豬流行性腹瀉病毒（經(jīng)典實(shí)用）

1、豬流行性腹瀉病毒 豬流行性腹瀉病毒分 離的研究報告 匯報人：劉騰飛 科前質(zhì)量管理部病毒組 豬流行性腹瀉病毒 l豬流行性腹瀉病毒 豬流行性腹瀉毒 一般概況以及 國內(nèi)外研究進(jìn)展 豬流行性腹 瀉病毒的分離 分離豬流行性腹瀉 病毒的討論 豬流行性腹瀉病毒 一、豬流行腹瀉病毒的一般概況及國內(nèi)外研究進(jìn)展一、豬流行腹瀉病毒的一般概況及國內(nèi)外研究進(jìn)展 1.豬流行性腹瀉病毒一般概況。豬流行性腹瀉病毒一般概況。 豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV) ， 屬于尼多病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒 屬(Coron

2、avirus) 。感染動物之后主要以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺 乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病 。它是 引起10日齡仔豬100死亡的傳染病毒之一，每年給我國養(yǎng)豬業(yè) 造成2030億左右的經(jīng)濟(jì)損失。 豬流行性腹瀉病毒 2.豬流行性腹瀉病毒的基因結(jié)構(gòu)特征豬流行性腹瀉病毒的基因結(jié)構(gòu)特征 PEDV基因組是單股正鏈具有感染性的RNA，與其他 冠狀病毒相似，其基因組5端有一個帽子結(jié)構(gòu)(cap)，3端 有1個Poly(A)尾，基因組全長為28 033 nt ?；蚪M序列包 括6個ORF，從53端依次為編碼復(fù)制酶多聚蛋白 1ab(pp1ab)、纖突蛋白(S)即糖激化纖突蛋白、ORF3蛋白、 小膜

3、蛋白(E)、膜糖蛋白(M)即糖激化囊膜和核衣殼蛋白(N) 的基因 。 豬流行性腹瀉病毒 豬流行性腹瀉病毒 3. PEDV的編碼蛋白及其功能。的編碼蛋白及其功能。 （1）非結(jié)構(gòu)蛋白及其功能：）非結(jié)構(gòu)蛋白及其功能： a.復(fù)制酶多聚蛋白復(fù)制酶多聚蛋白1ab(pp1ab) 它是由基因1編碼的一個多功能蛋白質(zhì)，預(yù)測分 子質(zhì)量為753ku，有13個預(yù)測蛋白酶切割位點(diǎn)的非結(jié)構(gòu)蛋白，經(jīng)共轉(zhuǎn)譯處理 后產(chǎn)生與病毒基因組復(fù)制相關(guān)的一系列蛋白質(zhì)，主要功能包括負(fù)鏈RNA、前 導(dǎo)RNA、sgmRNA和子代病毒RNA的轉(zhuǎn)錄作用以及對多聚蛋白切割產(chǎn)生具有 功能產(chǎn)物的蛋白酶切割作用 。另外，ORF1a編碼蛋白還含有3個轉(zhuǎn)膜域(

4、T M)。ORF1b主要編碼RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)，同時有3個蛋白結(jié)構(gòu)域 分別是鋅指蛋白域(Z)也稱金屬結(jié)合域、螺旋酶域(Hel)和保守序列域(C) 。 豬流行性腹瀉病毒 b. ORF3蛋白：蛋白：ORF3蛋白是編碼分子質(zhì)量為25.3 ku的非結(jié)構(gòu) 蛋白，通過限制性片段長度多態(tài)性分析適應(yīng)Vero細(xì)胞的弱 毒PEDV和野毒PEDV的ORF3，發(fā)現(xiàn)ORF3與病毒毒力有關(guān) . 豬流行性腹瀉病毒 （2）PEDV結(jié)構(gòu)蛋白及其功能結(jié)構(gòu)蛋白及其功能 a.S蛋白：蛋白：S蛋白是由1 383個氨基酸組成、分子質(zhì)量為180 ku 220 ku、位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白，在病毒粒子與細(xì)胞表 面受體

5、結(jié)合后通過膜融合侵入宿主細(xì)胞和在感染宿主體內(nèi)介導(dǎo) 中和抗體產(chǎn)生的過程中發(fā)揮重要生物學(xué)作用。目前，PEDV S蛋 白中和表位在以煙草花葉病毒為載體的無煙堿煙草植物中得到 了成功表達(dá)，表達(dá)蛋白免疫接種后，對仔豬具有良好的保護(hù)作 用，為PEDV轉(zhuǎn)基因植物疫苗研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ) 。 豬流行性腹瀉病毒 b.N蛋白蛋白 ：N蛋白是由441個氨基酸組成、分子質(zhì)量為55 ku58 ku、 磷酸化的核衣殼蛋白，與病毒基因組RNA相互纏繞形成病毒核衣 殼 ，N蛋白有3個相對保守的結(jié)構(gòu)域，位于中間的是一個能與病 毒RNA前導(dǎo)序列結(jié)合的RNA結(jié)合域 ，N蛋白在PEDV的結(jié)構(gòu)蛋白 中所占比例最大，在感染的細(xì)胞中能得到大

6、量表達(dá)。豬在感染 PEDV的早期，體內(nèi)就能產(chǎn)生抗N蛋白的高水平抗體，又鑒于其 冠狀病毒N蛋白保守性強(qiáng)，所以利用N蛋白來建立PEDV分子生物 學(xué)診斷技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景 。 豬流行性腹瀉病毒 C.M蛋白蛋白 ：M蛋白是由226個氨基酸組成、分子質(zhì)量為27 ku32 ku 的膜糖蛋白，在病毒粒子的組裝和出芽過程中具有重要作用。在 補(bǔ)體存在的條件下，抗M蛋白囊膜外抗原表位的單克隆抗體能中 和病毒的感染性。另外，M蛋白能介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生干擾素，所以 M蛋白可以作為PEDV基因工程疫苗的候選抗原 。 豬流行性腹瀉病毒 d. E蛋白蛋白 ： E蛋白是由76個氨基酸組成、預(yù)測分子質(zhì)量為8.8 ku、位 于病毒

7、囊膜上的小包膜蛋白，對病毒的組裝和出芽是必要的。目 前，研究者將PEDV的E基因和M基因?qū)爰撞《据d體(pSFV)，在 BHK-21細(xì)胞中得到了成功的表達(dá)，為進(jìn)一步探討E蛋白和M蛋白 在抗病毒中的作用奠定了基礎(chǔ) 。 豬流行性腹瀉病毒 N蛋白（Nucleoprotein)、M蛋白（Membrane protein)、 SM蛋白（small membrane protein)和S蛋白（Spike protein)，位于SM基因與S基因之間的ORF，命名為 ORF3，編碼未知功能且具有多態(tài)性的產(chǎn)物。 豬流行性腹瀉病毒 4.PEDV的臨床癥狀的臨床癥狀 豬流行性腹瀉的病原是一種冠狀病毒，與傳染性胃腸炎

8、的 病原相似。病毒破壞小腸茸毛，減小營養(yǎng)吸收面積，還導(dǎo) 致體液損失，造成脫水。易感群遭病毒侵入23周內(nèi)即可 產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫，病毒就會從豬群消失，尤其是較小的豬 群（300頭母豬）。仔豬也可通過初乳獲得免疫。易感群 初次接觸病原時會爆發(fā)急性腹瀉，這種情況下母豬發(fā)病率 可達(dá)100，有的表現(xiàn)為輕微的腹瀉，有的則呈現(xiàn)水樣下 痢。 豬流行性腹瀉病毒 流行性腹瀉有兩種臨床表現(xiàn)類型，PED I型只影響生長豬， 而PED II型則影響各年齡階段的豬只，包括哺乳仔豬和成 熟母豬。本病潛伏期為2 d，腹瀉癥狀持續(xù)714 d。哺乳 仔豬當(dāng)中病情可能較輕微，也可能很嚴(yán)重，死亡率最高可 達(dá)40。 在規(guī)模較大的豬群，尤其

9、是集約化豬場當(dāng)中，母 豬群第一波不會被全部感染，而會反復(fù)感染。沒有母源抗 體保護(hù)的仔豬會出現(xiàn)散發(fā)的臨床癥狀。 豬流行性腹瀉病毒 具體表現(xiàn)為：（1）母豬：腹瀉，可能較輕微，瀉出牛糞 樣稀糞，也可能呈水樣下痢；（2）仔豬：腹瀉、脫水。 死亡率可能會很高；（3）斷奶豬與生長豬：急性水樣下 痢，無血液或粘液。死亡率通常較低，但發(fā)病率可能很高。 病毒首次侵入豬場后，可在包括生長群和繁殖群在內(nèi)的所 有豬只當(dāng)中迅速傳播，造成腹瀉、嘔吐，510 d內(nèi)發(fā)病率 可達(dá)100。潛伏期為24 d，嘔吐。 豬流行性腹瀉病毒 眼觀變化僅限于小腸，小腸擴(kuò)張，內(nèi)充滿黃色液體，腸系 膜充血，腸系膜淋巴結(jié)水腫，小腸絨毛縮短。組織學(xué)

10、變化， 見空腸段上皮細(xì)胞的空泡形成和表皮脫落，腸絨毛顯著萎 縮。絨毛長度與腸腺隱窩深度的比值有正常的7：1降到3： 1。上皮細(xì)胞脫落最早發(fā)生于腹瀉后2小時。 病理變化病理變化 豬流行性腹瀉具有特征性的病理變化主要見于小腸。整個 小腸腸管擴(kuò)張，內(nèi)容物稀薄，呈黃色、泡沫狀，腸壁弛緩， 缺乏彈性，變薄有透明感，腸粘膜絨毛嚴(yán)重萎縮。25%病 例胃底粘膜潮紅充血，并有粘液覆蓋，50%病例見有小點(diǎn) 狀或斑狀出血，胃內(nèi)容物呈鮮黃色并混有大量乳白色凝乳 塊（或絮狀小片），較大豬（14日齡以上的豬）約10%病 例可見有潰瘍灶，靠近幽門區(qū)可見有較大壞死區(qū)。 豬流行性腹瀉病毒 剖檢變化表現(xiàn)為尸體消瘦、皮膚暗灰色。皮

11、下干燥，脂肪蜂 窩組織表現(xiàn)不佳。腸管膨脹擴(kuò)張，充滿黃色液體，腸壁變薄， 腸系膜充血，腸系膜淋巴結(jié)腫脹。 鏡下可見小腸絨毛縮短，上皮細(xì)胞核濃縮，胞漿嗜酸性變化。 腹瀉嚴(yán)重時，絨毛長度與隱窩比值由正常1：1可降為3：1。 剖檢病變局限于胃腸道。胃內(nèi)充滿內(nèi)容物，外觀呈特征性地 弛緩。小腸壁變薄、半透明。顯微病變從十二指腸至回腸未 端，呈斑點(diǎn)狀分布，受損區(qū)絨毛長度嚴(yán)重變短， 變短的絨 毛呈融合狀，帶有發(fā)育不良的刷狀緣。 豬流行性腹瀉病毒 小腸腸管擴(kuò)張，呈黃色、泡沫狀，變蒲有 透明感等。 豬流行性腹瀉病毒 病豬腸道變蒲，呈黃色， 有泡沫，空泡，透明。 小腸擴(kuò)張，有稀糞， 鼓起。 豬流行性腹瀉病毒 腸道鼓

12、起，變透明 腸系膜有充血，內(nèi)充有黃 色液體。 豬流行性腹瀉病毒 豬流行性腹瀉病毒 5.診斷技術(shù) 病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光 RT-PCR競爭阻斷ELISA 上面三種方法雖然都 能對PED作出準(zhǔn)確的 診斷，但是操作復(fù)雜 而且耗時。 病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光 RT-PCR競爭阻斷ELISART-PCR競爭阻斷ELISART-

13、PCR 病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒分離病毒中和試驗(yàn)免疫熒光病毒分離病毒中和試驗(yàn) 競爭阻斷ELISA競爭阻斷ELISART-PCR 豬流行性腹瀉病毒 6.防治措施防治措施 因?yàn)槭遣《静?，所以本病沒有特效療法，抗生素對于本病 的治療幾乎沒有什么效果。支持性治療，如提供電解質(zhì)溶 液以及暖和的圈舍對于本病的治療具有很大的幫助。如果 病毒初次侵入豬群，要保證所有成年動物早期全部受到感 染，以便獲得一致的免疫力?？蓪⒒钾i瀉出的稀糞混在一 桶水

14、里喂給所有母豬，以便它們都能接觸到病原。 豬流行性腹瀉病毒 生長豬染該病后不經(jīng)治療會自行康復(fù)，除非并發(fā)其它疾病， 如：豬痢疾。如果有其它疾病并發(fā)，可飲水或飼料添加抗 生素，作預(yù)防性用藥。采用全進(jìn)全出生產(chǎn)模式常會打斷該 病的循環(huán)，消滅該病。用酚類、氯制劑和碘制劑等消毒劑 可輕易將該病毒殺滅。 豬流行性腹瀉病毒 另外，豬病毒性腹瀉的免疫防控要堅持三病(豬傳染性胃腸炎 TGE、豬流行性腹瀉PED、豬輪狀病毒RV)共防的原則,可用 聯(lián)苗進(jìn)行免疫接種,也可使用單苗進(jìn)行同步異途(以各個弱毒 或滅活單苗所要求的接種方式多途徑同時進(jìn)行免疫接種) 免 疫接種. 此三病都是通過糞/口途徑傳染,所以要加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生,

15、 及時清除糞便,加強(qiáng)哺乳期對母豬乳房、產(chǎn)床和產(chǎn)房以及保育 舍地面的消毒,降低環(huán)境中的病原密度,減少傳染機(jī)會. 免疫預(yù) 防和環(huán)境消毒并重、藥物治療為輔,可最大限度地控制病毒性 腹瀉的發(fā)生. 豬流行性腹瀉病毒 目前疫苗免疫主要有下面幾種疫苗： 滅活苗：豬流行性腹瀉與豬傳染性胃腸炎二聯(lián)油乳劑滅活 疫苗 ；豬流行性腹瀉滅活疫苗甲醛氫氧化鋁滅活疫苗 （單苗） 弱毒活疫苗：華毒株疫苗（豬傳染性胃腸炎弱毒疫苗）， 哈爾濱獸醫(yī)研究所研制生產(chǎn)的豬傳染性胃腸炎-輪狀病毒 二聯(lián)弱毒苗，以及日本研制的浮羽株弱毒活疫苗、h-5株 弱毒活疫苗、163弱毒株疫苗，美國RV弱毒苗、RV-TGEV 二聯(lián)弱毒苗和前蘇聯(lián)的三聯(lián)弱毒

16、苗 。 豬流行性腹瀉病毒 還在研制的疫苗有如下幾種： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、廣州動植物檢疫局、 江蘇農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位正在研 制TGE-PED二聯(lián)弱毒苗 、福建省生物藥品廠同中國農(nóng)大 聯(lián)合開發(fā)的TGE-PED-RV三聯(lián)弱毒苗不久將用于養(yǎng)豬生產(chǎn) 。 豬流行性腹瀉病毒 7.展望展望 PEDV是引起豬胃腸道疾病的重要病原之一，隨著分子生 學(xué)的不斷發(fā)展，近年來對有關(guān)PEDV 分子生物學(xué)、診斷技術(shù) 等方面的的研究取得了很大的進(jìn)步，但是與其他冠狀病毒成 員相比，其研究還相對落后許多，尤其在PEDV的新型高效 疫苗、反向遺傳操作、黏膜免疫機(jī)理和病毒致弱機(jī)制等方面 還有待深入的

17、研究。隨著對PEDV研究越來越廣泛和深入，P EDV的研究也將同其他冠狀病毒一樣將會更加深入。 豬流行性腹瀉病毒 二、豬流行性腹瀉病毒的分離二、豬流行性腹瀉病毒的分離 1971年，在英國的豬群中首次發(fā)現(xiàn)豬流行性腹瀉（PED），直到1978 年，英國和比利時才證實(shí)，引起PED的病原體為冠狀病毒PED和豬傳染 性胃腸炎TGE是由不同血清的冠狀病毒引起危害以消化器官為主的兩個 類似的豬的傳染病。因此單靠臨床癥狀和組織病理學(xué)檢查來作出鑒別診 斷是比較困難的，必須借助于血清學(xué)和病原學(xué)的檢驗(yàn)。但是，由于在細(xì) 胞培養(yǎng)物中使用胎牛血清會起到抑制冠狀病毒吸收進(jìn)入細(xì)胞膜受體的作 用，使PED病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長

18、繁殖受阻，從而對PED病毒的應(yīng)用 研究帶來了一定的困難。 豬流行性腹瀉病毒 因此，從PEDV發(fā)現(xiàn)開始，很多研究人員嘗試用不同的方法 將PEDV適應(yīng)于細(xì)胞，但用了近10年的時間都沒有取得成功， 這在一定程度上制約了PEDV研究進(jìn)程。直到1988年， Hofmann等首次在培養(yǎng)基含胰酶的Vero細(xì)胞上成功繁殖出 PEDV，并認(rèn)為胰酶對PEDV纖突糖蛋白切割作用增強(qiáng)了病毒 對Vero細(xì)胞的感染力，此方法在PEDV分離、細(xì)胞培養(yǎng)和疫苗 的研究中被廣泛應(yīng)用 。 豬流行性腹瀉病毒 此后，Kusanagi K等研究者對PEDV細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行了深入 研究，相繼在仔豬膀胱、腎臟的原代細(xì)胞和KSEK6、IB- RS

19、-2（豬腎細(xì)胞）、MA104（猴腎細(xì)胞）、CPK、ESK （豬腎細(xì)胞）的傳代細(xì)胞系上成功培養(yǎng)了PEDV。PEDV在 細(xì)胞上的成功培養(yǎng)對其研究具有重要意義，解決了PEDV 研究的瓶頸問題，為PEDV理化特性、疫苗及其相關(guān)分子 生物學(xué)的研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，使PEDV的研究進(jìn)入了一 個新階段。 豬流行性腹瀉病毒 關(guān)于PEDV的細(xì)胞培養(yǎng) 有關(guān)PEDV在細(xì)胞上培養(yǎng)難的問題一直是制約對該病毒生物 學(xué)特性研究的重要因素之一，也正因如此，許多國內(nèi)外學(xué)者多 年以來一直鍥而不舍尋找解決該問題的辦法。 國外學(xué)者對此研究的成果國外學(xué)者對此研究的成果 1988年，瑞典學(xué)者Hoffman采用胎豬原代細(xì)胞（腸、肺、腎、 肝

20、、腦和皮膚細(xì)胞）和對冠狀病毒易感的穩(wěn)定細(xì)胞系（Vero、 PD5、PK15、HRT18細(xì)胞）做PEDV接種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明 了除了接種PEDV的Vero細(xì)胞產(chǎn)生病變以外，其他細(xì)胞均未檢 測到CPE產(chǎn)生，且維持液中未加胰酶的Vero細(xì)胞除了第一代檢 測到病毒的復(fù)制外，再往下傳代就沒有檢測的病毒的復(fù)制。由 此Hoffman得出的結(jié)論是：PEDV必須在有胰酶為輔助的Vero 細(xì)胞上進(jìn)行體外繁殖。 豬流行性腹瀉病毒 1999年，日本學(xué)者M(jìn)asaaki Ono等人用Vero細(xì)胞、MA104細(xì) 胞、未喂初乳的仔豬膀胱上皮細(xì)胞（SB1、SB2）、未喂初乳 的仔豬腎細(xì)胞（SK）做PEDV接種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)

21、果表明， PEDV可在維持液中加有胰酶的Vero、 SB1、 SB2、 SK細(xì)胞 上產(chǎn)生病變，但出現(xiàn)在SB1、 SK細(xì)胞的CPE要晚于Vero細(xì)胞 ，病毒在SB2和MA104細(xì)胞傳至第5代均檢測到CPE。此學(xué)者 得出的結(jié)論是PEDV不僅可以在維持液中加有胰酶的Vero細(xì)胞 上繁殖，也可以在維持液中加有胰酶的SB1、 SK細(xì)胞上繁殖 。此結(jié)論拓延了Hoffman只在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)PEDV獲得成功局 限。 2002年，韓國學(xué)者D.S.Song用Vero細(xì)胞分離出一株P(guān)EDV DR13毒株，通過加有胰酶維持液的Vero細(xì)胞連續(xù)傳代來制弱 DR13毒株，為PEDV疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。 豬流行性腹瀉

22、病毒 國內(nèi)學(xué)者對此研究的成果國內(nèi)學(xué)者對此研究的成果 關(guān)于關(guān)于PEDV細(xì)胞培養(yǎng)的研究，我國學(xué)者也一直致力于該方面細(xì)胞培養(yǎng)的研究，我國學(xué)者也一直致力于該方面 的研究，多年來做過不少這方面報道：的研究，多年來做過不少這方面報道： 1984年，宜化等人運(yùn)用豬胎腸組織原代單層細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行 了豬流行性腹瀉病毒吉毒株的培養(yǎng)與傳代試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，豬流行性腹瀉病毒吉毒株（以及華毒株，川毒株）可以 在豬胎腸組織原代單層細(xì)胞培養(yǎng)物上良好地增殖，其感染力 高達(dá)105.5-8.0TCID50/0.05ml。這也是我國關(guān)于PEDV原代細(xì)胞 培養(yǎng)的最早報道。 1991年，李樹根等人在沒有胰酶的條件下，通過PK15和

23、 Vero細(xì)胞培養(yǎng)分離繁殖PEDV，但是沒有成功。而在每毫升含 60微克胰酶的Vero細(xì)胞維持液中，PEDV培養(yǎng)獲得成功，從 而他證明了所添加的胰酶對PEDV細(xì)胞培養(yǎng)物的重要性。 豬流行性腹瀉病毒 1993年，李樹根等人在含有胰酶的細(xì)胞維持液條件下，用 Vero細(xì)胞培養(yǎng)傳代PEDV 12代，轉(zhuǎn)入不加胰酶條件下，再用 Vero細(xì)胞傳19代，出現(xiàn)病變，繼后轉(zhuǎn)用PK細(xì)胞傳22代，適應(yīng) PK15、Vero細(xì)胞生長直到53代，轉(zhuǎn)用ST細(xì)胞培養(yǎng)，傳4代， 細(xì)胞出現(xiàn)CPE，由此可見，所分離的PEDV先后適應(yīng)Vero細(xì)胞 、PK細(xì)胞、ST細(xì)胞培養(yǎng)方法是成功的。 1996年，童坤周等人通過Vero、PK、ST細(xì)

24、胞株的連續(xù)傳代， 證明第72代PEDV毒已被制弱。用83代毒（P83）做弱毒苗試 驗(yàn)，試驗(yàn)證明P83制備的弱毒疫苗的總免疫效力達(dá)94.6，表 明P83病毒已具備弱毒疫苗株的要求。從而說明PEDV弱毒的 制弱可以通過細(xì)胞代次的方式。 2000年，唐永蘭等人證明已適應(yīng)于Vero細(xì)胞100代的PEDV病 毒，能在ST細(xì)胞上繁殖。 豬流行性腹瀉病毒 2003年，賴月輝等人在PK15傳代細(xì)胞培養(yǎng)液中加入60ug/ml 胰酶的方法成功分離到PEDV，并且證明PEDV一旦適應(yīng)了 PK15傳代細(xì)胞，傳至一定代次不加胰酶處理，也能在PK15 傳代細(xì)胞生長繁殖，且毒價不變。 2007年，李寶賢報道先轉(zhuǎn)染對PEDV

25、非許可性的MDCK細(xì)胞 ，表達(dá)pAPN，從而使MDCK細(xì)胞對PEDV獲得易感性。 總之，多年來許多國內(nèi)外學(xué)者一直圍繞PEDV細(xì)胞培養(yǎng)這個中 心，展開對PEDV其它生物學(xué)特性的研究。通過多年的努力， 由PEDV適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)到PEDV感染細(xì)胞受體的研究，已取得 不同程度的成果，這位大量繁殖PEDV，提高PEDV適應(yīng)細(xì)胞 的滴度以及其血清學(xué)、免疫學(xué)、病原生物學(xué)特性和其疫苗研制 等提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。 豬流行性腹瀉病毒 選擇體外培養(yǎng)PEDV的細(xì)胞系 就這個問題許多學(xué)者都選擇了Vero細(xì)胞作為培養(yǎng)PEDV的理想 細(xì)胞系，但是不同來源地Vero細(xì)胞對PEDV的敏感性不同，有 的Vero細(xì)胞對病毒的易感染

26、性極低（Hofinann和Wyler,1998 ），初次分離，很難成功。要想使Vero細(xì)胞獲得對PEDV易感 染性，需要有胰蛋白酶的輔助，不同來源的Vero細(xì)胞對胰 酶的耐受性不同。 錢永清等報道，所用的Vero細(xì)胞可耐受60ug/ml的胰蛋白酶， 且適應(yīng)Vero細(xì)胞生長的病毒，亦可在PK15、IBRS-2以及ST 細(xì)胞中在不加胰蛋白酶條件下均可生長。 Hofinann,Ishikawa K,K weonCH等人分別報道濃度為5 10ug/ml胰蛋白酶是細(xì)胞所能耐受的濃度。而且Hofinann和 Wyler等通過實(shí)驗(yàn)表明不加胰酶培養(yǎng)PEDV是，病毒感染細(xì)胞 的能力會大大減弱，如此連續(xù)培養(yǎng)幾代后

27、，會使病毒在細(xì)胞上 豬流行性腹瀉病毒 發(fā)生丟失。 許多學(xué)者也報道了，PEDV在細(xì)胞上產(chǎn)生的病變不明顯，特別 是在最初幾代的培養(yǎng)更是如此。日本和韓國報道（Ishikawa K 等，Kweon CH等）病毒在Vero細(xì)胞上傳90代以上病變特征仍 不明顯，必須借助于PCR檢測方法才能確定病毒是否生長。而 1988年瑞典Hoffiman等首次在Vero傳代細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入 胰酶，連續(xù)傳5代就出現(xiàn)細(xì)胞病變。 由此看來，不同的研究者對PEDV在細(xì)胞上的病變特征、病變 出現(xiàn)的時間、病毒培養(yǎng)的方法以及接種病毒的Vero細(xì)胞所用的 胰酶濃度等試驗(yàn)結(jié)果有一定的差別，這等等一些差別需要我們 病毒組以及質(zhì)檢室所有人

28、積極主動出謀劃策，參與進(jìn)來為能分 離出PEDV做出貢獻(xiàn)。 豬流行性腹瀉病毒 PEDV在Vero細(xì)胞上的病變特征 不同時間段細(xì)胞會出現(xiàn)：細(xì)胞腫脹變圓，折光性增強(qiáng)，顆粒 物質(zhì)增多，細(xì)胞大量脫落崩解，細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞拉成網(wǎng) 狀。細(xì)胞產(chǎn)生大的空泡，細(xì)胞融合，表現(xiàn)為多核細(xì)胞等病 變。 豬流行性腹瀉病毒 PED病毒的分離的方法 待檢糞便樣品研磨（PBS 110，PH=7.4） 勻漿凍融2-3次后，2000-12000rpm， 4離心15-30min 收集上清0.22um過濾，分裝成小份-70 保存。（加2雙抗） 取1ml接于已經(jīng)長滿單層的Vero-E6細(xì)胞。（接種之前先倒掉 細(xì)胞生長液，并用含5ug/ml胰酶的DMEM維持液洗兩遍） 吸附1小時，同時設(shè)細(xì)胞對照 豬流行性腹瀉病毒 倒掉并內(nèi)的病毒液，用DMEM維持液洗兩遍（不含血 清的DMEM) 也可以根據(jù)情況不倒掉病毒液，或不洗細(xì)胞。 （需要摸索） 加入含5ug/ml胰酶濃度的DMEM維持液 每天觀察2-3次 一般72小時收獲病毒液 豬流行性腹瀉病毒 RT-PCR適時監(jiān)測病毒在 細(xì)胞內(nèi)增殖的情況 繼續(xù)用收獲的病毒液傳代（收獲的病毒可以凍融之后 接種） 豬流行性腹瀉病毒 結(jié)果 別人的結(jié)果： 套式PCR監(jiān)測 豬流行性腹瀉病毒 不同時間（12h、24h、48h）段細(xì)胞變化 豬流行性腹瀉病毒 豬流行性腹瀉病毒 以上就是在Vero細(xì)胞上接