家兔尿生成的因素及腎缺血再灌注損傷初探

1、家兔尿生成的因素及腎缺血再灌注損傷初探 (南方醫(yī)科大學第二臨床學院10級臨床醫(yī)學)摘要： 目的：強化頸動、靜脈，輸尿管插管技術和家兔腎缺血再灌注損傷模型的復制方法，加深理解尿生成的機理及腎排泄功能的重要意義，熟悉缺血再灌注損傷的機制及其基本實驗方法。 方法：21組家兔麻醉后分別行頸靜、動脈插管術和輸尿管插管術，在靜脈補充37的生理鹽水15min后、補充20%的高滲葡萄糖15min后、夾閉左腎動脈15min并再灌注15min后，生理鹽水、生理鹽水+速尿、生理鹽水+高滲葡萄糖按組別分別搶救15min后，分別觀測平均動脈壓，尿量。并測定再灌注及治療后尿肌酐、血肌酐濃度及內生肌酐清除率（ccr）；結果

2、：補充生理鹽水和高滲葡萄糖后血壓，尿生成量均增加，夾閉左腎動脈并再灌后各值均降低，生理鹽水治療可使血壓回升，尿生成量和ccr略回升，生理鹽水+速尿治療可使各項參數均回升，生理鹽水+高滲葡萄糖治療各項參數均回升但不顯著。結論：增加血容量和升高血漿滲透壓均可使血壓、尿生成量增加，缺血再灌注后血壓下降、腎排泄能力降低、內生肌酐清除率降低，速尿治療后可糾正此變化，生理鹽水和高滲葡萄糖僅能糾正血壓及部分糾正恢復腎功能。關鍵詞：腎 尿生成 內生肌酐清除率 缺血再灌注腎臟是機體內環(huán)境的穩(wěn)定，使新陳代謝得以正常進行的重要器官。腎功能探究實驗一直是各大高校培養(yǎng)醫(yī)學生過程中的重點實驗。其意義在于使醫(yī)學生通過實際操

3、作，了解各種因素下腎功能的改變及其機制。腎缺血再灌注損傷是指腎組織缺血時和其后恢復血液灌注時器官功能不能恢復正常，甚至發(fā)生更為嚴重的組織損傷或器官功能衰竭。腎臟由于其組織結構和功能的特殊性，是對缺血再灌注損傷敏感的器官之一。腎缺血再灌注損傷是急性腎功能衰竭的主要原因之一，也是移植排斥反應，尤其是慢性排斥反應的重要原因1，探究它的機制對醫(yī)學生有重要意義。而對內生肌酐清除率（ccr）的測定可了解腎小球的功能，因此，本實驗通過給家兔生理鹽水、高滲葡萄糖、制造腎缺血再灌注模型并予以三種不同的搶救等，并對各情況下家兔腎功能情況進行測定，以培養(yǎng)醫(yī)學生動手能力及對腎功能、缺血再灌注機制和意義的理解。1 材料

4、與方法1.1材料：1.1.1主要試劑與儀器：20%烏拉坦，0.2%肝素，生理鹽水，20%葡萄糖溶液，蒸餾水，速尿劑，肌酐測定試劑（含試劑一、試劑三、試劑四）。醫(yī)用計算機記錄系統(tǒng)（pclab）及計算機，家兔手術臺，哺乳動物手術器械，動脈、靜脈及輸尿管插管，動脈夾，壓力換能器，三通管，注射器，兔繩，紗布，剪刀，分光光度計，恒溫水浴箱，試管，微量加樣槍帶槍頭，稱重稱。1.1.2 實驗動物: 家兔，體重約2.2kg，由南方醫(yī)科大學提供。1.2 方法：（進行21組實驗，每組均按下述方法進行）1.2.1 前期準備家兔稱重2.2kg，用20%烏拉坦11ml(5ml/kg)耳緣靜脈麻醉，麻醉后將家兔仰臥位固定

5、于手術臺。家兔頸部、左腎區(qū)、恥骨聯(lián)合上部分別備皮。沿甲狀軟骨下正中依次剪開皮膚、淺筋膜，鈍性分離右側頸外靜脈并插管。沿胸鎖乳頭肌和胸骨舌骨肌間隙鈍性分離，并在氣管正中鈍性分離頸闊肌，游離左頸動脈并插入肝素充盈的動脈插管，連接壓力換能器以記錄平均動脈壓abp。家兔恥骨下聯(lián)合上約三橫指處沿前正中線（腹白線）剪開皮膚、淺筋膜，于膀胱左側輸尿管并進行輸尿管插管并用有刻度的試管收集尿液。1.2.2 研究尿生成過程影響因素靜脈推注37，30ml生理鹽水，用有刻度的試管收集尿液并計算注射后每分鐘尿量（ml/分鐘）；一段時間后靜脈輸入37，10ml 20%葡萄糖溶液，用有刻度的試管收集尿液并計算注射后每分鐘尿

6、量。收集的尿液待測尿肌酐含量。1.2.3 腎缺血再灌注損傷的實驗于左腎區(qū)切開皮膚、淺筋膜，找出左腎并游離左腎動脈，用動脈夾夾閉，夾閉15min后觀測平均動脈壓和尿量變化。松開動脈夾，再灌注，再次觀測平均動脈壓和尿量變化。15min后，17組采取搶救方案一（于頸靜脈插管輸入37、20ml 生理鹽水），814組采取搶救方案二（于頸靜脈插管輸入37、19ml 生理鹽水及速尿1ml），1421組采取搶救方案三（于頸靜脈插管輸入37、10ml 生理鹽水及20%葡萄糖溶液10ml）分別進行搶救，搶救15min后取尿測定尿肌酐濃度，記錄平均動脈壓和尿量變化并收集尿液待測尿肌酐含量。1.2.4尿肌酐測定方法取

7、尿液10l與2ml蒸餾水按1：200比例稀釋，按下表分別加入樣品及不同試劑于各管，37 10min水浴，以蒸餾水調零， 測510 nm處分光光度值并按以下公式計算尿肌酐。尿肌酐(mmol/l) = （測定管od - 空白管od）/ （標準管od 空白管od ）x標準品濃度（10umol/l） x 201倍表1 尿肌酐測定加樣量表試管標準管測定管調零管空白管稀釋后尿液（ml）01.600試劑一(cr標準品)（ml）1.6000蒸餾水（ml）002.61.6試劑三（ml）0.50.500.5試劑四（ml）0.50.500.5內生肌酐清除率ccr =尿肌酐濃度/血肌酐濃度x 尿量(ml/min)2

8、實驗結果2.1標準管及空白管od值見下表：表2 標準管及空白管od值標準管od空白管od10.0750.01220.0690.008平均值0.0720.012.2 各治療方案實驗數據如下（以各組實驗數據中有效數據記錄，其中尿肌酐、血肌酐及內生肌酐清除率為計算值）：正常狀態(tài)下，家兔平均動脈壓7585mmhg，尿量34.5ml，血肌酐156.1163.2umol/l，尿肌酐62249369umol/l，ccr 11.617ml/min。輸入生理鹽水后各項指標均上升但不明顯，輸入葡萄糖后尿量增加，但平均動脈壓變化不明顯，再灌注后除血肌酐升高外，各指標均明顯降低。方案一治療家兔后平均動脈壓91mmhg

9、，尿量7.6ml，尿肌酐1458.9 umol/l，血肌酐161.5 umol/l，ccr 4.6，方案二治療后家兔平均動脈壓83.4mmhg，尿量22.5ml，尿肌酐1231.9umol/l，血肌酐177.4umol/l，ccr 13.4，方案三治療后家兔平均動脈壓72.7mmhg，尿量13.5ml，尿肌酐2042.4umol/l，血肌酐143.7umol/l，ccr 12.8（各時間點各指標變化規(guī)律詳見討論部分）。表3 治療方案一各實驗數據輸尿管插管后輸生理鹽水后輸入20%葡萄糖后再灌注15min后搶救方案一15min后平均動脈壓（mmhg）76.776708191尿量（ml）4.556.

10、81.27.6尿肌酐（od值）0.2020.0510.055血肌酐（od值）0.0980.1090.101尿肌酐（umol/l）6224.51329.21458.9血肌酐（umol/l）156.1175.6161.5內生肌酐清除率(ml/min)12.0064.6表4 治療方案二各實驗數據輸尿管插管后輸生理鹽水后輸入20%葡萄糖后再灌注15min后搶救方案二15min后平均動脈壓（mmhg）84.1689.395.180.883.4尿量（ml）33.45.21.322.5尿肌酐（od值）0.2990.0640.048血肌酐（od值）0.1010.1120.11尿肌酐（umol/l）9369.2

11、1750.61231.9血肌酐（umol/l）161.5181.0177.4內生肌酐清除率(ml/min)11.60.913.4表5 治療方案三各實驗數據輸尿管插管后輸生理鹽水后輸入20%葡萄糖后再灌注15min后搶救方案三15min后平均動脈壓（mmhg）82.4100.288.673.772.7尿量（ml）4.55.68.81.513.5尿肌酐（od值）0.2950.0710.073血肌酐（od值）0.1020.1120.091尿肌酐（umol/l）9239.51977.62042.4血肌酐（umol/l）163.21810143.7內生肌酐清除率(ml/min)17.01.112.83

12、討論：3.1尿生成的影響因素尿生成的過程包括腎小球濾過、腎小管和集合管的重吸收和分泌，機體對尿生成的調節(jié)就是通過這三個基本過程而實現的，具體為腎內自身調節(jié)以及神經和體液的調節(jié)1。腎小球濾過作用主要決定于有效濾過壓。 而有效濾過壓=（腎小球毛細血管靜水壓+囊內液膠體滲透壓）（血漿膠體滲透壓+腎小囊內壓）。毛細血管血壓主要決定于腎血流量及毛細血管橫截面積，腎血流量多而毛細血管橫截面積小時，毛細血管靜水壓高，故當機體缺血時，腎血流量減少，毛細血管血壓下降，尿生成減少。膠體滲透壓主要決定于液體內物質，當液體內糖、蛋白質及離子等物質增多時，液體膠體滲透壓增高，故當腎小球血管壁受損時，血液內物質進入腎小球

13、，是膠體滲透壓差值降低，尿生成增加（但此時通常腎血流量會減少而導致尿生成減少）。腎囊內壓通常較穩(wěn)定，對尿的生成影響小，僅在腎結石，腫瘤等疾病時機體會因囊內壓升高而少尿。腎小管和集合管通過重吸收作用回收尿內的小分子物質如糖、一些離子物質，而99%的水也會被重吸收，故原尿僅有1%會成為尿液。當腎實質受損時，腎小管重吸收功能減弱，尿量增加（但腎實質受損時通常毛細血管靜水壓會下降而導致尿生成減少）。腎小管和集合管的分泌功能主要通過分泌一些小分子物質進入尿液而改變尿液膠體滲透壓而改變尿量。但由于其分泌量較少，對尿生成影響不大。機體對尿生成的調節(jié)主要依靠腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，該系統(tǒng)抑制時，尿量增加

14、。3.2尿肌酐及內生肌酐清除率（ccr）圖1 腎小球濾過率的影響因素尿肌酐全部由腎小球濾過，不被腎小管重吸收，很少被腎小管排泌，而內生肌酐清除率（ccr）指腎單位時間內把若干毫升血液內的肌酐全部排泄出去，是腎小球功能的極敏感指標，當腎小球功能受損時，ccr降低2。3.3實驗數據分析圖3 各治療方案下ccr變化折線圖圖2各治療方案下尿量變化折線圖3.3.1 各情況下各指標變化分析靜脈快速注射30ml生理鹽水后，家兔尿量及平均動脈壓上升但不顯著（尿量上升不大于1ml，平均動脈壓升高不大于10mmhg），其主要原因為：靜脈注射ns后血漿膠體滲透壓降低但不顯著，腎小球濾過率增加不明顯，故尿量輕微增加。

15、ns注入后血容量上升（2.2kg家兔血容量約130ml），腎動脈血壓上升，使腎小球濾過率增加，且血管壁受刺激使腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)興奮，機體保水功能抑制，尿量增加。靜脈注射20%葡萄糖后，家兔尿量顯著增加（均大于1.5ml），但平均動脈壓變化趨勢不明顯。其主要原因為：高滲葡萄糖的升膠體滲透壓作用較生理鹽水強，故尿量升高也更明顯。由于高滲葡萄糖在已經注入30ml生理鹽水后注入，故家兔血容量增加更明顯，尿量也更顯著地增加。此時，實驗過程進行已久（超過1.5h），家兔由于各種手術而導致失血過多，且應激狀態(tài)逐漸減弱，腎上腺素等釋放減少，是機體血壓下降，這種作用拮抗了高滲葡萄糖的升壓作用。但由于

16、各家兔生理狀況不同，故各組平均動脈壓變化趨勢不明顯。夾閉左腎動脈后，機體進入應激狀態(tài)，再灌注后，由于腎功能嚴重受損，機體進入急性腎功能衰竭少尿期而嚴重少尿，可比正常值少0.2ml以上。尿肌酐、ccr急劇下降，反映腎小球壞死嚴重。目前，急性缺血再灌注腎損傷的發(fā)病機制尚未完全闡明，現有的研究資料表明它與atp 的減少、大量氧自由基的產生、細胞內鈣超載、細胞凋亡基因的調控等介導的腎小管、腎小球細胞損傷具有密切關系1。在家兔接受第一種治療方案（20ml生理鹽水）后，家兔尿量上升，平均動脈壓升高不明顯。平均動脈壓變化趨勢分析同前（實驗過久導致缺血而無法升高），尿肌酐、ccr回升但不明顯，可能因為生理鹽水

17、僅有增加血容量作用，對家兔解救效果不明顯。在家兔接受第二種治療方案（19ml生理鹽水+1ml速尿）后，家兔各項指標回升明顯，其原因是呋塞米（速尿）能增加水、鈉、氯、鉀、鈣、鎂、磷等的排泄。呋塞米能抑制前列腺素分解酶的活性，使前列腺素e2 含量升高，從而具有擴張血管作用。擴張腎血管，降低腎血管阻力，使腎血流量尤其是腎皮質深部血流量增加，從而預防急性腎功能衰竭。呋塞米等袢利尿藥存在明顯的劑量效應關系。隨著劑量加大，利尿效果明顯增強，且藥物劑量范圍較大。在家兔接受第三種治療方案（10ml生理鹽水+10ml20%葡萄糖）后，家兔各項指標回升比單純生理鹽水明顯，其原因可能為高滲葡萄糖使組織液更多地進入血

18、液，從而使血容量增加更多，利尿作用更強而使治療作用更好。3.3.2 各治療方案數據對比分析如圖2，再灌注前，各尿量變化曲線均平坦，而治療后尿量明顯增加，以方案二增加最為顯著可見治療方案二的利尿作用最強?？赡芤驗槟I缺血再灌后，機體處于應激狀態(tài)，各種生理功能亢進，在藥物注入后機體新陳代謝加快，尿量增加。而速尿（呋塞米）具有極佳的利尿作用，且兼有擴血管，擴血容量作用，故治療效果最好。如圖3，盡管治療后二、三治療方案ccr相差不大，但二方案的家兔正常ccr較高，故仍然可以看出治療方案二的治療效果最佳，其次為方案三，方案一治療效果不佳，甚至治療無效（ccr較該家兔正常值低，但可能由于實驗實驗過長（此時已

19、達3h），腎功能已經發(fā)現不可逆衰竭而治療無效）。3.4 實驗中遇到的問題（1）實驗過程家兔易死亡，分析原因有一下幾點：插管操作不熟悉導致家兔失血過多，而本此實驗耗時較長，家兔失血死亡；本次實驗需有三個創(chuàng)口，需暴露頸部、胸腔和腹腔?？赡苡捎诓僮鞑划斒辜彝闷鞴偎ソ叨?；腎是機體主要的排泄器官之一，能夠調節(jié)細胞外液容量和血流的滲透壓，排除體內過剩的電解質離子，從而維持機體內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，保證機體各種生命活動的進行，而且腎臟是一個高血流的器官，易發(fā)生缺血再灌注損傷，當我們在缺血的家兔再進行缺血灌注，導致死亡。（2）正確的插管技術是實驗成果的先決條件。本組實驗遇到的最大困難即輸尿管插管后無尿液，經過分析，

20、可能有以下幾個原因：教室氣溫低、動物麻醉和長時手術創(chuàng)傷等應急性刺激均可提高交感神經系統(tǒng)興奮性,使腎血管收縮,導致腎血流量和腎小球血漿流量顯著減少,腎小球濾過率也因此而減少；交感神經興奮也可調動腎素一血管緊張素一醛固酮系統(tǒng),醛固酮通過保鈉保水作用而致尿量減少；長時間手術如出血較多可致循環(huán)血量減少，反射性地引起抗利尿激素釋放增多，尿量減少；插管不成功，可能是未成功分離輸尿管、輸尿管插管過高或誤將輸尿管扎破等原因引起。實驗過程中，發(fā)現本實驗組的家兔盆腔有無色透明的液體溢出，猜測是由于輸尿管插管時用力過大，而使輸尿管破損，尿液從破損處流出，因而收集不到尿液。本實驗小組經過分析后，選取右腎輸尿管重新插管，成功收集到尿液。（3）在測量動脈血壓時，本實驗組發(fā)現計算機導出的數據為0