免疫標記技術的基本概念教學ppt課件

1、 第一節(jié) 免疫標志技術的根本概念一、免疫標志與標志免疫的概念二、常用的免疫標志物質 免疫標志與標志免疫免疫標志技術：免疫標志技術：標志物與免疫活性物質的聯(lián)接技術標志物與免疫活性物質的聯(lián)接技術標志免疫技術：標志免疫技術：以標志免疫物質檢測相應靶物質的技術以標志免疫物質檢測相應靶物質的技術常用的免疫標志物質常用的免疫標志物質類別 標志物 用途熒光素 FITC、RB200、TRITC 免疫組化 鑭系元素螯合物 免疫分析測定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析測定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫組化 免疫分析測定化學發(fā)光物 Luminol、lucigenin 免疫分析測定金屬

2、顆粒 膠體金、鐵蛋白 免疫組化 免疫分析測定 第二節(jié) 酶標志技術一、常用標志方法二、標志免疫物的分別與鑒定常用標志方法常用標志方法1、常用酶 辣根過氧化物酶HRP 堿性磷酸酶AP2、標志方法 戊二醛交聯(lián)法 過碘酸鹽氧化法戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法 (一步法一步法抗體-NH2 + COH-CH23-COH + NH2-酶抗體-NH2 =CH-CH23-CH = NH2-酶抗體-NH2 =CH-CH23-CH = NH2-抗體酶-NH2 =CH-CH23-CH = NH2-酶戊二醛交聯(lián)法二步法戊二醛交聯(lián)法二步法COH-CH23-COH + NH2-酶抗體-NH2 + CHO-CH23-CH = NH

3、2-酶抗體-NH2 =CH-CH23-CH = NH2-酶過碘酸鹽氧化法過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+ NH2抗體OOONN抗體抗體H2ON抗體NaBH4Schiff堿酶-五炭糖環(huán)標志免疫物的分別與鑒定標志免疫物的分別與鑒定1、分別 目的：去除游離酶 方法：鹽析、柱層析2、鑒定 抗體活性 酶活性 標志物純度 第三節(jié) 熒光標志技術一、常用標志方法二、標志免疫物的分別與純化常用標志方法常用標志方法1、熒光素的概念2、生物標志熒光素的要求3、常用熒光素標志原理與方法 生物標志熒光素的要求生物標志熒光素的要求1、具有與蛋白質共價結合的才干2、熒光效率高3、能與背景物質構成鮮

4、明對比4、不影響蛋白質的生物、免疫活性5、標志方法平安、簡便6、標志物穩(wěn)定，易保管FITCFITC的標志原理與方法的標志原理與方法熒光素-N=C=S + NH2-抗體熒光素-N-C-N-抗體H S HRB200RB200的標志原理與方法的標志原理與方法熒光素-SO3Na + PCl5熒光素-SO2 Cl + PCl3 + NaCl熒光素-SO2 Cl + NH2-抗體 熒光素-SO2 -NH-抗體 + HCl 標志免疫物的分別與鑒定標志免疫物的分別與鑒定1、分別 目的：去除游離熒光素 方法：柱層析2、鑒定 抗體活性 標志物結合度 F/P比值的應意圖義 第四節(jié) 放射性核素標志技術一、常用標志方法

5、二、標志免疫物的分別與純化常用標志方法常用標志方法1、常用放射性核素2、125I 的標志方法 直接法氯胺T法 間接法銜接法直接法氯胺直接法氯胺T T法法OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I 4。C125I氯胺T間接法銜接法間接法銜接法CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2+ Na125I氯胺T125INSHPP間接法銜接法間接法銜接法CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHH-C-C-N-蛋白質H O H+ NH2-蛋白質125

6、I125I標志免疫物的分別與鑒定標志免疫物的分別與鑒定1、分別 目的：去除游離放射性核素 方法：柱層析2、鑒定 游離放射性核素含量 免疫活性 比放射性mCi/mg應意圖義本章小結本章小結1、免疫標志技術的概念2、常用免疫標志物質及其標志方法3、標志免疫物質的分別與鑒定思索題思索題1、何謂免疫標志技術？2、常用的免疫標志物質有哪些？3、酶標志的主要方法有哪些？4、F/P比值的實意圖義如何？5、何謂比放射性？有何意義？ 第一節(jié) 標志免疫技術的分類一、按指示標志物質劃分的類型二、按測定方式劃分的類型三、按測定用途劃分的類型1、酶免疫技術2、熒光免疫技術3、放射免疫技術4、發(fā)光免疫技術5、金免疫技術按

7、指示標志物質劃分的類型按指示標志物質劃分的類型1、均相型homogenous2、非均相型heterogeneous按測定方式劃分的類型按測定方式劃分的類型均相型均相型homogenous非均相型非均相型heterogeneous雙標志均相熒光免疫測定雙標志均相熒光免疫測定酶擴展免疫測定技術酶擴展免疫測定技術1、免疫測定技術2、免疫組化技術按測定用途劃分的類型按測定用途劃分的類型 第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附實驗一、ELISA技術的原理與方法二、 ELISA技術的操作留意要點ELISA技術的原理與方法技術的原理與方法間接法 夾心法 競爭法間接法間接法夾心法夾心法競爭法競爭法酶標儀酶標儀酶標儀酶標儀ELI

8、SA技術的操作留意要點技術的操作留意要點試劑器材操作環(huán)節(jié) 適宜任務濃度 第三節(jié) 熒光抗體技術一、熒光抗體技術的原理與方法二、熒光抗體技術的操作留意要點熒光抗體技術的原理與方法熒光抗體技術的原理與方法直接法間接法補體法雙標志法 直接法間接法補體法雙標志法熒光抗體技術的操作留意要點熒光抗體技術的操作留意要點標本處置染色操作 結果觀測熒光顯微鏡熒光顯微鏡熒光顯微鏡運用原理熒光顯微鏡運用原理激發(fā)濾片BG吸收濾片OG標本FITC吸收光峰值：490-495nm FITC發(fā)射光峰值：520-530nmBG：325-500 OG：410-650激發(fā)濾片激發(fā)濾片吸收濾片吸收濾片熒光濾鏡運用原理熒光濾鏡運用原理 第四節(jié) 放射免疫測定技術一、放射免疫測定技術的原理與方法二、放射免疫測定技術的操作留意要點結合相游離相放射免疫分析法的原理與方法放射免疫分析法的原理與方法1 2 5 10 20 50 10040302010未標志抗原含量未標志抗原含量結結合、合、游游離離相相放放射射性性含含量量比比值值液閃儀液閃儀計數(shù)器計數(shù)器放射免疫測定技術的操作留意要點放射免疫測定技術的操作留意要點反響的溫度與時間結合相與游離相的分別免疫標志技術的比較免疫標志技術的比較 FIA ELISA RIA敏感性 較低 高 高特異性 高 高 高反復性 差 好 好檢測對象