雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)_2

1、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)名稱：雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí)：熒光素酶（英文名稱：luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱，其中最有代表性的是一種學(xué)名為photinus pyralis的螢火蟲體內(nèi)的熒光素酶。在相應(yīng)化學(xué)反應(yīng)中，熒光的產(chǎn)生是來自于螢光素的氧化，有些情況下反應(yīng)體系中也包括三磷酸腺苷（atp）。沒有熒光素酶的情況下，螢光素與氧氣反應(yīng)的速率非常慢，而鈣離子的存在常?？梢赃M(jìn)一步加速反應(yīng)（與肌肉收縮的情況相似）。雙報(bào)告基因用于實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中作相關(guān)的或成比例的檢測(cè)，通常一個(gè)報(bào)告基因作為內(nèi)對(duì)照, 使另一個(gè)報(bào)告基因的檢測(cè)均一化。檢測(cè)基因表達(dá)時(shí)雙報(bào)告基因通常用來瞬時(shí)轉(zhuǎn)

2、染培養(yǎng)細(xì)胞，帶有實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因的載體共轉(zhuǎn)染帶有不同的報(bào)告基因作為對(duì)照的第二個(gè)載體。通常實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因偶聯(lián)到調(diào)控的啟動(dòng)子, 研究調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)和生理基礎(chǔ)。報(bào)告基因表達(dá)活力的相對(duì)改變與偶聯(lián)調(diào)控啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活力的改變相關(guān)，偶聯(lián)到組成型啟動(dòng)子的第二個(gè)報(bào)告基因，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對(duì)照, 使測(cè)試不被實(shí)驗(yàn)條件變化所干擾。通過這種方法, 可減少內(nèi)在的變化因素所削弱的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性, 比如, 培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目和活力的差別,細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率。理想的雙報(bào)告基因方法應(yīng)該使用戶能夠以螢火蟲熒光素酶所具有的速度,靈敏和線性范圍對(duì)同一樣品中的兩個(gè)報(bào)告基因同時(shí)測(cè)定。 這在傳統(tǒng)的報(bào)告基因, 如cat, -gal和gus是不可能的, 由于

3、它們測(cè)試化學(xué),處理要求所固有的局限。相反, 結(jié)合螢火蟲( photinus pyralis ) 和海洋腔腸( renilla reniformis ) 雙熒光素酶的系統(tǒng)可滿足這些要求，在單管中完成這些測(cè)試。 實(shí)驗(yàn)原理：將目的基因3utr區(qū)域或者lncrna序列構(gòu)建至載體中報(bào)告基因luciferase的后面，構(gòu)建熒光素酶質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，通過比較過表達(dá)或者干擾mirna后，檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)的改變（以螢火蟲熒光素酶為報(bào)告基因，以海腎熒光素酶為內(nèi)參基因）可以定量反映mirna對(duì)目的基因的抑制作用。結(jié)合定點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確定mirna與靶基因3utr的作用位點(diǎn)。從這兩個(gè)圖譜中可以發(fā)現(xiàn)，ppgl

4、3-basic這個(gè)載體主要是用于評(píng)估m(xù)irna與靶基因3utr的結(jié)合，靶基因的3utr放在熒光素酶的后面，這個(gè)熒光素酶是熒火蟲熒光素酶，而prl-tk這個(gè)載體則表達(dá)海腎熒光素酶，將這兩個(gè)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染進(jìn)入293細(xì)胞中來檢測(cè)熒光時(shí)，prl-tk這個(gè)質(zhì)粒起到一個(gè)內(nèi)參的作用。3、pmir-glo將熒火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶構(gòu)建到一個(gè)載體上，偏差更小且單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染更簡(jiǎn)單。該質(zhì)粒也是由promega公司開發(fā)的，圖譜如下所示：螢光素酶是理想的報(bào)告基因，因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞中不含內(nèi)源性螢光素酶，一旦轉(zhuǎn)錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶，同時(shí)在所有的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，它的光產(chǎn)物具有 最高的量子效率，檢測(cè)靈

5、敏度高。熒光素酶報(bào)告基因被廣泛用于mirna靶基因驗(yàn)證。 熒光素酶報(bào)告基因的原理在于mirna主要通過作用于靶基因的3utr起作用，可以將目的基因3utr區(qū)域構(gòu)建至pgl3-basic 載體中報(bào)告基因luciferase的后面，構(gòu)建熒光素酶質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，通過比較過表達(dá)或者干擾mirna后，檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)的改變（監(jiān)測(cè)螢光素酶的活性變化）可以定量反映mirna對(duì)目的基因的抑制作用。結(jié)合定點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確定mirna與靶基因3utr的作用位點(diǎn)。同時(shí)，為了減少內(nèi)在的變化因素，比如：培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（rinilla luci

6、ferase）的質(zhì)粒（phrl-tk）作為對(duì)照質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提供轉(zhuǎn)錄效率的內(nèi)對(duì)照，使測(cè)試結(jié)果不受實(shí)驗(yàn)條件變化的干擾。在測(cè)量過程中，首先加入熒光素酶檢測(cè)試劑luciferase assay reagent ii時(shí)產(chǎn)生螢火蟲熒光信號(hào)，這樣先測(cè)量螢火蟲熒光素酶活性。定量螢火蟲熒光強(qiáng)度之后，再在同一樣品中加入stop&glo reagent試劑，將上述反應(yīng)淬滅，并同時(shí)啟動(dòng)海腎熒光素酶反應(yīng)，進(jìn)行第二次測(cè)量，稱之為雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)步驟：一、樣品準(zhǔn)備：1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞（1）細(xì)胞鋪板：將細(xì)胞按50%的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)12孔板內(nèi)。 （2）轉(zhuǎn)染：16h左右細(xì)胞約70%時(shí)轉(zhuǎn)染螢光素酶

7、報(bào)告基因質(zhì)粒，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。首先設(shè)計(jì)四組： 1. 空白組（轉(zhuǎn)染試劑+細(xì)胞）2. 質(zhì)粒組3. 質(zhì)粒+mirna nc組4. 質(zhì)粒+mirna mimics組2.1配制質(zhì)粒組：按照每空50ng質(zhì)粒，同時(shí)每孔20ul無血清培養(yǎng)基計(jì)算需用量，標(biāo)記為a。2.2配制mirna nc/mimics：mirna nc/mimics的終濃度為20nm，同時(shí)每孔20ul無血清培養(yǎng)基計(jì)算需用量，分別標(biāo)記為b、c。2.3配制對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)染試劑：按照每孔0.5l轉(zhuǎn)染試劑,同時(shí)每孔20ul 無血清培養(yǎng)基計(jì)算需用量，標(biāo)記為d。2.3稀釋好的四組試劑常溫孵育5min。2.4將稀釋好的質(zhì)粒dna和mirna mimics分別

8、和對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)染試劑混勻，常溫孵育20min。2.5將2.4步驟中試劑對(duì)應(yīng)加入孔中。2.6轉(zhuǎn)染6h后，換新鮮完全培養(yǎng)基。2雙報(bào)告基因檢測(cè)（1）質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染36-48h后，棄去培養(yǎng)基，用100l 1xpbs清洗細(xì)胞。（2）傾斜12孔板，吸干剩余的pbs。 （3）去離子水將5xplb(裂解液)稀釋成1xplb（現(xiàn)配現(xiàn)用），使用前放到常溫。 （4）每孔加50l稀釋好的1x plb，置搖床振搖20-30min以保證裂解緩沖液完全裂解細(xì)胞。（5）選用白色不透光的96孔酶標(biāo)板中每孔加步驟4的上清液10l，加入100l預(yù)先混好的luciferase assay reagent ii，2s后測(cè)數(shù)據(jù)，檢測(cè)熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。注意此步需在避光條件下進(jìn)行。（6）測(cè)定結(jié)束后，每孔添加100l預(yù)先混好的stop&glo reagent，靜止2s后，測(cè)數(shù)據(jù)，檢測(cè)內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。（7）記錄讀數(shù):每個(gè)樣品會(huì)有3個(gè)數(shù)值：rlu1螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度, rlu2內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度,計(jì)算兩組數(shù)據(jù)比值，即rlu1/rlu2。（8）分析數(shù)據(jù)：比較1、2組可以發(fā)現(xiàn)由于對(duì)照組未轉(zhuǎn)