薩?？烁嵫蚵雅菡T導(dǎo)的影響因素分析

1、薩?？烁嵫蚵雅菡T導(dǎo)的影響因素分析體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的效率，與卵母細(xì)胞來源和質(zhì)量密切相關(guān)1-3,屠宰場(chǎng)采集的卵母細(xì)胞由于品種、健康狀況等因素都不明確，無法用于體外胚胎生產(chǎn)。而成年羊的活體采卵技術(shù)，因?qū)w羊傷害大，效率低，也無法用于生產(chǎn)實(shí)踐，但利用羔羊作為供體，可以避免以上的不足。因幼齡動(dòng)物體外胚胎生產(chǎn)及移植技術(shù)（Juvenile in vitro embryo transfer,JIVET）能提供高于成年羊數(shù)以10倍的卵母細(xì)胞，極大地縮短了時(shí)代間隔，因而可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因、核移植等生物技術(shù)和動(dòng)物新品種的培育4.目前，已有誘導(dǎo)牛5-6、山羊7-8和綿羊9-13等品種幼齡階段卵泡發(fā)育的研究，而在綿羊的研

2、究中，以Kelly等10-12的研究最為詳細(xì)，其研究了EGF、IGF-1等生長(zhǎng)因子對(duì)羔羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育的影響，在對(duì)美利奴羔羊的研究中，1只48周齡的羔羊最多獲得了13.9只后代的效果。Gou等13研究了季節(jié)對(duì)細(xì)毛羊羔羊誘導(dǎo)效果的影響，發(fā)現(xiàn)秋季效果好于春季和冬季。雖然細(xì)毛羊羔羊卵泡發(fā)育效果較好，但對(duì)薩?？烁嵫虻难芯枯^少，而薩?？藢儆谌庥镁d羊，其激素誘導(dǎo)方案是否與細(xì)毛羊一致，還沒有定論。本研究以此為切入點(diǎn)，研究可能影響薩?？烁嵫蚵雅菡T導(dǎo)的因素，以期獲得穩(wěn)定的薩?？烁嵫蜻x擇標(biāo)準(zhǔn)，以及季節(jié)對(duì)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞發(fā)育的影響，旨在為薩?？烁嵫蝮w外胚胎規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1羔羊的選擇及試驗(yàn)

3、設(shè)計(jì)本試驗(yàn)在阿克蘇地區(qū)天山肉用種羊有限責(zé)任公司養(yǎng)殖基地進(jìn)行。試驗(yàn)1:根據(jù)羔羊體況和精神狀態(tài)，隨機(jī)選擇45只薩?？烁嵫?，根據(jù)出生日齡，將試驗(yàn)組設(shè)為56和89周齡組。試驗(yàn)2:將試驗(yàn)1中所用的56周齡共39只薩?？烁嵫?，根據(jù)體重將其分為810、1112和1318kg 3組；試驗(yàn)3:隨機(jī)選擇采食、精神狀態(tài)等正常，無病狀表現(xiàn)的出生年齡、體重等較為接近的53只薩?？烁嵫蛴米鞴w，將其中部分羊曾因病注射過抗生素的設(shè)為亞健康組，其余羔羊無疾病史，設(shè)為健康組。試驗(yàn)4:在春、秋季，隨機(jī)選擇59周齡、初生重相近、精神狀態(tài)良好的薩?？烁嵫?3只進(jìn)行激素誘導(dǎo)，將2個(gè)季節(jié)的羔羊卵泡發(fā)育效果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以分析季節(jié)對(duì)激素誘導(dǎo)效

4、果和卵母細(xì)胞質(zhì)量是否存在差異。試驗(yàn)5:分別將試驗(yàn)4中春、秋季獲得的羔羊早期胚胎進(jìn)行移植，以研究季節(jié)對(duì)羔羊胚胎移植效果是否有影響。1.2羔羊的處理本試驗(yàn)使用的垂體促卵泡素（FSH）為加拿大BIONICHE公司生產(chǎn)的FOLLTROPIN-V,孕馬血清（PMSG）為寧波三生激素有限公司生產(chǎn)。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，隨機(jī)選擇羔羊，每只羔羊使用FSH劑量為160IU以等劑量的方式每日早晚間隔12h各注射1次，共注射4次，在第1次注射FSH的同時(shí)，注射500IU PMSG,禁食禁飲，羔羊手術(shù)采卵前稱量羔羊體重。1.3受體羊的選擇及處理選擇健康、無明顯繁殖疾病的經(jīng)產(chǎn)本地母羊用作受體。受體羊進(jìn)行同期發(fā)情處理：埋植海綿栓

5、12d,在打第4針時(shí)撤栓，同時(shí)注射333IU/只的PMSG,撤栓后3648h各試情1次，發(fā)情的羊用作受體。1.4卵母細(xì)胞的回收及評(píng)定將饑餓12h的羔羊保定在手術(shù)架上，腹部刮毛，用清水擦洗后，碘酒棉球轉(zhuǎn)圈消毒，用75%酒精脫碘，在腹中線左側(cè)或右側(cè)，避開血管，手術(shù)切開兩指長(zhǎng)的小口，將單側(cè)卵巢暴露于體外，用經(jīng)鹽水濕潤的滅菌紗布將卵巢包裹，用吸有抽卵液的帶8號(hào)針頭的10mL注射器，從卵巢底部開始逐漸向上抽吸卵巢表面的卵泡，將回收的卵泡液入至60mm培養(yǎng)皿，在體視顯微鏡下?lián)斐鏊新涯讣?xì)胞，集中在不含肝素鈉的抽卵液洗盤內(nèi)，選擇可用卵母細(xì)胞用作體外培養(yǎng)。抽卵液為：TCM199-Hepes（Sigma）+2%

6、FBS（Sigma）+0.027mg/mL肝素鈉（Sigma）。根據(jù)卵母細(xì)胞-卵丘細(xì)胞復(fù)合體中卵丘細(xì)胞的多少、包裹的緊密程度及卵母細(xì)胞胞質(zhì)均勻度來選擇卵母細(xì)胞。將包裹3層以上顆粒細(xì)胞、胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞定為可用卵母細(xì)胞。1.5卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)提前2h,在CO2含量體積分?jǐn)?shù)為5%、溫度為38.6的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)平衡成熟培養(yǎng)液。將可用卵母細(xì)胞用不含肝素鈉的抽卵液洗滌2遍，成熟培養(yǎng)液洗滌3遍后，按4060枚/孔的密度放入平衡好的四孔板內(nèi)培養(yǎng)。體外 成 熟 培 養(yǎng) 液 為：TCM199-HCO3+10%FBS（GIBCO）+0.05IU/mL FSH+0.05IU/mLLH+1μg/mL

7、estradiol+24.2μg/mL丙酮酸鈉+60μg/mL谷 氨酰胺+0.1 mmol/L半 胱 氨 酸+10ng/mL EGF+0.1mg/mL雙抗（北京鼎國）。1.6卵母細(xì)胞體外受精將體外成熟培養(yǎng)2224h的羔羊卵母細(xì)胞取出，在0.1%透明質(zhì)酸酶內(nèi)反復(fù)吹吸，脫去部分卵丘細(xì)胞，放入平衡好的裝有體外受精液的四孔板內(nèi)。采集新鮮精液，取100200μL鮮精置于上游液圓底試 管 底 部，精 子 上 游3040 min,取 上 清，以1 500r/min的轉(zhuǎn)速離心4min,棄去上清，再用受精液離心洗滌一次，將底部少許精子濃縮液輕輕混勻，按1×1062×10

8、6的密度加入放有卵母細(xì)胞的四孔板內(nèi)，精卵共孵育。受精液為SOF+20 % SS（自制發(fā)情羊血清）+0.027mg/mL肝素鈉，其中SOF為6.29mg/mL NaCL+0.534mg/mL KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6μL/mL乳 酸 鈉+0.089mg/mL MgSO4+2.1 mg/mL NaHCO3+0.035 7mg/mL丙酮酸鈉+0.299mg/mL CaCL2·2H2O+0.1mg/mL雙抗。1.7體外培養(yǎng)將受精1822h的胚胎取出，在體外培養(yǎng)液滴內(nèi)反復(fù)吹吸，以去除粘附于透明帶上的卵丘細(xì)胞和精子等，洗滌3遍，將胚胎放入裝有平衡好的培養(yǎng)液的四

9、孔板內(nèi)，置于5%O2、5%CO2和90%N2的密封氣袋內(nèi)培養(yǎng)（氣袋置于5%的CO2、38.6的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)），受精48h時(shí)統(tǒng)計(jì)卵裂率，剔除單細(xì)胞胚胎，剩余胚胎繼續(xù)放入氣袋內(nèi)培養(yǎng)，至7d時(shí)，統(tǒng)計(jì)囊 胚 率。 培 養(yǎng) 液 為1/mL BSA+0.1mg/mL雙抗。1.8受體羊同期發(fā)情處理選擇體況正常、無繁殖疾病的經(jīng)產(chǎn)本地地方品種綿羊用作受體。陰道埋植海綿栓12d后撤栓，同時(shí)肌肉注射PMSG 300IU/只和PG 0.1 mg/只。撤栓后24h開始試情，每隔12h試情1次，發(fā)情羊用作移植受體。1.9統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)1、3、4和5使用t檢驗(yàn)，試驗(yàn)2采

10、用One-way ANOVA中Duncan方差分析方法，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。2 結(jié)果與分析2.1薩?？烁嵫蛑荦g對(duì)激素處理的反應(yīng)激素處理后，羔羊卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞質(zhì)量見表1.56周齡薩?？烁嵫蛱幚砗蟮姆磻?yīng)率為89.74%,而89周齡的薩?？烁嵫蚍磻?yīng)率只有33.33%;56周齡組羔羊的卵泡數(shù)、卵母細(xì)胞數(shù)和可用卵母細(xì)胞 數(shù)皆極顯 著高于89周 齡 （P2.2春季外源激素對(duì)不同體重薩?？烁嵫虻淖饔脤?6周齡薩?？烁嵫蝮w重分為3組，各組經(jīng)激素處理后卵泡及卵母細(xì)胞數(shù)見表2.56周齡薩?？烁嵫?，體重在818kg時(shí)對(duì)外源激素的反應(yīng)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05），每只羔羊平均獲得可用卵母細(xì)胞數(shù)

11、在66.5077.21.因此，對(duì)于56周齡薩福克羔羊而言，無論體重大小，都不會(huì)影響卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞的質(zhì)量。2.3羔羊健康狀況對(duì)誘導(dǎo)效果的影響選擇時(shí)健康，但曾有疾病史的羔羊經(jīng)外源激素處理后，其卵泡數(shù)、可用卵母細(xì)胞數(shù)、體外受精后的可用胚胎數(shù)等指標(biāo)極顯著低于健康羔羊組 （P2.4季節(jié)對(duì)羔羊激素誘導(dǎo)效果的影響分別將春、秋季出生羔羊進(jìn)行激素處理，處理后的卵泡發(fā)育效果見表3.無論春季或秋季出生羔羊，激素處理后平均每只供體的卵泡個(gè)數(shù)和獲得的可用卵母細(xì)胞數(shù)沒有差異（P0.05）。將獲得的部分早期胚胎移植后，剩余的胚胎繼續(xù)培養(yǎng)，受精后第7天統(tǒng)計(jì)囊胚發(fā)育率，胚胎發(fā)育結(jié)果如表4所示，春、秋季羔羊卵母細(xì)胞體外受精后

12、的卵裂率差異極顯著（P2.5季節(jié)對(duì)胚胎移植受胎率的影響將獲得的早期胚胎，隨機(jī)選擇，按每只受體45枚的胚胎進(jìn)行移植，剩余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)，至7d時(shí)，統(tǒng)計(jì)囊胚率，將囊胚移植至受體內(nèi)。移植后35dB超檢測(cè)早期懷孕率（陽性/受體數(shù)）。產(chǎn)羔后，統(tǒng)計(jì)最終懷孕率（產(chǎn)羔母羊數(shù)/受體數(shù)）和產(chǎn)羔率（出生羔羊/受體數(shù)）。試驗(yàn)結(jié)果表明（表5、表6），春季或秋季，移植早期胚胎和囊胚期胚胎的懷孕率和產(chǎn)羔率相差都不大，但秋季移植早期胚胎和囊胚期胚胎的受胎率高于春季。3 討論1979年，Worthington等14即開始對(duì)羔羊卵泡發(fā)育進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)hCG處理的羔羊卵巢有明顯的卵泡。我國對(duì)幼齡動(dòng)物卵泡發(fā)育的研究最早是由張鎖鏈等1

13、5在山羊上進(jìn)行，但當(dāng)時(shí)由于體外培養(yǎng)等技術(shù)不夠成熟，未能得到理想的效果。JIVET技術(shù)體系最早是由澳大利亞南澳政府生殖與發(fā)育研究所提出并應(yīng)用于生產(chǎn)16,但我國大部分地區(qū)對(duì)該技術(shù)仍處于研究階段，達(dá)到可推廣階段的不多，可能與JIVET技術(shù)包括的環(huán)節(jié)較多，眾多因素都可能影響試驗(yàn)結(jié)果，從而導(dǎo)致生產(chǎn)效率不穩(wěn)定有關(guān)。1）供體羊的選擇是JIVET技術(shù)成功與否的首要因素。經(jīng)Kelly等10對(duì)美利奴細(xì)毛羊的研究得出，其激素處理的最佳階段為48周齡。而鄭旭等17發(fā)現(xiàn)，遼寧絨山羊的最適年齡為56周齡，郭洪等18對(duì)湖羊、哈薩克羔羊的研究發(fā)現(xiàn)，哈薩克羔羊的最佳處理年齡是48周，但不是湖羊羔羊的最佳時(shí)期。本試驗(yàn)通過對(duì)薩?？?/p>

14、羔羊的研究發(fā)現(xiàn)，其最佳處理年齡為5618周齡以上的羔羊不適合JIVET技術(shù)體系，與美利奴細(xì)毛羊和哈薩克羔羊的48周齡相比，范圍較窄。分析原因，可能與各品種羔羊卵巢出現(xiàn)卵泡閉鎖的時(shí)間不同有關(guān)。早期Kennedy等19在研究美利奴細(xì)毛羊胎兒期至出生后33周齡卵巢和卵泡發(fā)育情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，在羔羊出生早期，卵巢重量和卵泡數(shù)量隨著日齡的增長(zhǎng)而逐漸增加，48周齡時(shí)達(dá)到高峰，隨后部分卵泡開始閉鎖，數(shù)量逐漸降低，33周齡后保持穩(wěn)定。因此，根據(jù)本研究結(jié)果，可以推論，薩?？烁嵫蚵殉埠吐雅莅l(fā)育的高峰期為56周齡，8周齡時(shí)卵泡開始出現(xiàn)閉鎖現(xiàn)象，但該推論尚需進(jìn)一步研究。2）體重是衡量個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育的重要指標(biāo)。多胎、初生重過低

15、、健康狀況不良、生長(zhǎng)速度較慢等因素都可能導(dǎo)致體重過低20,因此在選擇羔羊時(shí)體重應(yīng)成為考量因素之一。本研究中選擇的羔羊初生重相近，生長(zhǎng)至56周齡時(shí)，體重在818kg,范圍較大，經(jīng)外源激素處理后，雖然1012kg組的效果稍高于810和1218kg組，但各組間差異不顯著。由此可以得出，體重較低或較重的羔羊，并不影響其卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞的回收。該研究結(jié)果也進(jìn)一步證明，在體況正常情況下，影響卵巢及卵泡發(fā)育最大的可能因素為日齡而非體重。3）在選擇供體羊時(shí)，通常根據(jù)羔羊的采食、精神狀態(tài)等表觀現(xiàn)象進(jìn)行選擇，有明顯疾病的羔羊不會(huì)被選作供體，但不會(huì)查看生長(zhǎng)過程中可能出現(xiàn)的意外情況。但曾經(jīng)生病、試驗(yàn)時(shí)已痊愈的羔羊?qū)?/p>

16、試驗(yàn)效果是否有影響，目前未見報(bào)道。本研究隨機(jī)選擇的羔羊，分屬同一養(yǎng)殖場(chǎng)的2個(gè)養(yǎng)殖戶，體況相近，飲食、精神狀態(tài)良好，但試驗(yàn)結(jié)果卻表明兩養(yǎng)殖戶之間差異較大，分析后發(fā)現(xiàn)，其中一養(yǎng)殖戶對(duì)羔羊極為關(guān)注，羔羊稍有不適，即使用大量的青霉素、頭孢等抗生素，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，有疾病史的羔羊，激素誘導(dǎo)效果較 差，平 均 每 只 獲 得 可 用 卵 母 細(xì) 胞 數(shù) 僅 為38.47枚，顯著低于正常羔羊的82.08枚，體外受精后獲得的早期胚胎僅為27.47枚，為正常羊的1/2.因此，選擇供體羔羊時(shí)，其曾經(jīng)健康狀況不容忽視。4）薩?？搜蚴羌竟?jié)性發(fā)情動(dòng)物，對(duì)于成年母羊，秋冬是發(fā)情季節(jié)，春夏為乏情季節(jié)，常規(guī)的配種或胚胎移植一般選擇秋季進(jìn)行。幼齡期羔羊，由于體內(nèi)各種激素調(diào)控功能尚不健全，內(nèi)分泌激素水平受環(huán)境影響不明顯，不應(yīng)有季節(jié)性差異。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，季節(jié)對(duì)羔羊卵泡發(fā)育沒有影響，但對(duì)獲得卵母細(xì)胞質(zhì)量有顯著影響，秋季出生羔羊卵母細(xì)胞體外受精后的卵裂率、囊胚率顯著高于春季出生的效果。據(jù)Gou等13分析，卵母細(xì)胞體外發(fā)育效率出現(xiàn)季節(jié)性差異，可能與使用的精子質(zhì)量有關(guān)，秋季公羊精子活力好于春夏季，而精子質(zhì)量對(duì)卵母細(xì)胞的后期發(fā)育影響很大；但若使用秋季做的凍精，受精效率仍然較低的話，則說明春季的羔羊卵母細(xì)胞質(zhì)量較差。5）秋季移植28細(xì)胞期或囊胚期胚胎，懷孕率和產(chǎn)