實驗6 血糖的酶法測定20151109

1、實驗實驗七七 葡萄糖葡萄糖氧化酶法測定血糖含量氧化酶法測定血糖含量 一一. 目的要求目的要求 掌握葡萄糖氧化酶法測定血糖含量的原理與方法。 了解臨床測定血糖的主要方法及意義。 二實驗原理二實驗原理 葡萄糖在葡萄糖氧化酶催化氧化下生成葡萄糖酸，同時生成過氧化 氫（H2O2），后者通過氧化氫酶催化供氫體（底物） 4-氨基安 替比林與酚的反應(yīng)，生成紫紅色的醌亞胺。產(chǎn)物顏色的深淺與血清 中葡萄糖的含量成正比。在同樣條件下，測定標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液和血 清樣品的吸光度（A）值，即可求出血清樣品中葡萄糖的含量。 三器材及試劑三器材及試劑 1. 器材器材: 酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀，移液槍。 2. 試劑試劑: u0.1mm

2、ol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）：稱取Na2HPO4 8.67g, KH2PO4 5.3g, 加蒸餾水800ml，用1mol/L NaOH 或1mmol/L HCl調(diào)節(jié)pH7.0， 用蒸餾水稀釋至1000ml. u標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖貯存液（55.6mmol/L）：將葡萄糖（AR）出于置于 硫酸干燥器內(nèi)過夜后精確稱取1000.0mg，于100ml容量瓶內(nèi)以 0.02mol/L苯甲酸溶液稀釋至刻度，置冰箱可長期保存。 u標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（10mmol/L）：取18.0ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖貯存液防于 100ml容量瓶內(nèi)，用0.02mol/L苯甲酸溶液稀釋至刻度。 三器材及試劑三器材及試劑 1. 器材器材: 酶標(biāo)板

3、，酶標(biāo)儀，移液槍。 2. 試劑試劑: u0.1mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）：稱取Na2HPO4 8.67g, KH2PO4 5.3g, 加蒸餾水800ml，用1mol/L NaOH 或1mmol/L HCl調(diào)節(jié)pH7.0， 用蒸餾水稀釋至1000ml. u標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖貯存液（55.6mmol/L）：將葡萄糖（AR）出于置于 硫酸干燥器內(nèi)過夜后精確稱取1000.0mg，于100ml容量瓶內(nèi)以 0.02mol/L苯甲酸溶液稀釋至刻度，置冰箱可長期保存。 u標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（10mmol/L）：取18.0ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖貯存液防于 100ml容量瓶內(nèi)，用0.02mol/L苯甲酸溶液稀釋至刻度。

4、三器材及試劑三器材及試劑 2. 試劑試劑: 酚試劑：取酚1g溶于1000ml蒸餾水中。 酶試劑：取葡萄糖氧化酶1200U、過氧化氫酶1200U、4-氨基 安替比林10mg、疊氮鈉100mg，加上述磷酸鹽緩沖液80ml，調(diào) 節(jié)pH7.0，再以磷酸鹽緩沖液稀釋至100ml，置冰箱內(nèi)至少可存 放3個月。 酶-酚混合試劑：取等量酶試劑和酚試劑混合。置冰箱內(nèi)可存 放1個月。 3. 樣品樣品 新鮮兔血 四四實驗操作實驗操作 1.兔血清的制備兔血清的制備 兔全血標(biāo)本（每排一份）于37度水浴孵育1小時以上，于離心 機中3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清即可。 2.各組取酶標(biāo)條各組取酶標(biāo)條2個，編號后個，編號后按下

5、表操作，每組各設(shè)按下表操作，每組各設(shè)2個重復(fù)。個重復(fù)。 試劑（試劑（ul）測測定定孔孔標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)孔孔空白空白孔孔 血清血清5 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液5 蒸餾水蒸餾水5 血糖測定（工作液）血糖測定（工作液）195195195 混合各孔溶液，室溫反應(yīng)30min，以空白管調(diào)零，設(shè)測定波長于 550nm，讀取測定管和標(biāo)準(zhǔn)管的A值。 五五計算計算 人人空腹血糖參考值：空腹血糖參考值：3.89-6.11mmol/L （標(biāo)準(zhǔn)液濃度（標(biāo)準(zhǔn)液濃度=10mmol/L） （mmol/L） 六六注意事項注意事項 避免血樣品溶血。 反應(yīng)體系中的過氧化氫酶易受維生素C、谷胱甘肽等的影響。 酶-酚混合試劑應(yīng)在臨用前配制

6、。 移液槍，酶標(biāo)儀的使用。 用移液槍混勻液體的時候盡量不要產(chǎn)生氣泡。 七七思考題思考題 該法的測定原理如何？有何優(yōu)缺點？ 該法的關(guān)鍵反應(yīng)是什么？實驗過程中應(yīng)注意哪些因素？ 八八血糖測定的其他方法血糖測定的其他方法 無機化學(xué)法：Folin-Wu法，基于葡萄糖醛基的還原性 （特異性差） 有機化學(xué)法：鄰甲苯胺法 九九本實驗的臨床意義本實驗的臨床意義 九九本實驗的臨床意義本實驗的臨床意義 血糖血糖水平恒定的生理意義：水平恒定的生理意義： 保證重要組織器官的能量供應(yīng)，特別是某些依賴葡萄糖供能的 組織器官。 腦組織不能利用脂酸，正常情況下主要依賴葡萄糖供能； 紅細胞沒有線粒體，完全通過糖酵解獲能； 骨髓及

7、神經(jīng)組織代謝活躍，經(jīng)常利用葡萄糖供能。 九九本實驗的臨床意義本實驗的臨床意義 血糖水平的平衡主要是受到激素調(diào)節(jié)：血糖水平的平衡主要是受到激素調(diào)節(jié)： 血糖水平保持恒定是糖、脂肪、氨基酸代謝協(xié)調(diào)的結(jié)果，也是 肝、肌、脂肪組織等各器官組織代謝協(xié)調(diào)的結(jié)果。 機體的各種代謝以及各器官之間能這樣精確協(xié)調(diào)，以適應(yīng)能量、 燃料供求的變化，主要依靠激素的調(diào)節(jié)。 酶水平的調(diào)節(jié)是最基本的調(diào)節(jié)方式和基礎(chǔ)。 主要調(diào)節(jié)主要調(diào)節(jié) 激素激素 降低血糖：胰島素降低血糖：胰島素(insulin) 升高血糖：升高血糖：胰高血糖素胰高血糖素(glucagon) 糖皮質(zhì)激素糖皮質(zhì)激素 腎上腺素腎上腺素 九九本實驗的臨床意義本實驗的臨床

8、意義 胰島素胰島素是體內(nèi)唯一降低血糖的激素：是體內(nèi)唯一降低血糖的激素： 胰島素(Insulin)是體內(nèi)唯一的降低血糖的激素，也是唯一同時促 進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。 胰島素的分泌受血糖控制，血糖升高立即引起胰島素分泌；血 糖降低，分泌即減少。 九九本實驗的臨床意義本實驗的臨床意義 血糖血糖水平異常及糖尿病是最常見的糖代謝水平異常及糖尿病是最常見的糖代謝紊亂：紊亂： 正常人體內(nèi)存在一套精細的調(diào)節(jié)糖代謝的機制，在一次性食入大 量葡萄糖后，血糖水平不會出現(xiàn)大的波動和持續(xù)升高。 人體對攝入的葡萄糖具有很大的耐受能力的現(xiàn)象稱為葡萄糖耐量葡萄糖耐量 (glucose tolerence)。 空腹血

9、糖（空腹血糖（FPG）: 3.9-6.1 mmol/L 糖尿病糖尿病 7.0 mmol/L 低血糖低血糖 2.8 mmol/L T1DM (Type I diabetes mellitus) T2DM (Type II diabetes mellitus) 九九本實驗的臨床意義本實驗的臨床意義 臨床臨床上因糖代謝障礙可發(fā)生血糖水平紊亂，常見有以下上因糖代謝障礙可發(fā)生血糖水平紊亂，常見有以下 兩種類型兩種類型： 低血糖低血糖 (hypoglycemia) 高血糖高血糖 (hyperglycemia) 九九本實驗的臨床意義本實驗的臨床意義 低血糖：低血糖：血糖濃度低于2.8mmol/L 低血糖的危

10、害：低血糖的危害： 低血糖影響腦的正常功能，因為腦細胞所需要的能量主要 來自葡萄糖的氧化。當(dāng)血糖水平過低時，就會影響腦細胞的功 能，從而出現(xiàn)頭暈、倦怠無力、心悸等，嚴(yán)重時出現(xiàn)昏迷，稱 為低血糖休克。如不及時給病人靜脈補充葡萄糖，可導(dǎo)致死亡。 九九本實驗的臨床意義本實驗的臨床意義 低血糖：低血糖：血糖濃度低于2.8mmol/L 低血糖低血糖的原因的原因： 胰性(胰島-細胞機能亢進、胰島-細胞機能低下等)； 肝性（肝癌、糖原累積病等）； 內(nèi)分泌異常（垂體機能低下、腎上腺皮質(zhì)機能低下等）； 腫瘤（胃癌等）； 饑餓或不能進食者等。 九九本實驗的臨床意義本實驗的臨床意義 高血糖：高血糖：空腹血糖高于6.1mmol/L 臨床上將空腹血糖濃度高于6.1mmol/L 稱為高血糖 (hyperglycemia)。 當(dāng)血糖濃度超過了腎小管的重吸收能力(腎糖閾)，則可出現(xiàn)糖尿。 持續(xù)性高血糖和糖尿，特別是空腹血糖和糖耐量曲線高于正常范 圍，主要見于糖尿病(diabetes mellitus)。 九九本實驗的臨床意義本實驗的臨床意義 高血糖：高血糖：空腹血糖高于6.1mmol/L 高血糖高血糖的原因：的原因： 糖尿?。?遺傳性胰島素受體缺陷 某些慢性腎炎、腎病綜合癥等； 生理性高血糖和糖尿。 九九本實驗的臨床意