實(shí)驗(yàn)五離子交換柱層析法分離氨基酸

1、實(shí)驗(yàn)六離子交換柱層析法分離氨基酸目的要求(1) 學(xué)習(xí)采用離子交換樹脂分離氨基酸的基 本原理。掌握離子交換柱層析法的基本操作技術(shù)。篇孑立濮老柝是用離子交換劑（具有離子 交換性能的物質(zhì)）作固定相，利用它與流動(dòng) 相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來分離離 子型化合物的層析方法。即溶液中的離子同離子交換劑上功能基團(tuán)交換反應(yīng)的過程。pH 1 Net charge 十 1pH 7 Net charge 0pH 13 Net charge -1Cationic formZwitterion (neutral)Anionic formpH 1 Net charge 十 1pH 7 Net charge 0pH 1

2、3 Net charge -1COOHcoo-coo-Cationic formZwitterion (neutral)Anionic formpH 1 Net charge 十 1pH 7 Net charge 0pH 13 Net charge -1Cationic formZwitterion (neutral)Anionic formpH 1 Net charge 十 1pH 7 Net charge 0pH 13 Net charge -1HN C H wHN C HCationic formZwitterion (neutral)Anionic formpH 1 Net charg

3、e 十 1pH 7 Net charge 0pH 13 Net charge -1Cationic formZwitterion (neutral)Anionic formKey: Large net positive charge Net positive charge O Net negstive cliarge Large net negative chargePolvmer lx?ads wiLh negatively charged hinctional groupsProtein mixture is added to column contaming cation exchang

4、ers.(a)Proteins move through the column at rates detennined by their net charge? at the pH being used. With cation exchangers, proteins with a more negative net charge move faster and elute earlier.帝電揚(yáng)量少，荻知力亠的矢址 淺說下耒，帶電楊量多，親劎力犬 的后筱注睨下耒。離子交換過程示意= 起始吸附解吸X+ :起始緩沖離子 y+:待分離離子 z+ :待分離離子完成二、離子交換劑的種類在惰性載體上引

5、入帶有電荷的活性基團(tuán)即離 子麥接荊。上上（一）按活性功能基團(tuán)帶電荷性質(zhì)不同 陽離子交換劑一帶負(fù)電荷，與陽離子交換 陰離子交換劑一帶正電荷，與陰離子交換（二）按載體種類不同1 離子交換樹脂：主要有聚苯乙烯樹脂 苯乙烯+聚苯乙烯（單體）（交聯(lián)劑）X 100%二乙烯苯交聯(lián)度=苯乙烯+二乙烯苯:交聯(lián)度大，網(wǎng)孔變小，大分子量的離子不能 進(jìn)入樹脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子交換。:在不影響分離的情況下，以釆用交聯(lián)度較高 的樹脂為好，這樣可以提高樹脂對離子的選 擇性。離子交換樹脂的顆粒直徑大小Dowex 50 為20-50 目Dowex 20840gm50100297|iim149um（代表二乙烯苯的百分含量）樹脂res

6、in (據(jù)所含交換基團(tuán)的性質(zhì)分) 陽離子交換樹脂1=強(qiáng)酸型含磺酸基團(tuán)(r-so3h) 中等酸型含磷酸基團(tuán)(-O-PO2H4) 弱酸型含酚基、竣基 陰離子交換樹脂強(qiáng)堿含季胺基團(tuán)卜N+(CH3)3 弱堿含叔胺、伯胺基團(tuán)-N(CH3)2 陰離子交換樹脂對化學(xué)試劑及熱都不如陽離 子交換樹脂穩(wěn)定。2 離子交換紅維素FA:陰離子交換纖維素一如:DEAE-纖維素 PH8.6以下分離中性或酸性物質(zhì)，具二乙胺 乙基:陽離子交換纖維素一如:CM-纖維素一般 pH4條件下使用，具有竣甲基3離子交換凝膠一分離大分子物質(zhì)如：葡聚糖(Sephadex)、 聚丙烯酰胺(PAG)、瓊脂糖(Sepharose)三.操作注意點(diǎn)(

7、-)離子交換劑的選擇原則：根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)選擇一同一性質(zhì) 離子交換劑中選用對被分離物質(zhì)各組分之間 結(jié)合力差異大的型號交換劑，以保證通過離 子交換層析后能得到比較滿意的結(jié)果。靑處 0瘙：1 被分離物質(zhì)帶何種電荷2 被分離物質(zhì)分子的大小大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素3 被分離物質(zhì)所處的環(huán)境4 被分離物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)被分離物質(zhì)的大概數(shù)量根據(jù)分離過程的實(shí)驗(yàn)條件強(qiáng)酸強(qiáng)堿一應(yīng)用廣泛弱酸型一只能在堿性pH范圍內(nèi)使用弱堿型一只能在酸性pH范圍內(nèi)使用（二）緩沖液的選擇原則：不能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，所帶電荷應(yīng)與樣品510Lys1層析柱等 2.沸水浴試劑 Dowex50 2mol/L NaOH pH53檸檬酸緩

8、沖液:樣品液：氨基酸混合液昂三酮混合液實(shí)驗(yàn)步驟1. 樹脂的處理將干的強(qiáng)酸型樹脂用蒸憾水浸泡過夜，使之充分溶脹。用4倍體積 的2mol/L的鹽酸浸泡1小時(shí)，傾去清液，洗至中性。再甲2mol/L的氫氧 化鈉處理，做法同上。最后用欲使用的緩沖液浸泡。2. 裝柱取直徑1cm,長度10-12cm的層析柱。將柱垂直至于鐵架上。自頂 部注入上述經(jīng)處理的樹脂懸浮液，關(guān)閉層析柱出口，待樹脂沉降后， 放出過量溶液，再加入一些樹脂，至樹脂沉降至8 10cm的高度即可。裝柱要求連續(xù)、均勻，無紋格、無氣泡，表面平整。液面不低于樹脂。3. 平衡將緩沖液瓶與恒流泵相連，恒流泵出口與層析柱入口相連，樹脂表面 保留3-4cm液

9、層，開動(dòng)衡流泵，以24ml/h流速平衡，直至流出液pH與洗 脫液相同。4. 加樣揭去層析柱上口蓋子，待柱內(nèi)液面至樹脂表面12mm關(guān)閉出口，沿管壁四周小 心加入0.5ml樣品，慢慢打開出口，同時(shí)開始收集流出液。當(dāng)樣品液彎月面靠近樹 脂頂端時(shí)，即刻加入少量檸檬酸緩沖液沖洗加樣品處數(shù)次，然后注入檸檬酸緩沖 液至液面高3-4cm左右，接恒流泵。5. 洗脫以緩沖液洗脫，開始用試管收集洗脫液，每管收集1mL,共收集6080管。6洗脫及氨基酸的鑒定向各管收集液中加1mL水合茹三酗顯色劑并混勻，在沸水浴中準(zhǔn)確 加熱5min后冷卻至室溫，再加入3mL的0.1%硫酸銅溶液?；靹?，以收集液第2 管為空白，測定A570波長的光吸收值，以光吸收值為縱坐標(biāo)，以洗脫液體積為 橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)氨基酸的解離性質(zhì)，分析該實(shí)驗(yàn)條件下氨基酸從層析柱洗脫下來的順序。Separation of amino acids on a cation exchange columnSample containing several a：niiino uridMEJinioti wlumn coi