免疫熒光技術(shù)2

1、免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù) （immunofluorescence technique,IFA)immunofluorescence technique,IFA) 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)1301班班 楊小玉楊小玉 主要內(nèi)容 一.免疫熒光技術(shù)概念 原理 二.免疫熒光技術(shù)的基本條件 三.經(jīng)典熒光抗體染色法 四.現(xiàn)代免疫熒光技術(shù) 一一. .免疫熒光技術(shù)的概念及原理免疫熒光技術(shù)的概念及原理 概念：免疫熒光技術(shù)是將熒光素的敏感可測(cè)性,抗原抗體反應(yīng)的可 測(cè)性以及顯微技術(shù)高度精確性相結(jié)合的一種免疫標(biāo)記測(cè)定技術(shù)。 免疫熒光技術(shù)原理 免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或 抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這

2、種熒光抗體（或抗 原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。 在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素， 利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來(lái)激發(fā)光的照射而發(fā)生 明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見(jiàn)熒光所在的組織細(xì) 胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè) 定含量。 二二. .免疫熒光技術(shù)的基本條件免疫熒光技術(shù)的基本條件 （一）熒光素 （二）待標(biāo)記抗體的標(biāo)準(zhǔn) （三）熒光標(biāo)記抗體的制備 （四）熒光標(biāo)記抗體的純化與鑒定 （一）熒光素 （一）熒光素:一種有機(jī)或無(wú)機(jī)的化學(xué)物質(zhì)，其接受激發(fā)光的光 能以后，能夠以發(fā)射光形式產(chǎn)生明亮的熒光而作為染料使用。各 種熒光素都有各

3、自的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。因發(fā)射波長(zhǎng)不同，熒 光顏色各異。 熒光素及其性質(zhì)：熒光素具有共軛雙鍵體系的化學(xué)結(jié)構(gòu)。熒光素 通常處于最低的能量狀態(tài)，稱(chēng)為基態(tài)（ground state)。當(dāng)熒光素 受到紫外光或可見(jiàn)光的短波部分（紫光和藍(lán)光）作為激發(fā)光照射 時(shí)，會(huì)吸收合適波長(zhǎng)的電磁波，其外層 電子即進(jìn)入更高能量的 軌道，從而處于激發(fā)態(tài)（excited state)。 熒光素的熒光特性： （1）停止供能，熒光現(xiàn)象隨即終止 （2）對(duì)光的吸收和熒光的發(fā)射具高度選擇性入射光波長(zhǎng)發(fā)射光 波長(zhǎng) （3）熒光效率：熒光效率=發(fā)射熒光的光量子數(shù) /吸收光的光量 子數(shù) （4）熒光猝滅現(xiàn)象：熒光素的輻射能力減弱 常見(jiàn)熒光素：

4、1）異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) ：FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水 和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。 FITC分子量為389.4，最大吸收光波長(zhǎng)為490495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃 綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對(duì)黃綠 色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。 （2）四乙基羅丹明 (rhodamine, RB200) ：RB200為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和 丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)

5、期保存。最大吸收光波長(zhǎng)為 570nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為595 600nm，呈現(xiàn)橘紅色熒光。 （3）四甲基異硫氰酸羅丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC為羅丹明 的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定。最大吸收光波長(zhǎng)為 550nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm， 呈現(xiàn)橙紅色熒光，與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。因?熒光淬滅慢，也可用于單獨(dú)標(biāo)記染色。 （5）藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在紅藻中所發(fā)現(xiàn)的一種可進(jìn)行光合作用的自 然熒光色素，分子量為240kD的蛋白，最大吸收峰為564

6、 nm，當(dāng)使用488 nm激光激發(fā)時(shí)其 發(fā)射熒光峰值約為576 nm，對(duì)于單激光器的流式細(xì)胞儀來(lái)說(shuō)，推薦使用58521nm的帶通 濾光片，雙激光器的流式細(xì)胞儀推薦使用57513nm的帶通濾光片。FL2探測(cè)器檢測(cè)PE。 常見(jiàn)熒光素的特性： FITC：黃色結(jié)晶粉末，吸收光：490495nm，發(fā)射光520530nm， 明亮的黃綠色熒光。 RB200：橘紅色粉末, 吸收光570nm，發(fā)射光595600nm，橘紅 色熒光。 TRITC：紫紅色粉末，吸收550nm，發(fā)射光620nm，橙紅色熒光。 PE：吸收光490560nm，發(fā)射光595nm，紅色熒光。 FITC 呈黃 綠色 熒光 RB200 呈橘紅 色

7、熒光 色 FITC+RB200 雙標(biāo)記染色法 合適熒光素的選擇： （1）具有與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)。 （2）熒光效率高，標(biāo)記后下降不明顯。 （3）熒光色澤與背景色澤對(duì)比鮮明。 （4）標(biāo)記后能保持生物學(xué)活性和免疫活性 （5）標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、快速。 （6）安全無(wú)毒 （二）待標(biāo)記抗體的標(biāo)準(zhǔn) 用于標(biāo)記的抗體須特異性強(qiáng)，純度高，效價(jià)高，經(jīng)熒光素標(biāo)記后 抗體活性損失少。標(biāo)記前，可用梅花狀瓊脂雙向擴(kuò)散法測(cè)定抗體 效價(jià)，即中央孔加抗原（1mg/ml),周?chē)准颖侗认♂尩目贵w（1： 21：64），抗體效價(jià)在1：32以上較為理想。熒光標(biāo)記的抗體可 以是多克隆抗體或單克隆抗體，亦可以是SPA，后者可作為熒光 二

8、抗的通用試劑。 （三）熒光標(biāo)記抗體的制備 1.FITC標(biāo)記抗體 2.RB200標(biāo)記抗體 3.TRITC標(biāo)記抗體 4.PE標(biāo)記抗體 （1）攪拌標(biāo)記法）攪拌標(biāo)記法 （2）半透膜透析標(biāo)記法）半透膜透析標(biāo)記法 （1）PE巰基化巰基化 （2）IgG與與PE交聯(lián)交聯(lián) （3）殘余巰基的封閉）殘余巰基的封閉 （4）透析平衡）透析平衡 （四）熒光標(biāo)記抗體的純化與鑒定 熒光標(biāo)記抗體的純化 熒光標(biāo)記抗體的鑒定 熒光標(biāo)記物的保存 （1）去除游離熒光素）去除游離熒光素 （2）去除未標(biāo)記和過(guò)度標(biāo)記的抗體）去除未標(biāo)記和過(guò)度標(biāo)記的抗體 （1）抗體和）抗體和熒光的活性鑒定熒光的活性鑒定 （2）熒光素與蛋白質(zhì)的摩爾比值）熒光素與

9、蛋白質(zhì)的摩爾比值 （F/P） （3）熒光抗體濃度的測(cè)定）熒光抗體濃度的測(cè)定 （4）熒光抗體特異性的鑒定）熒光抗體特異性的鑒定 （1）經(jīng)鑒定合格的熒光抗體，可過(guò)濾除菌，也）經(jīng)鑒定合格的熒光抗體，可過(guò)濾除菌，也 可加入防腐劑（可加入防腐劑（0.01%硫柳汞或硫柳汞或0.1%NaN3）或抗）或抗 生素防腐生素防腐 （2）熒光抗體經(jīng)無(wú)菌，小量分裝后置）熒光抗體經(jīng)無(wú)菌，小量分裝后置04可?？杀?存存1年左右，年左右，-20可保存可保存23年，冷凍干燥后可保年，冷凍干燥后可保 存較長(zhǎng)時(shí)間。存較長(zhǎng)時(shí)間。 （3）冷凍取出后應(yīng)快速融化，并避免反復(fù)凍融）冷凍取出后應(yīng)快速融化，并避免反復(fù)凍融。 三三. .經(jīng)典熒光抗

10、體染色法經(jīng)典熒光抗體染色法 一.直接熒光抗體染色法 二.間接熒光抗體染色法 三.補(bǔ)體熒光染色法 四.特殊染色法 一.直接熒光抗體染色法 概念：將熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接滴加于待檢標(biāo)本片上，避 光反應(yīng)和洗滌以后，在熒光顯微鏡下觀察標(biāo)本中是否有相應(yīng)抗原 存在。這是熒光抗體技術(shù)最簡(jiǎn)單，最基本的方法。 二.間接熒光抗體染色法 概念：將熒光素標(biāo)記于抗抗體（熒光二抗）或標(biāo)記葡萄球菌A蛋 白（SPA），以熒光二抗檢測(cè)與抗原結(jié)合的特異性抗體。 檢測(cè)過(guò)程： 第一步：將第一抗體加在含有抗原的標(biāo)本上，避光孵育一定時(shí) 間以后，洗去未結(jié)合的抗體。 第二步：將熒光二抗加在標(biāo)本上，與結(jié)合在抗原上的抗體（一 抗）結(jié)合，形成“抗原抗體熒光二抗”的復(fù)合物 三.補(bǔ)體熒光染色法 概念：將熒光素標(biāo)記在抗補(bǔ)體抗體（抗C3抗體），檢測(cè)抗原抗體 復(fù)合物。此法是間接法的一種改良，利用補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的原理， 在抗原抗體反應(yīng)時(shí)加入補(bǔ)體（多用豚鼠補(bǔ)體），再用熒光素標(biāo)記 的抗C3抗體進(jìn)行示蹤。主要用于檢測(cè)抗體。 檢測(cè)過(guò)程分兩步： 第一步：將待測(cè)抗體和補(bǔ)體加在已知抗原的玻片上，作用一 段時(shí)間后，洗去未結(jié)合的抗體和補(bǔ)體。 第二步：滴加熒光標(biāo)記抗C3抗體。如果在第一步中抗原抗體 發(fā)生特異性結(jié)合，則補(bǔ)體被固定，此時(shí)加入的標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體即與 補(bǔ)體發(fā)生結(jié)合，形成“抗原抗體補(bǔ)體