如何制作高質量的微小昆蟲電鏡樣品

1、如何制作高質量的微小昆蟲電鏡樣品摘要：為進一步提高微小昆蟲不同器官 （觸角感器、口器感器、復眼及顏色較淡的部位如：腸道、腺體、唾液道、精子、卵母細胞等） 透射電鏡樣品制備效率， 對微小昆蟲不同器官的透射電鏡樣品制樣方法進行了改良。建立了簡易的紙巾包裹法;和瓊脂包埋法;.這兩種方法具有簡單快速、操作方便、易于掌握的優(yōu)點， 并解決了大量樣品在漂洗過程中易被吸管吸走、或黏附在吸管壁上被帶走等損耗;的問題， 與常規(guī)制樣方法相比， 既節(jié)約了大量操作時間， 也保證了樣品的數(shù)量和質量， 提高了微小昆蟲生物樣品制樣的效率。關鍵詞：微小昆蟲； 樣品制備； 改良； 透射電子顯微鏡；Improvement of t

2、he tiny insect sample preparation method for transmission electron microscopeAbstract:This study was aimed to improve the sample preparation efficiency for different organs （antenna sensilla, mouthpart sensilla, compound eyes and light-colored parts such as intestine, gland, saliva, sperm, oocytes,

3、etc.） of tiny insects for transmission electron microscopy.The simplepaper towel wrapping method;and agar embedding method;were established, which has the advantages of simplicity and rapidness, are easy to operate and master, and helps solve the problems of losing a large number of samples during r

4、insing as the samples were prone to being sucked by the drip pipe or attached to the drip pipe wall or taken away.Compared with the conventional sample preparation method, it not only saves a lot of operation time, but also ensures the quantity and quality of the sample.The simple new method improve

5、s the efficiency of sample preparation for the biological samples of tiny insects.Keyword:tiny insect; sample preparation; improvement; transmission electron microscope;電子顯微鏡廣泛應用于材料科學、生命科學和臨床病理診斷等領域， 是現(xiàn)代科學研究領域不可缺少的手段之一， 在生命科學研究領域的重要性和不可替代的地位更加顯著。電子顯微鏡是研究生物組織、細胞及細胞器超微結構的常用工具， 也是科研工作者探索生物真實活動的手段之一。但由于

6、生物電鏡樣品制備過程繁瑣， 有時也難以獲得高質量的樣品， 影響了對樣品結構的觀察研究， 耗費了研究者大量的時間、精力和財力， 在一定程度上阻滯了科研的發(fā)展1-8.特別是昆蟲身體表面被覆高度骨化的外骨骼、角膜和角質層， 質地堅硬， 固定液和包埋劑均難以滲透， 對于用透射電鏡研究其內部超微結構， 精確并清晰地觀察身體內部組織細胞超微結構的變化是個巨大的挑戰(zhàn)。首先， 要確保電鏡固定液快速有效地進入微小的昆蟲體內， 保護好其體內結構， 防止細胞結構溶解；其次， 要確保樣品在脫水后包埋劑能很好地滲入組織結構中， 起到均勻地包埋支持作用；最后， 樣品在處理完后包埋時， 對于特定部位尤其是觸角、口器感器、復

7、眼和肌肉等部位的取向定位也是需要解決的一個重要問題9-25.常規(guī)透射電鏡生物樣品制備技術是進行生物樣品超微結構研究中最基本， 也是最重要的步驟， 它的高效、高質量， 對獲得高清晰、高質量的圖片有著至關重要的影響；而且該步驟的不斷改進對電鏡技術的提高和應用起著重要的推動作用。常規(guī)制備微小昆蟲不同部位器官 （觸角感器、口器感器、復眼及顏色較淡的部位如：腸道、腺體、唾液道、精子、卵母細胞等） 的透射電鏡樣品時總是耗時、費力， 多次漂洗過程中樣品被吸管吸走、或黏附在吸管壁上被帶走或者附著在離心管壁等損耗;, 影響了透射電鏡樣品制備效率。作者經(jīng)過摸索， 發(fā)現(xiàn)利用紙巾包裹法;和瓊脂包埋法;不僅可以提高透射

8、電鏡樣品制備效率， 而且具有操作方便、簡單快速、易于掌握的優(yōu)點。1、材料與方法1.1 樣品玉米黃呆薊馬Anaphothrips obscurus （Mller） 成蟲 （實驗室飼養(yǎng)1015代） 由西北農林科技大學植物保護學院纓翅目分類實驗室提供。成蟲用盆栽的小麥或玉米幼苗在人工氣候箱 （251， LD=14h10h, RH:75%5%） 中飼養(yǎng)。榕母管薊馬Gynaikothrips ficorum （Marchal） 成蟲采自廣東省廣州市榕樹葉上。1.2 試劑與儀器無菌水、0.2 mol/L磷酸緩沖液、2.5%戊二醛溶液、2%鋨酸 （OsO4） 、乙醇溶液 （10%, 30%, 50%, 70

9、%, 80%, 90%, 95%, 100%） 、倫敦白膠、0.3 mL膠囊、2%醋酸雙氧鈾、4%檸檬酸鉛、紙巾、瓊脂、超凈工作臺、Nikon SMZ1500顯微鏡、Eppendorf Mix Mate渦旋振蕩器、Eppendorf移液器、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、PCR管 （1.5mL和4mL） 、冷凍干燥儀VFD-21S、離子濺射儀MSP-1S、Leica EM UC7、掃描電鏡Hitachi S-3400N、透射電子顯微鏡JEOL JEM-1230等。1.3 試驗方法1.3.1 復眼和口器樣品的制備方法取玉米黃呆薊馬和榕母管薊馬雌成蟲各10頭直接放到預冷的2.5%戊二醛溶液中， 在Nikon SM

10、Z1500光學顯微鏡下迅速將帶有完整復眼或口器的頭部切下， 立即放于培養(yǎng)皿內用預冷的2.5%戊二醛溶液浸濕的2cm2cm正方形紙巾 （由3層， 21cm21cm的泉林本色秸稈手帕紙剪成， 柔韌度好） 上 （圖1） , 等全部取完樣品， 如圖所示沿ef向對角線bd處用電鏡專用極細的尖頭鑷子向里折， 將樣品完全蓋住 （圖1A） , 接著沿gh向對角線bd處再向里折 （圖1B） , 將兩側的邊也折起來 （圖1C, D） , 再接著沿對角線bd依次向c處折 （圖1E, F） , 最后將折疊好的樣品迅速放入裝有預冷的2.5%戊二醛溶液的4mL圓底離心管里， 抽真空約30min, 蓋好蓋子， 放到4下避光

11、固定6h.固定后的樣品用0.1mol/L, pH 7.2磷酸緩沖液漂洗6次， 再用鋨酸 （OsO4） 固定液 （0.1mol/L, pH 7.2） 固定2h, 再用磷酸緩沖液漂洗6次后， 經(jīng)不同梯度的乙醇溶液 （10%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%） 脫水， 然后樣品依次經(jīng)過不同體積比的乙醇-倫敦白膠混合物 （V乙醇：VLR-White=31, 11, 13） 與兩次純倫敦白膠滲透。包埋時小心用細頭鑷子將紙巾慢慢打開， 最后露出樣品， 逐一將樣品放到膠囊內， 蓋好蓋子， 并壓緊蓋子， 將包埋好的樣品放入烘箱中60聚合48h.聚合后的樣品塊在

12、Leica EM UC7切片機上用鉆石刀切成厚度約5070nm的超薄切片， 依次用2%醋酸雙氧鈾染色10 min和4%檸檬酸鉛染色8min, 最后在JEOL JEM-1230透射電子顯微鏡 （加速電壓80kV） 下觀察和拍照。1.3.2 觸角樣品的制備方法取玉米黃呆薊馬和榕母管薊馬雌蟲各10頭直接放進預冷的2.5%戊二醛溶液中， 在Nikon SMZ1500光學顯微鏡下迅速將帶有完整觸角的頭部切下， 把觸角的柄節(jié)、梗節(jié)、鞭節(jié) （-） 分別迅速切下， 并立即放入裝有幾滴預冷的2.5%戊二醛溶液的1.5mL的尖底離心管中， 加入23滴40左右1.5%的瓊脂， 4下避光冷凝20min, 用牙簽貼著離

13、心管壁把瓊脂包裹著樣品的凝膠塊刮下來， 迅速放入裝有3.8 mL預冷的2.5%戊二醛溶液的4mL圓底離心管中， 觸角每節(jié)至少取67個瓊脂包埋塊， 4下避光固定6h.固定后的樣品經(jīng)磷酸緩沖液漂洗6次， 用鋨酸 （OsO4） 固定液 （0.1 mol/L, pH7.2） 固定2h, 再用磷酸緩沖液漂洗6次后， 依次經(jīng)不同濃度梯度的乙醇溶液 （10%、30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%） 脫水。樣品依次再經(jīng)過不同體積比的乙醇-倫敦白膠混合物 （V乙醇：VLR-White=31, 11, 13） 與兩次純倫敦白膠滲透。包埋時小心用牙簽將瓊脂包埋塊逐一放到膠囊內， 蓋好蓋子， 并壓

14、緊蓋子， 將包埋后的樣品放入烘箱中60聚合48h.聚合后的樣品塊在Leica EMUC7切片機上用鉆石刀切成厚度約5070nm的超薄切片， 依次用2%醋酸雙氧鈾染色10min和4%檸檬酸鉛染色8min, 最后在JEOL JEM-1230透射電子顯微鏡 （加速電壓80kV） 下觀察和拍照。2、結果與分析2.1 口器感器和復眼觀察紙巾包裹法;處理后的樣品-玉米黃呆薊馬口器下顎須的縱切面 （圖2a） 、橫切面 （圖2b） 和榕母管薊馬復眼橫切面 （圖2d） 和縱切面 （圖2e） 及傳統(tǒng)方法處理的樣品-玉米黃呆薊馬口器側唇舌的橫切面 （圖2c） 和榕母管薊馬復眼橫切面 （圖2f） , 所獲得圖片都顯示

15、：細胞結構完整， 口器感器的結構保存完好， 下顎須的6個神經(jīng)樹突鞘清晰可見 （圖2b） , 視覺感器的4個晶錐 （cc） 清楚， 感桿 （rh） 的微絨毛大多與細胞長軸垂直， 信息豐富。但兩種處理方法的圖片在邊緣局部區(qū)域會出現(xiàn)滲透不理想的現(xiàn)象， 這是由于昆蟲體表骨骼化程度高或有堅韌的角質化層， 固定液和樹脂難以滲透的原因造成的。2.2 觸角感器觀察從圖2可見， 瓊脂包埋法;處理后的樣品-榕母管薊馬觸角的縱切面 （圖2gh） 和傳統(tǒng)方法處理的樣品-榕母管薊馬觸角的縱切面 （圖2i） , 都能獲得較好的圖片， 亞細胞結構完好， 神經(jīng)樹突結構清晰 （圖2g, h） .3、討論結果表明， 改良方法和傳

16、統(tǒng)方法處理樣品都能獲得理想的效果。改良方法不僅具有操作方便、簡單快速、易于掌握的優(yōu)點， 而且還克服了大量樣品在多次漂洗過程中損耗;的缺點， 特別是對于珍貴的樣品不但保證了樣品的數(shù)量， 也獲得了高質量的電鏡圖片。獲得高質量、高清晰電鏡圖片的關鍵因素是樣品的固定效果良好及超薄切片的質量。一般植物材料用4%戊二醛溶液固定6h或鋨酸固定2h;動物組織用2.5%戊二醛溶液固定4h或鋨酸固定1h, 固定的時間也不宜過長， 一般不超過4h, 過長會造成組織變脆， 為切片帶來困難26-27.無水乙醇與LR-White倫敦白膠梯度滲透， 能使?jié)B透效果均勻， 有利于制成高質量包埋塊， 提高樹脂的可切性。適當延長時

17、間， 能提高樣品的滲透效果。在包埋塊制作過程中， 注意膠囊蓋子一定要密封好， 蓋子壓實， 否則會由于倫敦白膠與空氣接觸而使樣品變軟， 切片后會出現(xiàn)刻痕和發(fā)散現(xiàn)象， 影響超微結構的觀察。紙巾包裹法;在每次漂洗時需注意吸管或槍頭的尖端不要扎破紙巾， 否則樣品會從破洞中出來， 在每一步的清洗過程中仍會損耗;.瓊脂包埋法;可以準確定位， 例如昆蟲觸角的柄節(jié)、梗節(jié)、鞭節(jié)各節(jié)上的感覺器各不相同， 在超薄切片機上要想切到想要的部位， 非常困難， 利用瓊脂包埋法;可以準確地分節(jié)， 修塊時易于定位， 準確地切到需要的部位。但需注意包埋樣品的瓊脂不能太厚， 如果過厚， 可以用新的雙面刀片粗修， 使樣品最多1mm2

18、大小， 否則固定效果也會減弱。參考文獻1楊勇驥， 湯瑩， 葉煦亭， 等。醫(yī)學生物電子顯微鏡技術M.上海：第二軍醫(yī)大學出版社， 2012:77.2張燕如， 任利利， 駱有慶。透射電鏡樹脂包埋塊中昆蟲感器的定位技術J.應用昆蟲學報， 2013, 50 （5） :1479-1483.3謝家儀， 董光軍， 劉振英。掃描電鏡的微生物樣品制備方法J.電子顯微學報， 2005, 24 （4） :440-440.4李向黨。游離細胞超快掃描電鏡樣品制備法J.電子顯微學報， 2001, 20 （4） :537-538.5曲淑賢， 高船舟， 呂廣艷， 等。懸浮細胞掃描電鏡快速制樣方法J.醫(yī)學信息， 2008, 21

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