滑膜炎顆粒對(duì)關(guān)節(jié)炎的治療作用

1、滑膜炎顆粒對(duì)關(guān)節(jié)炎的治療作用 中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志2014年第六期 1材料與方法 1.1實(shí)驗(yàn)方法 1.1.1實(shí)驗(yàn)分組動(dòng)物購(gòu)進(jìn)后適應(yīng)性喂養(yǎng)2d制備cia模型，成模后根據(jù)造模及給藥情況進(jìn)行隨機(jī)分組，分為8組，每組1112只大鼠，分別為對(duì)照組()、不完全弗氏佐劑組()、模型組()、雷公藤多苷組()、醋酸潑尼松龍組()、滑膜炎顆粒大劑量組()、中劑量組()、小劑量組()。 1.1.2主要試劑配制型膠原配置:取適量牛型膠原溶液逐滴加入等容積的不完全弗氏佐劑中，勻漿器分散使其充分乳化，以滴入水中不擴(kuò)散為標(biāo)準(zhǔn)，配成濃度為1mg/ml的乳劑，以上操作均在冰浴中進(jìn)行。 1.13cia模型的制備參照文獻(xiàn)2，取型膠

2、原乳劑注射于大鼠尾根部皮下，0.2ml/只。7d后加強(qiáng)免疫1次，0.1ml/只注射于大鼠尾根部皮下;對(duì)照組注射生理鹽水，佐劑組注射不完全弗氏佐劑。造模成功后，按足趾腫脹度調(diào)整各造模組動(dòng)物，剔除未成模大鼠。 1.1.4給藥方法加強(qiáng)免疫6d后開(kāi)始給藥，對(duì)照組、不完全弗氏佐劑組及模型組給予等體積純水。雷公藤多苷片9.45mg/kg，醋酸潑尼松龍2.70mg/kg，滑膜炎顆粒分為大、中、小3個(gè)給藥劑量，分別為9.68g生藥/kg、4.84g生藥/kg、2.42g生藥/kg。給藥體積1ml/100g，每天1次，連續(xù)灌胃給藥36d，每周監(jiān)測(cè)體質(zhì)量1次。 1.1.5足趾容積測(cè)定致炎前在大鼠后肢踝關(guān)節(jié)上方0.

3、5cm處劃一水平標(biāo)志線(xiàn)，用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量其容積，左手握住大鼠前肢，右手捉住大鼠后膝關(guān)節(jié)處使其后腳伸直，以?xún)x器托手架做依托，緩慢放入測(cè)量杯內(nèi)，當(dāng)水平面與鼠足部測(cè)量標(biāo)線(xiàn)重疊時(shí)按下測(cè)量開(kāi)關(guān)。加強(qiáng)免疫后每3d測(cè)1次足趾容積，計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹度。腫脹度=(造模后左后足容積+造模后右后足容積)(造模前左后足容積+造模前右后足容積)。 1.1.6關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分給藥開(kāi)始進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，每3d1次。關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):前爪:關(guān)節(jié)的炎癥(無(wú)0分，有1分);后爪:腫脹(無(wú)0分，輕度1分，中度2分，重度3分);指掌關(guān)節(jié)變形(無(wú)0分，有1分)，前爪和后爪指(趾)紅腫(無(wú)0分，有1分);跖骨變形(無(wú)0分，有1分)3，

4、4。 1.1.7踝關(guān)節(jié)病理形態(tài)改變末次給藥后24h處死動(dòng)物，取踝關(guān)節(jié)固定于10%的福爾馬林溶液中，脫鈣后常規(guī)石蠟包埋、切片、he染色觀察踝關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)改變。根據(jù)關(guān)節(jié)各部位病變輕重程度建立定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)5:依次定量為1分(輕度或少量)、2分(中度或多量)、3分(重度或大量)，無(wú)病變組織為0分。累加各單項(xiàng)評(píng)分即為損傷總分，得分越高即表明損傷程度越嚴(yán)重，并對(duì)各單項(xiàng)評(píng)分及總分進(jìn)行組間比較。 1.1.8流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠t細(xì)胞亞群按試劑盒說(shuō)明操作，末次給藥后24h腹主動(dòng)脈取血處死大鼠，收集edta抗凝大鼠全血200l，分別加入apc標(biāo)記的cd3抗體、pe標(biāo)記的cd4抗體和fitc標(biāo)記的cd8抗體，室溫避光孵

5、育30min，加入2.0ml裂解液輕輕振蕩，室溫孵育15min，200xg，離心5min棄上清，加入2ml含1%胎牛血清的pbs重懸血細(xì)胞懸液，200xg，離心5min棄上清，重懸細(xì)胞懸液于0.5mlpbs中，上機(jī)檢測(cè)。 1.2統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用graphpadprism4.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(x珋s)表示，組間比較采用單因素方差分析，p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2結(jié)果 2.1滑膜炎顆粒對(duì)cia大鼠體質(zhì)量的影響圖1顯示，造模后隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，各組動(dòng)物體質(zhì)量均增加，但模型組及各給藥組體質(zhì)量增加較空白對(duì)照組緩慢，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。各給藥組體質(zhì)量高

6、于模型組，但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.2滑膜炎顆粒對(duì)cia大鼠足趾腫脹度影響測(cè)量造模前后大鼠足趾容積比較各組大鼠足腫脹情況，結(jié)果表明加強(qiáng)免疫后6d，各造模組動(dòng)物足趾出現(xiàn)不同程度腫脹，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，所有大鼠足腫脹程度均有不同程度減輕，各給藥組動(dòng)物足腫脹程度較模型組減輕更明顯。其中組tgt組給藥12d時(shí)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);組醋酸潑尼松龍組于給藥6d起，足趾腫脹度減輕明顯，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);組滑膜炎中劑量組給藥后15d、18d、24d、27d、30d、33d與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0

7、.01或p0.05，圖2)。 2.3滑膜炎顆粒對(duì)cia大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)影響關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分結(jié)果顯示，對(duì)照組、佐劑組大鼠關(guān)節(jié)無(wú)改變，各造模組動(dòng)物關(guān)節(jié)紅腫、變形，隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)各組關(guān)節(jié)紅腫情況逐漸減輕，其中組雷公藤多苷片組給藥12d、21d關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分于模型組，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01，p0.05);給藥36d關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分高于模型組，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。、組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分均低于模型組，其中組醋酸潑尼松龍組于給藥6d開(kāi)始，關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);，組滑膜炎大劑量組于給藥12d、21d、24d關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分與模型組比較，差異有統(tǒng)

8、計(jì)學(xué)意義(p0.05或p0.01);組于給藥12d、21d、24d、30d與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01，圖3)。 2.4滑膜炎顆粒對(duì)cia大鼠踝關(guān)節(jié)病理形態(tài)學(xué)變化的影響圖4顯示，正常對(duì)照組、不完全佐劑組關(guān)節(jié)及滑膜結(jié)構(gòu)正常，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整，無(wú)炎細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，無(wú)血管翳形成。模型組關(guān)節(jié)腔明顯變窄，tpt、潑尼松龍和滑膜炎各劑量組出現(xiàn)滑膜、軟骨、纖維組織及小血管增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但較模型組有明顯改善(圖4)。根據(jù)關(guān)節(jié)各部位病變輕重程度建立定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(如表1)，各給藥組病理?yè)p傷與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.5滑膜炎顆粒對(duì)cia大鼠t細(xì)胞亞群影響表2顯示，流式細(xì)胞儀

9、檢測(cè)各組大鼠外周血t細(xì)胞亞群的變化，結(jié)果顯示模型動(dòng)物和各給藥組cd3+t(tt)細(xì)胞總數(shù)在外周血t細(xì)胞所占的百分比與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組th細(xì)胞在cd3+t細(xì)胞中所占百分比顯著高于正常對(duì)照組，、組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01，p0.05);滑膜炎顆粒各給藥組th細(xì)胞百分比均較模型組有所下降，但與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各組大鼠tc細(xì)胞在cd3+t細(xì)胞中所占比例顯著低于正常對(duì)照組，、組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01，p0.05);各組大鼠th/tc的比值明顯高于對(duì)照組，、組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);滑膜炎顆粒各給藥組th/tc比值均較模型

10、組有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3討論 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，因陽(yáng)氣受損、腠理空虛、衛(wèi)氣不固、風(fēng)寒濕邪乘虛侵襲肌膚，致氣血凝滯、經(jīng)絡(luò)痹阻，從而導(dǎo)致患部腫脹疼痛，關(guān)節(jié)僵硬變形。在ra中滑膜的持續(xù)性增生、軟骨和骨組織的破壞是其重要的病理學(xué)特征。目前ra動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，主要采用佐劑性關(guān)節(jié)炎模型(aa)和cia模型。模型大鼠關(guān)節(jié)病理觀察顯示，cia大鼠滑膜增生、軟骨破壞、炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度較aa大鼠明顯，持續(xù)時(shí)間也較aa模型長(zhǎng)，與ra臨床特點(diǎn)更接近1。故本實(shí)驗(yàn)采用型膠原大鼠尾根部注射，制備cia模型。造模后大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，較對(duì)照組體質(zhì)量明顯降低，加強(qiáng)免疫后6d，大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫、活動(dòng)受

11、限，隨著病程進(jìn)展，受累關(guān)節(jié)出現(xiàn)不同程度變形，提示cia模型成功。糖皮質(zhì)激素在ra急性期能迅速減輕關(guān)節(jié)疼痛和腫脹癥狀。雷公藤多苷具有抗炎及免疫抑制作用，廣泛用于ra的治療6，故本實(shí)驗(yàn)選取醋酸潑尼松龍與雷公藤多苷片作為西藥和中藥陽(yáng)性對(duì)照藥物，二者對(duì)cia模型呈現(xiàn)出較好的治療作用。然而隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，雷公藤多苷片組關(guān)節(jié)變形改善較差，故給藥36d時(shí)關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分高于模型組。滑膜炎顆粒功效清熱利濕、活血通絡(luò)，用于治療急、慢性滑膜炎，其中夏枯草、薏苡仁、防己、澤蘭、黃芪促進(jìn)積液吸收;土茯苓、豨薟草、絲瓜絡(luò)改善關(guān)節(jié)活動(dòng)度;川牛膝、丹參、當(dāng)歸消腫止痛;女貞子、功勞葉強(qiáng)壯關(guān)節(jié)7。本實(shí)驗(yàn)滑膜炎顆粒各劑量組能夠改

12、善足趾腫脹程度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，高劑量組(9.68g生藥/kg)、中劑量組(4.84g生藥/kg)與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，小劑量組也呈現(xiàn)較好的治療趨勢(shì)。踝關(guān)節(jié)病理切片顯示，模型組關(guān)節(jié)腔明顯變窄，軟骨、纖維組織及小血管增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜炎顆粒各給藥組能夠不同程度改善上述癥狀，踝關(guān)節(jié)病理形態(tài)變化評(píng)分低于模型組，表明滑膜炎顆粒對(duì)ra滑膜損傷具有較好的治療作用，與整體足趾腫脹程度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)的檢測(cè)結(jié)果相一致。 t淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的主要調(diào)節(jié)及效應(yīng)細(xì)胞，根據(jù)其表面標(biāo)志不同成熟t細(xì)胞可分為2個(gè)亞類(lèi)，即cd4+t細(xì)胞和cd8+t細(xì)胞。cd4+t細(xì)胞按其功能可分為輔助性t細(xì)胞(th)和遲發(fā)型

13、超敏性t細(xì)胞(tdth)，前者為調(diào)節(jié)性t細(xì)胞，后者為效應(yīng)性t細(xì)胞。cd8+t細(xì)胞也是不均一的細(xì)胞群，按其功能分為抑制性t細(xì)胞(ts)和殺傷性t細(xì)胞(tc)，前者為調(diào)節(jié)性t細(xì)胞，后者為效應(yīng)性t細(xì)胞。近年來(lái)，分泌白介素17的cd4+t細(xì)胞亞群(th17細(xì)胞)被認(rèn)為與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病密切相關(guān)，ra患者體內(nèi)以cd3+cd4+t淋巴細(xì)胞亞群異常增加為特征，異常活化的cd3+cd4+t淋巴細(xì)胞通過(guò)釋放大量促炎性細(xì)胞因子加速病灶部位的組織損傷8。本研究各造模組大鼠th細(xì)胞百分比、th/tc均高于空白對(duì)照組，tc細(xì)胞百分比均低于對(duì)照組，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致?；ぱ最w粒各給藥組th細(xì)胞百分比、th/tc均低于模型組，tc細(xì)胞百分比均高于模型組，說(shuō)明滑膜炎顆粒對(duì)cia大鼠關(guān)節(jié)損傷治療作用與降低th細(xì)胞百分比相關(guān)。而潑尼松龍組th細(xì)胞百分比、th/tc與模型組大體相當(dāng)，說(shuō)明其治療ra作用與th