至調(diào)至1.0 Ethanol/dry和Ethanol/wet換算參照Bligh 和Dyers 實驗方案 將將25g游離脂肪酸加到熱的脲素甲醇溶液游離脂肪酸加到熱的脲素甲醇溶液 65-70 ，100g脲素，脲素，267mL甲醇中，在甲醇中，在65-70下攪拌溶解直至清澈，所得溶液下攪拌溶解直至清澈，所得溶液28過夜結(jié)晶，過夜結(jié)晶，過濾除去結(jié)晶。過濾除去結(jié)晶。色譜柱：色譜柱：半制備：半制備：Beckman Ultrasphere RP色譜柱填料色譜柱填料C18，5m，孔徑，孔徑 8nm，柱內(nèi)徑，柱內(nèi)徑1 cm x 25 cm 制備級：制備級：Waters Bondapak RP色譜柱填料色譜柱填

12、料C18，37-55m，孔徑，孔徑 12.5nm，柱內(nèi)徑，柱內(nèi)徑4.7 cm x 30 cm 儀器：儀器：Waters HPLC 3000液相色譜儀液相色譜儀 Milton Roy 3000光電二級管陣列檢測器光電二級管陣列檢測器 洗脫液：等度洗脫，甲醇洗脫液：等度洗脫，甲醇水水1%AcH80:20w/w 。一切試劑均為色譜級，水用。一切試劑均為色譜級，水用 Millin-Q系統(tǒng)純化，其他溶劑用系統(tǒng)純化，其他溶劑用0.2m微孔濾膜過濾，運用前進展除氣微孔濾膜過濾，運用前進展除氣 。流速：半制備流速：半制備30ml/min 制備級制備級60ml/min其他：甲醇其他：甲醇水溶液分配比先于脂肪酸在

13、真空蒸發(fā)室中進展分析，洗脫出的組分與水溶液分配比先于脂肪酸在真空蒸發(fā)室中進展分析，洗脫出的組分與 Sigma公司的規(guī)范品進展紫外光譜對照，以防止由于降解產(chǎn)生的共軛雙鍵。公司的規(guī)范品進展紫外光譜對照，以防止由于降解產(chǎn)生的共軛雙鍵。分別對藻種、皂化萃取出的液體、尿素包埋的結(jié)晶和高分別對藻種、皂化萃取出的液體、尿素包埋的結(jié)晶和高效液相色譜得到的餾分進展氣相色譜分析，確定脂肪酸效液相色譜得到的餾分進展氣相色譜分析，確定脂肪酸的純度和產(chǎn)率。進展氣相色譜分析前，先將脂肪酸甲酯的純度和產(chǎn)率。進展氣相色譜分析前，先將脂肪酸甲酯化。以下的脂肪酸需求被思索到脂肪酸產(chǎn)率的計算中：化。以下的脂肪酸需求被思索到脂肪酸產(chǎn)

14、率的計算中：14:0，16:0，16:1n-7，16:2n-4，16:3n-4，16:4n-1，18:0，18:1n-7，18:1n-9，18:2n-6，18:3n-3，18:4n-3，22:0，20:4n-6，20:4n-3，20:5n-3，24:0 和和22:6n-3。半制備高效液相色譜半制備高效液相色譜的餾分分析的餾分分析制備高效液相色譜的餾制備高效液相色譜的餾分分析分分析純化出的純化出的EPA與與EPA規(guī)范品進展紫外光譜規(guī)范品進展紫外光譜對照，檢測能否發(fā)生對照，檢測能否發(fā)生降解降解 EPA Sigma patternEPA fraction 本文的目的之一是提供一種從三角褐指藻中分別高

15、本文的目的之一是提供一種從三角褐指藻中分別高純度純度EPA的下游技術(shù)，來試圖擴展商業(yè)化消費的下游技術(shù)，來試圖擴展商業(yè)化消費EPA的產(chǎn)的產(chǎn)量。目前，本文的數(shù)據(jù)足以證明本研討方案可以用于如量。目前，本文的數(shù)據(jù)足以證明本研討方案可以用于如此復雜的消費系統(tǒng)中。假設(shè)運用一樣的設(shè)設(shè)備，每天的此復雜的消費系統(tǒng)中。假設(shè)運用一樣的設(shè)設(shè)備，每天的EPA產(chǎn)量可到達產(chǎn)量可到達2.46克。以表克。以表6的數(shù)據(jù)為根據(jù)，從三角的數(shù)據(jù)為根據(jù)，從三角褐指藻中每提取褐指藻中每提取1克克EPA，每天的破費預算為，每天的破費預算為188美金，美金，比從魚肝油中提取比從魚肝油中提取EPA廉價兩倍，即使魚甘油的價錢曾廉價兩倍，即使魚甘油的價錢曾經(jīng)很廉價。需求指出的是，假設(shè)消費的規(guī)模超出了實驗經(jīng)很廉價。需求指出的是，假設(shè)消費的規(guī)模超出了實驗中設(shè)定的消費規(guī)模，那么