微生物綜合實(shí)驗(yàn)報(bào)告1

1、微生物綜合實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)題目：檢測(cè)水中大腸桿菌群數(shù)量組員姓名：鄭偉周宇作者單位：南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院摘要：實(shí)驗(yàn)采用自來(lái)水作為樣品，利用多管發(fā)酵法對(duì)樣品進(jìn)行培養(yǎng),接種，分離，純化，得到具有不同特征的腸桿菌。通過(guò)對(duì)腸桿菌的數(shù)量和形態(tài)特征的分析，確定自來(lái)水是否被污染和污染程度。關(guān)鍵詞：水源；腸桿菌；多管發(fā)酵；數(shù)量；污染前言：水是制藥和食品行業(yè)使用最為廣泛的原料，也是我們?nèi)粘Ｉ铍x不開的、賴以生存的基礎(chǔ)。水與藥品、食品中的其他原料一樣，必須符合既定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，如果水被污染就會(huì)影響多批次產(chǎn)品。另外，對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，水是各種培養(yǎng)基、緩沖液、檢測(cè)劑的主要組成部分。必須嚴(yán)格控制水的微生物學(xué)質(zhì)量，以

2、保證醫(yī)藥食品產(chǎn)品、培養(yǎng)基、試劑等的質(zhì)量的可靠性以及人類用水的安全。制藥用水微生物監(jiān)測(cè)是為了監(jiān)控控制性微生物從而將水中微生物含量維持在一定水平。沒有必要將水中存在的所有微生物都監(jiān)測(cè)出來(lái)，只針對(duì)對(duì)產(chǎn)品對(duì)人具有潛在危害的致病性的微生物進(jìn)行監(jiān)控。流行病學(xué)研究確認(rèn)，水?dāng)y帶的病原菌的存在與腸道來(lái)源的細(xì)菌相關(guān)，腸道病原微生物進(jìn)入水體，隨水流傳播可引起腸道病爆發(fā)流行，所以必須對(duì)水中病原微生物嚴(yán)格監(jiān)控。但要從水體中直接檢出病原微生物比較困難，它們?cè)谒械臄?shù)量很少且培養(yǎng)條件苛刻，分離和鑒別都比較難，即使樣品檢測(cè)結(jié)果是陰性也不能保證沒有病原微生物的存在。因此，常用指示微生物作為水體中病原微生物的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。大腸菌群細(xì)

3、菌在人的腸道和糞便中數(shù)量很多，受到糞便污染的水容易被檢出，且檢測(cè)方法比較簡(jiǎn)易。所以，常以大腸菌群為微生物評(píng)價(jià)水的衛(wèi)生質(zhì)量。大腸菌群是一群需氧或兼性厭氧的、在37培養(yǎng)2448h 能發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，包括埃希菌屬（escherichia)、檸檬酸桿菌屬（citrobacter）、腸桿菌屬（enterobacter）、克雷伯菌屬（klebsiella）。大腸菌群數(shù)是指每升水中含有的大腸菌群的近似值，根據(jù)水中大腸菌群的數(shù)目即可判斷水源是否被糞便污染，并推斷水源受腸道病原菌污染的可能性。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)多管發(fā)酵法檢測(cè)水中大腸菌群的數(shù)量。1、材料和方法1.1 材料：1.1.1 水樣自來(lái)水1

4、.1.2 培養(yǎng)基乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨2.4g；牛肉膏0.72g；乳糖1.2g；氯化鈉1.2g；1.6%溴甲酚紫溶 液0.24ml；蒸餾水240ml；ph7.4（分裝于試管中，內(nèi)含倒置杜氏小管）。 3倍濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨1.05g；牛肉膏0.315g；乳糖0.525g；氯化鈉0.525g；1.6%溴甲酚紫溶液0.105ml；蒸餾水35ml；ph7.4（分裝于試管中，內(nèi)含倒置杜氏小管）。伊紅-美籃(emb)培養(yǎng)基：伊紅-美籃(emb)培養(yǎng)基粉末4.24g；蒸餾水100ml；ph7.2。1.1.3 滅菌水作陰性對(duì)照。1.1.4 接種大腸埃希菌的水樣作陽(yáng)性對(duì)照。1.1.5 試劑盒染色劑草

5、酸銨結(jié)晶紫染液、路歌碘液、番紅染液。1.1.6 儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、高壓蒸汽滅菌儀等。1.1.7 其他滅菌移液管、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、香柏油、二甲苯、無(wú)菌水、擦鏡紙等。1.2 實(shí)驗(yàn)方法：1.2.1 初發(fā)酵試驗(yàn)1.2.1.1 標(biāo)記試管取5支3倍濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基試管，標(biāo)記加水量10ml；5支乳糖蛋白胨培養(yǎng)基試管，標(biāo)記加水量1ml；5支乳糖蛋白胨培養(yǎng)基試管，標(biāo)記加水量0.1ml。取2支3倍濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基試管，標(biāo)記陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照和加樣量10ml；2支乳糖蛋白胨培養(yǎng)基試管，標(biāo)記陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照和加樣量1ml；2支乳糖蛋白胨培養(yǎng)基試管，標(biāo)記陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照和加樣量

6、0.1ml。1.2.1.2 接種用移液槍分別取10ml水樣加入標(biāo)記好的3倍濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基試管內(nèi)；分別取1ml水樣加入標(biāo)記好的乳糖蛋白胨培養(yǎng)基試管內(nèi)；分別取0.1ml水樣加入標(biāo)記好的乳糖蛋白胨培養(yǎng)基試管內(nèi)，輕輕搖勻。1.2.1.3 制備陽(yáng)性對(duì)照 用移液槍分別取接種e.coli的水樣10ml、1ml、0.1ml加入以上標(biāo)記好的試管中。 1.2.1.4 制備陰性對(duì)照用移液槍分別取滅菌水10ml、1ml、0.1ml加入以上標(biāo)記好的試管中。1.2.1.5 培養(yǎng)將以上接種后的所有試管放入37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。1.2.1.6 觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察記錄各加水量產(chǎn)酸產(chǎn)氣的試管數(shù)，即為陽(yáng)性管數(shù)。若有a支3倍濃

7、度培養(yǎng)基試管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有b支1倍濃度培養(yǎng)基加水量1ml的試管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有c支1倍濃度培養(yǎng)基加水量0.1ml的試管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則陽(yáng)性組合為a-b-c。根據(jù)大腸菌群存在的管數(shù)查大腸菌群檢數(shù)表得出每100ml水樣中大腸菌群 mpn，報(bào)告每升水樣中大腸菌群數(shù)。對(duì)于表中未列出的組合，可利用thomas公式計(jì)算最大可能數(shù)。mpn/100ml=(陽(yáng)性管數(shù)*100）/exq（陰性管中水樣體積*全部試管中水樣體積）單位（ml）1.2.2 平板分離1.2.2.1 劃線接種將產(chǎn)酸產(chǎn)氣試管中的培養(yǎng)物在emb平板上進(jìn)行劃線接種，于37培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h1.2.2.2 觀察培養(yǎng)后的菌落特征菌落特征類型：菌落深紫色，有金屬光澤

8、典型大腸菌群菌落；菌落深紫色，無(wú)金屬光澤典型大腸菌群菌落；菌落粉紅色，黏稠狀，不透明非典型大腸菌群菌落；其他特征。1.2.2.3 鏡檢挑選呈以上三種菌落特征的菌種進(jìn)行革蘭氏染色，用顯微鏡觀察革蘭氏染色結(jié)果和有無(wú)芽孢。1.2.3 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 1.2.3.1 再次接種 將鏡檢確認(rèn)為革蘭氏陰性、無(wú)芽孢的菌落接種于乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中，于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。1.2.3.2 觀察結(jié)果觀察培養(yǎng)24h后的菌種產(chǎn)酸產(chǎn)氣的情況，產(chǎn)酸產(chǎn)氣的可最終確認(rèn)為大腸菌群菌落1.2.3.3 計(jì)算結(jié)果根據(jù)復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果再次計(jì)算100ml水樣中大腸菌群 mpn 。2、結(jié)果與分析2.1 初發(fā)酵結(jié)果2支3倍濃度培養(yǎng)基試管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有2支1倍濃度培養(yǎng)基加水量1ml的試管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有0支1倍濃度培養(yǎng)基加水量0.1ml的試管產(chǎn)酸產(chǎn)氣,所以陽(yáng)性組合為 2-2-0。查附表得每100ml水樣中大腸菌群mpn為9。2.2 平板分離結(jié)果2板3倍濃度培養(yǎng)基試管中的菌群劃線接種得到深紫色、有金屬光澤的菌群，2板1倍濃度培養(yǎng)基加水量0.1ml的試管中的菌群劃線接種得到深紫色、有金屬光澤的菌群。2.3 復(fù)發(fā)酵結(jié)果鏡檢確認(rèn)為革蘭氏陰性、無(wú)芽孢桿菌的菌落再次接種的結(jié)果全部為產(chǎn)酸產(chǎn)氣，即可以確認(rèn)為大腸菌群菌落