第三章基因組文庫(kù)的構(gòu)建

1、第三章第三章 基因組基因組文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建 在基因文庫(kù)中存在兩類基本的基因序列。在基因文庫(kù)中存在兩類基本的基因序列。 基因組基因組文庫(kù)文庫(kù)(genomic library)(genomic library)即即基因文庫(kù)基因文庫(kù)( (gene bank)gene bank)。 構(gòu)建構(gòu)建基因文庫(kù)：基因文庫(kù)： 一是構(gòu)建一是構(gòu)建dnadna文庫(kù)文庫(kù)。dnadna文庫(kù)是含有某種生物體全部基因的文庫(kù)是含有某種生物體全部基因的 隨機(jī)片斷的重組隨機(jī)片斷的重組dnadna克隆群體克隆群體。其中可能含有基因外顯子、。其中可能含有基因外顯子、 內(nèi)含子、基因內(nèi)含子、基因5端調(diào)控區(qū)、端調(diào)控區(qū)、3端的尾隨序列以及基因

2、間的端的尾隨序列以及基因間的 間隔區(qū)。間隔區(qū)。 二是構(gòu)建二是構(gòu)建cdna文庫(kù)文庫(kù)。cdna文庫(kù)是克隆的重組文庫(kù)是克隆的重組cdna的總的總 和，通常是建立在細(xì)菌或酵母中。和，通常是建立在細(xì)菌或酵母中。這些克隆代表從某個(gè)特這些克隆代表從某個(gè)特 定物種或器官的所有定物種或器官的所有mrna制備得到的制備得到的cdna。它是以細(xì)。它是以細(xì) 胞中的胞中的mrna為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成的雙鏈為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成的雙鏈dna。 組織 載體 ( 選擇一種) mrna dna cdna 部分或完全 消化的 dna 甲基化，加接頭 的雙鏈 dna 大小分級(jí) 可供克隆的 dna 片段 連接 dna 片段和載體

3、重組載體 dna 導(dǎo)入 e.coli (體外包裝或轉(zhuǎn)化) 基因庫(kù)的鑒定與效價(jià)測(cè)定 篩選目的基因 擴(kuò)增文庫(kù)長(zhǎng)期保存 構(gòu)建基因組 dna 和 cdna 文庫(kù)的流程示意圖 用用噬菌體置換型載體構(gòu)建基因文庫(kù)。用限制噬菌體置換型載體構(gòu)建基因文庫(kù)。用限制 性酶消解性酶消解噬菌體載體，切除了中央的片段，噬菌體載體，切除了中央的片段， 再用相同的限制性酶剪切外源基因組再用相同的限制性酶剪切外源基因組dna，將，將 約約15kb的酶切片段隨機(jī)地和的酶切片段隨機(jī)地和噬菌體載體的兩噬菌體載體的兩 臂連接，形成線性的重組的串聯(lián)體。用體外包臂連接，形成線性的重組的串聯(lián)體。用體外包 裝系統(tǒng)將串聯(lián)體中單個(gè)的基因組裝系統(tǒng)將串

4、聯(lián)體中單個(gè)的基因組dna分別包裝分別包裝 入不同噬菌體頭部，形成不同的重組噬菌體顆入不同噬菌體頭部，形成不同的重組噬菌體顆 粒。用重組噬菌體感染適合的宿主菌，產(chǎn)生噬粒。用重組噬菌體感染適合的宿主菌，產(chǎn)生噬 菌斑。每一個(gè)噬菌斑來(lái)自單個(gè)感染噬菌體的一菌斑。每一個(gè)噬菌斑來(lái)自單個(gè)感染噬菌體的一 個(gè)克隆。各個(gè)克隆帶有不同的細(xì)胞個(gè)克隆。各個(gè)克隆帶有不同的細(xì)胞dna片段。片段。 體外包裝體外包裝 重組重組噬菌體載體的體外包裝有兩種不同的策略。一是利噬菌體載體的體外包裝有兩種不同的策略。一是利 用與編碼包裝蛋白的基因的突變體。野生型噬菌體的的包用與編碼包裝蛋白的基因的突變體。野生型噬菌體的的包 裝需要裝需要e

5、 e、d d、a a等基因的產(chǎn)物，這些基因中的任何一個(gè)發(fā)等基因的產(chǎn)物，這些基因中的任何一個(gè)發(fā) 生突變噬菌體都不能順利包裝，從而在宿主的細(xì)胞中積累生突變噬菌體都不能順利包裝，從而在宿主的細(xì)胞中積累 了大量的前頭部蛋白。了大量的前頭部蛋白。bhb2688bhb2688和和 bhb2690bhb2690兩種菌株正是這兩種菌株正是這 兩種突變菌株，前者是兩種突變菌株，前者是e e的突變體，后者是的突變體，后者是d d 基因的突變體?；虻耐蛔凅w。 噬菌體感染這兩種菌株時(shí)均不能產(chǎn)生噬菌體顆粒，但將噬菌體感染這兩種菌株時(shí)均不能產(chǎn)生噬菌體顆粒，但將 這兩種裂解液合并在一起，由于基因的互補(bǔ)作用，可以產(chǎn)這兩種裂

6、解液合并在一起，由于基因的互補(bǔ)作用，可以產(chǎn) 生成熟的噬菌體顆粒。利用這個(gè)原理可以進(jìn)行體外包裝。生成熟的噬菌體顆粒。利用這個(gè)原理可以進(jìn)行體外包裝。 另一種思路是利用包裝信號(hào)的突變體。另一種思路是利用包裝信號(hào)的突變體。噬菌體的噬菌體的 包裝是通過(guò)頭部蛋白上的包裝是通過(guò)頭部蛋白上的a a蛋白蛋白識(shí)別識(shí)別coscos區(qū)，對(duì)由滾區(qū)，對(duì)由滾 環(huán)復(fù)制產(chǎn)生的串聯(lián)體環(huán)復(fù)制產(chǎn)生的串聯(lián)體dnadna加以剪切，正好將一個(gè)基加以剪切，正好將一個(gè)基 因組的因組的dnadna切下，包裝成噬菌體顆粒。如制備切下，包裝成噬菌體顆粒。如制備coscos位位 點(diǎn)的突變體，使噬菌體可以合成完整的外殼蛋白，點(diǎn)的突變體，使噬菌體可以合成

7、完整的外殼蛋白， 但卻不能包裝，而重組質(zhì)粒上裝有正常的但卻不能包裝，而重組質(zhì)粒上裝有正常的coscos區(qū)，區(qū)， 從而能被包裝成噬菌體顆粒。這兩種策略都是從而能被包裝成噬菌體顆粒。這兩種策略都是 噬菌體突變體的溶原菌，來(lái)制備包裝抽提物。噬菌體突變體的溶原菌，來(lái)制備包裝抽提物。 噬菌體克隆文庫(kù)的構(gòu)建噬菌體克隆文庫(kù)的構(gòu)建 (a)將外源基因組的將外源基因組的dna片段克隆到片段克隆到噬菌體載體噬菌體載體 中來(lái)構(gòu)建基因組中來(lái)構(gòu)建基因組dna文庫(kù)。菌苔上的噬菌斑中文庫(kù)。菌苔上的噬菌斑中 含有大量不同的重組噬菌體，每一個(gè)噬菌斑來(lái)含有大量不同的重組噬菌體，每一個(gè)噬菌斑來(lái) 自單個(gè)感染噬菌體的一個(gè)克隆。各個(gè)克隆帶

8、有自單個(gè)感染噬菌體的一個(gè)克隆。各個(gè)克隆帶有 不同的細(xì)胞不同的細(xì)胞dna片段。現(xiàn)在的難題是用探針與片段。現(xiàn)在的難題是用探針與 帶有目的基因的克隆進(jìn)行雜交來(lái)鑒別攜帶著特帶有目的基因的克隆進(jìn)行雜交來(lái)鑒別攜帶著特 殊基因的克隆。殊基因的克隆。 (b) 噬菌斑的模式被轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，而噬噬菌斑的模式被轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，而噬 菌體的蛋白被溶解，和重組體菌體的蛋白被溶解，和重組體dna分開(kāi)，分開(kāi)， dna吸附到膜上。再將此膜與帶有放射吸附到膜上。再將此膜與帶有放射 性同位素標(biāo)記的探針進(jìn)行分子雜交，可性同位素標(biāo)記的探針進(jìn)行分子雜交，可 以雜交的便是目的基因。帶有此以雜交的便是目的基因。帶有此dna的的 克隆可通

9、過(guò)放射自顯影而顯現(xiàn)出來(lái)。這克隆可通過(guò)放射自顯影而顯現(xiàn)出來(lái)。這 樣陽(yáng)性克隆可從培養(yǎng)基中分離出來(lái)，再樣陽(yáng)性克隆可從培養(yǎng)基中分離出來(lái)，再 轉(zhuǎn)接到新鮮的宿主菌中，使目的因得到轉(zhuǎn)接到新鮮的宿主菌中，使目的因得到 擴(kuò)增。擴(kuò)增。 重組噬菌體 細(xì)胞 基因組 噬菌體 尼龍膜 膜 與放射性探針 進(jìn)行分子雜交 膜 用放射自顯影 定位陽(yáng)性克隆 陽(yáng)性克隆 用限制性 酶剪切 提取dna 用限制性酶剪切 用連接酶 連接 重組體dna 細(xì)菌 感染裂解釋放噬菌體 噬菌斑中的 噬菌體克隆 菌苔 噬菌體克隆文庫(kù) 感染新鮮 的宿主菌 擴(kuò)增外 源基因 cdna文庫(kù)文庫(kù)(cdna library) ： 克隆的重克隆的重 組組cdna的集

10、合，通常是在細(xì)菌或酵母中。的集合，通常是在細(xì)菌或酵母中。 這些克隆代表從某個(gè)特定物種或器官的所這些克隆代表從某個(gè)特定物種或器官的所 有有mrna制備得到的制備得到的cdna。 cdna分子克隆分子克隆(cdna clone) ：將：將 cdna片段裝在載體上轉(zhuǎn)化細(xì)菌片段裝在載體上轉(zhuǎn)化細(xì)菌,擴(kuò)增出多擴(kuò)增出多 克隆的過(guò)程，最終可建立克隆的過(guò)程，最終可建立cdna文庫(kù)。文庫(kù)。 建庫(kù)的目的：建庫(kù)的目的： 1.從復(fù)雜的基因組中分離單拷貝的基因；從復(fù)雜的基因組中分離單拷貝的基因； 2.是從來(lái)源復(fù)雜的總是從來(lái)源復(fù)雜的總mrna的的cdna文庫(kù)中文庫(kù)中 分離稀有的分離稀有的cdna克隆?？寺　?建庫(kù)的關(guān)鍵：建

11、庫(kù)的關(guān)鍵： 如何產(chǎn)生足夠數(shù)量的重組如何產(chǎn)生足夠數(shù)量的重組dna 建庫(kù)應(yīng)注意：建庫(kù)應(yīng)注意： 1.保證載體保證載體dna和靶和靶dna均不被外源均不被外源dna 序列污染；序列污染； 2.盡可能用盡可能用“ 電話克隆電話克隆”。 第一節(jié) dna克隆片段的產(chǎn)生與分離 一一.基因組基因組dna的片段化的片段化 1.用限制酶片段化用限制酶片段化: 用限制酶消化用限制酶消化dna，不經(jīng)凝膠電泳分部分離，不經(jīng)凝膠電泳分部分離,直接和載直接和載 體連接的克隆方法叫鳥槍法體連接的克隆方法叫鳥槍法(shot-gan approach) 存在的問(wèn)題：存在的問(wèn)題： 所形成的重組體分子是一群帶有大小不同插入片段所形成的

12、重組體分子是一群帶有大小不同插入片段 的混合群體。以每個(gè)載體可插入的混合群體。以每個(gè)載體可插入13kbdna計(jì)算，計(jì)算， 基因庫(kù)至少含基因庫(kù)至少含1030萬(wàn)個(gè)重組質(zhì)粒。從中篩出目的基萬(wàn)個(gè)重組質(zhì)粒。從中篩出目的基 因工作量是很大的。因工作量是很大的。 目的基因內(nèi)部可能有一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，即一個(gè)目的基因內(nèi)部可能有一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，即一個(gè) 基因分載在基因分載在 幾個(gè)重組質(zhì)粒上，篩出完整基因更不容幾個(gè)重組質(zhì)粒上，篩出完整基因更不容 易易。 2.隨機(jī)片段化：隨機(jī)片段化： 超聲波超聲波：可產(chǎn)生：可產(chǎn)生300bp的短片段。的短片段。 高速攪拌高速攪拌：1500轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分30分分 可切可切 平均長(zhǎng)度平均長(zhǎng)

13、度 8kb的分子群體。的分子群體。 3.雙酶消化雙酶消化 單酶消化的產(chǎn)物一般分子較大，選擇時(shí)要考慮到載單酶消化的產(chǎn)物一般分子較大，選擇時(shí)要考慮到載 體容量，如體容量，如 噬菌體插入片段不超過(guò)噬菌體插入片段不超過(guò)25kb,為此可為此可 選用識(shí)別選用識(shí)別4bp的限制酶的限制酶(切割平均長(zhǎng)度為切割平均長(zhǎng)度為256bp) , 識(shí)別識(shí)別6bp的限制酶切割平均長(zhǎng)度的限制酶切割平均長(zhǎng)度4096 bp. 雙酶切產(chǎn)生的雙酶切產(chǎn)生的dna片段平均大小不超過(guò)片段平均大小不超過(guò) 1kb,但如采用雙酶部分消化，產(chǎn)物的分但如采用雙酶部分消化，產(chǎn)物的分 子量可達(dá)子量可達(dá)1030 kda,它們存在著隨機(jī)序它們存在著隨機(jī)序 列

14、重疊，用蔗糖梯度離心或凝膠電泳可列重疊，用蔗糖梯度離心或凝膠電泳可 將這些片段群體按大小分開(kāi)，可得到的將這些片段群體按大小分開(kāi)，可得到的 分子量大小約為分子量大小約為20kda的隨機(jī)的隨機(jī)dna片段片段 群體。群體。 二二. dna片斷大小的分部分離：片斷大小的分部分離： 如已知含目的基因克隆片段的大小范圍，如已知含目的基因克隆片段的大小范圍， 可在克隆前用蔗糖梯度離心或瓊脂糖凝可在克隆前用蔗糖梯度離心或瓊脂糖凝 膠電泳將膠電泳將dna群體按大小分部分離。群體按大小分部分離。 三三.目的基因克隆片段的富集。目的基因克隆片段的富集。 四.克隆數(shù)的確定 任一任一dna序列在文庫(kù)中出現(xiàn)的概率：序列在

15、文庫(kù)中出現(xiàn)的概率： n:該序列需要克隆的總數(shù)；該序列需要克隆的總數(shù)； p:待克隆待克隆dna序列在文庫(kù)中設(shè)定的出現(xiàn)概率，序列在文庫(kù)中設(shè)定的出現(xiàn)概率， 一般為一般為99； i：待克隆：待克隆dna片段的長(zhǎng)度，假定為片段的長(zhǎng)度，假定為17kb; g: 基因組基因組dna的總長(zhǎng)度，如人類為的總長(zhǎng)度，如人類為3109bp )/1ln( )1ln( gi p n 將數(shù)據(jù)代入上式將數(shù)據(jù)代入上式 = 8.1105 n的含義是克隆大小為的含義是克隆大小為17kb17kb的人類的人類dnadna時(shí)，所時(shí)，所 構(gòu)建的基因文庫(kù)數(shù)必須在構(gòu)建的基因文庫(kù)數(shù)必須在 8.18.110105 5個(gè)以上克個(gè)以上克 隆時(shí)，才能以隆

16、時(shí)，才能以9999的概率得到此克隆。的概率得到此克隆。 alu散在元件 限制性 酶切位點(diǎn) 探針1 探針2 探針3 5kb 啟動(dòng)子啟動(dòng)子啟動(dòng)子外顯子 mrna mrnamrna (a) (b) 一個(gè)典型的基因組文庫(kù)含有帶有重疊基因片段的多拷一個(gè)典型的基因組文庫(kù)含有帶有重疊基因片段的多拷 貝克隆。貝克隆。 (a)用從原有的克隆用從原有的克隆dna片段制備的放射性探針能片段制備的放射性探針能 從典型的基因組文庫(kù)中能分離各種基因片段。用探針從典型的基因組文庫(kù)中能分離各種基因片段。用探針1 可用來(lái)篩選文庫(kù)，從文庫(kù)中分離重組可用來(lái)篩選文庫(kù)，從文庫(kù)中分離重組dna片段。用探片段。用探 針針2和和3來(lái)獲得與上

17、述片段部分重疊的來(lái)獲得與上述片段部分重疊的dna序列。罕見(jiàn)序列。罕見(jiàn) 的酶切位點(diǎn)和重復(fù)的酶切位點(diǎn)和重復(fù)dna序列序列(如如alu分散元件分散元件)可作為界可作為界 標(biāo)，用來(lái)排列分離的基因組標(biāo)，用來(lái)排列分離的基因組dna克隆?？寺　?(b)從文庫(kù)中分離的單個(gè)的克隆片段含有最小的重從文庫(kù)中分離的單個(gè)的克隆片段含有最小的重 疊疊dna片段的復(fù)合位點(diǎn)。在圖中表示已克隆的片段的復(fù)合位點(diǎn)。在圖中表示已克隆的50kb的的 基因組基因組dna中含有三個(gè)轉(zhuǎn)錄的基因。中含有三個(gè)轉(zhuǎn)錄的基因。 第二節(jié) 構(gòu)建文庫(kù)的載體 一一. .噬菌體載體噬菌體載體 基礎(chǔ)：裸露的噬菌體重組基礎(chǔ)：裸露的噬菌體重組dnadna轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞

18、轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞 或包裝后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。或包裝后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。 載體篩選：在細(xì)菌菌苔中形成噬菌斑。載體篩選：在細(xì)菌菌苔中形成噬菌斑。 重組篩選：重組篩選： 插入載體插入載體通過(guò)可見(jiàn)標(biāo)記的插入失活通過(guò)可見(jiàn)標(biāo)記的插入失活( (cici 基基 因的打斷阻止溶源性，產(chǎn)生的噬菌體更清澈；因的打斷阻止溶源性，產(chǎn)生的噬菌體更清澈； 現(xiàn)代的載體攜帶現(xiàn)代的載體攜帶laczlacz 基因，以蘭基因，以蘭- -白斑篩白斑篩 選選) )。 供體供體dnadna的大小的大小： 插入載體：插入載體：0 010kbp;10kbp; 置換載體：置換載體：9 923kbp23kbp。 插入大小范圍被有效形成噬菌斑的野生插入大小范圍

19、被有效形成噬菌斑的野生 型基因組型基因組 75-10575-105所限制。所限制。 主要應(yīng)用主要應(yīng)用： 插入載體插入載體:cdna:cdna克隆和表達(dá)文庫(kù)克隆和表達(dá)文庫(kù); ; 噬菌體展示。噬菌體展示。 置換載體置換載體: :基因組基因組dnadna克隆?？寺?。 general method for plating 5105 recombinants from an amplified dna library onto agar plates. e. coli cells are grown in lb broth containing maltose to induce expression

20、of the maltose receptor which promotes phage attachment as described in chapter 2. the bacteria are harvested during log phase growth and resuspended in mgs04 to enhance infection further. predetermined amountsof phage stock and bacterial culture are mixed and aliquoted into portions that correspond

21、 to 30,000 phagelplate. this plaque density is optimized so that each plaque is 1 mm in diameter and theentire plate is covered with closely packed, but distinct, plaques. after the phage and bacteria have beenincubated on ice in mgs04 to allow phage attachment to the bacteria, a small amount of mol

22、ten agarose (4550 ) is added to each tube and then the mixed contentsare poured onto a large le agar plate. thetop agarose solidifies at room temperature, fixing the position of the uninfected and infected bacterium inthe agarose layer. 將硝酸纖維膜 鋪在平板上 用針在膜 上作標(biāo)記 取下膜,編號(hào) 將第二 張膜鋪 在平板 上 按膠上孔的位 置,在膜上扎孔 取下膜,

23、編號(hào) 將母板保 存在4 plaque lift hybridzations are used to screen a library using radioactive dna probes. (a)the first step in phage library screening is to place carefully a sheet of nitrocellulseom embrane directly onto the top agar of each agar master plate. registration marks are made by piercing the mem

24、brane with a syringe needle. the membrane is then peeled off to remove a portion of the phage in each plaque. a second membrane is placed onto the same master plate and registration marks are made to generate a replica filter. 在naoh溶液 中dna變性 在nacl/tris 溶液中中和 用紫外線 照射,使 dna交聯(lián) 到膜上 用放射性探 針和膜雜交 洗脫非特異 性標(biāo)記

25、探針 (b) the phage dna on the filters is denatured with naoh, neutralized, and then covalently attached to the filter by uv crosslinking.the methods for probe labeling and filter hybrrdization are the same as those used for southern blots . once the positive signal on the autoradiographic film is prop

26、erly aligned with the agar master plate, a glass pipette is used to isolate an agar core from the precise position corresponding to a positive hybridization signal on the aligned film. 限制性酶消解用來(lái)構(gòu)建克隆dna的物理圖譜。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái) 分析限制性酶消解所產(chǎn)生的一些片段為制作限制性圖譜提供信息。根據(jù) 單酶切和雙酶切的結(jié)果，用酶（kpn和 hind ）來(lái)剪切載體，能構(gòu) 建一個(gè)sal插入片段的不完全酶切圖

27、譜。在插入dna序列中的這些被 克隆的限制性酶切片段缺少了載體的附加序列。m：標(biāo)記泳道，是含有 已知不同長(zhǎng)度的dna，用來(lái)衡量樣本dna的分子大小。1：sal- kpn；2：hind；3：sal-hind；4：kpn-hind；5：ecor； 6：sal- ecor；7： kpn- ecor；8：hind- ecor 4. digestion - restriction map 二. 粘粒粘粒( (cosmid) )載體載體 基礎(chǔ)：包含噬菌體cos位點(diǎn)的質(zhì)粒； 導(dǎo)入宿主：經(jīng)體外包裝，再轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞； 載體篩選：類似于質(zhì)粒 重組篩選：可見(jiàn)標(biāo)記插入失活和小片段插入 的陽(yáng)性篩選； 供體dna大小：3

28、0-45kbp。插入大小范圍被有 效形成噬菌斑的野生型基因組 75-105所 限制。 主要應(yīng)用：基因組文庫(kù)構(gòu)建。 真核基因組 dna 取代型噬菌體載體 cos charon 4a 機(jī)械剪切 ecori ecori 酶切 加人工接頭 酶切 連接 cos cos 體外包裝 轉(zhuǎn)染 e.coli 三.質(zhì)粒載體構(gòu)建cdna文庫(kù) 雙鏈質(zhì)粒 dna 5 3 aaaaaan 加錨定引物(寡聚 t) pbr322 5 3 aaaaan 3 5 tttt rt 酶 限制酶 用 naoh 降解 mrna 用 klenow 酶合成第二鏈 si 酶降解發(fā)夾結(jié)構(gòu) 末端轉(zhuǎn)移酶 dgtp 末端轉(zhuǎn)移酶加寡聚 c ccc ccc

29、 ggg ggg 連接 轉(zhuǎn)化 e.coli 擴(kuò)增 以質(zhì)粒為載體構(gòu)建 cdna 文庫(kù) 四.大容量克隆載體 基因組作圖中使用的高容量人工染色體克隆載體的比較基因組作圖中使用的高容量人工染色體克隆載體的比較。 載體系統(tǒng)克隆容量評(píng)價(jià) yac(酵母人工染色體)酵母著絲粒,復(fù)制起始 點(diǎn)和端粒 200kb2mbp嵌合發(fā)生率高(在基因組 中不相連的連續(xù)片段)； 不穩(wěn)定(自發(fā)缺失)； 很難與酵母染色體分離； pac(p1 人工染色體)細(xì)菌噬菌體 p1100300kb bac(細(xì)菌人工染色體)f 質(zhì)粒300kb 穩(wěn)定，但在細(xì)菌外難以維 持 macs(哺乳類人工染色 體) 基于 epstein-barr 病 毒的游

30、離載體 300kb 人類人工游離染色體(human artificial episomal chromosome,haechaec)是一類發(fā)展 中的 macs,它來(lái)自于 epstein-barr 病毒 五. cdna文庫(kù) 一一. .概況概況: : cdna文庫(kù)是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄文庫(kù)是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄mrna，并制備雙鏈并制備雙鏈 cdnacdna(double stranded cdna)來(lái)構(gòu)建的。來(lái)構(gòu)建的。 構(gòu)建構(gòu)建cdna文庫(kù)的策略是取決于：文庫(kù)的策略是取決于： (1)(1)目的目的mrnamrna的相對(duì)豐度；的相對(duì)豐度； (2)(2)篩選方法：篩選方法： 除簡(jiǎn)單的分子雜交法外還可對(duì)表達(dá)產(chǎn)物用各種方法

31、除簡(jiǎn)單的分子雜交法外還可對(duì)表達(dá)產(chǎn)物用各種方法 進(jìn)行鑒定。進(jìn)行鑒定。 cdna文庫(kù)的優(yōu)點(diǎn) (1)用用rna病毒可建立文庫(kù)；病毒可建立文庫(kù)； (2)因克隆數(shù)比基因組文庫(kù)少得多，易于因克隆數(shù)比基因組文庫(kù)少得多，易于 篩選；篩選； (3)從分化特異的細(xì)胞的從分化特異的細(xì)胞的cdna文庫(kù)中可文庫(kù)中可 分離到特異表達(dá)的基因。分離到特異表達(dá)的基因。 (4)建庫(kù)時(shí)已排除了其它的建庫(kù)時(shí)已排除了其它的rna，使假陽(yáng)，使假陽(yáng) 性率減低。性率減低。 (5) cdna文庫(kù)可在細(xì)菌中表達(dá)，可用多文庫(kù)可在細(xì)菌中表達(dá)，可用多 種策略進(jìn)行篩選。種策略進(jìn)行篩選。 但應(yīng)注意： (1) (1) 細(xì)胞中不同細(xì)胞中不同mrnamrna的

32、的豐度不同，豐度不同，低豐度低豐度的的mrnamrna要要 求很高的克隆數(shù)求很高的克隆數(shù)( (要用公式來(lái)計(jì)算要用公式來(lái)計(jì)算) )。 (2)(2)有的基因表達(dá)具有嚴(yán)格的有的基因表達(dá)具有嚴(yán)格的時(shí)空性時(shí)空性，要獲得其，要獲得其 mrnamrna并非易事。并非易事。用不同發(fā)育階段，或不同組織細(xì)胞用不同發(fā)育階段，或不同組織細(xì)胞 中的中的mrnamrna制備的制備的cdnacdna文庫(kù)會(huì)包含一些共同和特異序文庫(kù)會(huì)包含一些共同和特異序 列。這可用于分離差異表達(dá)的基因。列。這可用于分離差異表達(dá)的基因。 (3)cdna(3)cdna文庫(kù)的文庫(kù)的dnadna無(wú)內(nèi)含子、調(diào)節(jié)元件和基因間無(wú)內(nèi)含子、調(diào)節(jié)元件和基因間 d

33、nadna。不能用于基因結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)的研究。一個(gè)基因。不能用于基因結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)的研究。一個(gè)基因 經(jīng)不同的剪接可產(chǎn)生不同的部分重疊的經(jīng)不同的剪接可產(chǎn)生不同的部分重疊的cdnacdna克隆?？寺　?2.制備cdna文庫(kù) 分離代表細(xì)胞中主要分離代表細(xì)胞中主要mrna(rrnamrna(rrna和和trnatrna因其因其 豐度和大小的一致性，可以通過(guò)分級(jí)直接豐度和大小的一致性，可以通過(guò)分級(jí)直接 分離分離) )。mrnamrna的提取可以通過(guò)多胸腺嘧啶的的提取可以通過(guò)多胸腺嘧啶的 柱子分離。然后被反轉(zhuǎn)錄。柱子分離。然后被反轉(zhuǎn)錄。cdnacdna第一鏈的第一鏈的 合成用合成用oligo(dtoligo(dt

34、) )引物，因?yàn)殚L(zhǎng)的引物，因?yàn)殚L(zhǎng)的mrnamrna沒(méi)有沒(méi)有 被完全反轉(zhuǎn)錄被完全反轉(zhuǎn)錄, ,因此中部可加另一引物。因此中部可加另一引物。 第二鏈第二鏈cdnacdna的合成是用自身引物的，一的合成是用自身引物的，一 個(gè)更有效的方法是在個(gè)更有效的方法是在cdnacdna第一鏈加尾第一鏈加尾( (如如 多聚胞嘧啶多聚胞嘧啶) )，然后用，然后用oligo(goligo(g) )為引物起為引物起 始第二鏈的合成。這樣產(chǎn)生的雙鏈?zhǔn)嫉诙湹暮铣?。這樣產(chǎn)生的雙鏈cdnacdna 可以通過(guò)加接頭或同聚尾巴插入載體。可以通過(guò)加接頭或同聚尾巴插入載體。 aaaaaaa mrna (a) 隨機(jī)六堿基 (b)寡聚(d

35、t)引物 第一條 cdna 的合成 an an nnnnnn tn (c)發(fā)夾引物 (d)同聚物加尾反應(yīng) 第二條 cdna 的合成 tttttt gggggg tttttt cccccc 加接頭 1 tttttt gggggg tttttt aaaaaa cccccc aaaaaa 切除發(fā)夾 通過(guò)以下途徑將 cdna 插入載體 a. 平端克隆 tttttt b. 加接頭 aaaaaa c. 進(jìn)一步進(jìn)行同聚物加尾反應(yīng) 加接頭 2 tttttt aaaaaa 經(jīng)酶切進(jìn)行定向克隆 cdna 克隆 第三節(jié)克隆克隆dna序列的體外突變序列的體外突變 一一. .缺失突變?nèi)笔蛔?二二. .寡核苷酸定向誘變

36、寡核苷酸定向誘變 克隆克隆dna序列的體外突變序列的體外突變 (1)(1)缺失突變?nèi)笔蛔?hind hind hind ecor ecor ecor banh banh banhkpn pst pst p s t pst pst bg/ banh bgapa hind缺失 bg/ banh缺失 pst缺失 kpnecor/ 外切酶缺失 kpn apa/ 外切酶 缺失 bg/外切酶 bal31缺失 用限制性酶和外切核酸酶來(lái)產(chǎn)生缺失突用限制性酶和外切核酸酶來(lái)產(chǎn)生缺失突 變。根據(jù)質(zhì)粒中插入變。根據(jù)質(zhì)粒中插入dna的酶切圖譜，的酶切圖譜， 可以確定從克隆片段的中部或末端刪除可以確定從克隆片段的中部或

37、末端刪除 掉一些核苷酸。掉一些核苷酸。bg和和bamh剪切的剪切的 結(jié)果產(chǎn)生互補(bǔ)的黏性末端結(jié)果產(chǎn)生互補(bǔ)的黏性末端(gatc)。但如。但如 果此果此dna末端僅含有末端僅含有5突出端或是一個(gè)突出端或是一個(gè) 平端，而沒(méi)有延伸的平端，而沒(méi)有延伸的3突出端的話，外突出端的話，外 切酶切酶從從3端消解端消解dna的一條鏈。的一條鏈。 這些特點(diǎn)可被通過(guò)兩種限制酶的剪切，這些特點(diǎn)可被通過(guò)兩種限制酶的剪切， 產(chǎn)生非定向的缺失。一種剪切產(chǎn)生非定向的缺失。一種剪切55突出端突出端 ( (ecoecor r或或banbanh h)而另一種剪切而另一種剪切33突出突出 端端( (kpnkpn或或 apaapa)。外切

38、酶。外切酶-缺失缺失dnadna 必須用剪切單鏈的核酸酶必須用剪切單鏈的核酸酶s1s1來(lái)切除未被來(lái)切除未被 消解的消解的55端。外切酶端。外切酶balbal3131消解雙鏈消解雙鏈dnadna 產(chǎn)生兩端缺失，此不需要用核酸酶產(chǎn)生兩端缺失，此不需要用核酸酶s1s1處處 理就可用于平端連接。理就可用于平端連接。 接頭分區(qū)誘變接頭分區(qū)誘變 接頭分區(qū)接頭分區(qū) 誘變（誘變（linker scanning mutations）能用）能用 于產(chǎn)生一系列小的內(nèi)部缺失和一簇點(diǎn)突變。產(chǎn)生的于產(chǎn)生一系列小的內(nèi)部缺失和一簇點(diǎn)突變。產(chǎn)生的 5 和和3 端缺失的集合，每一個(gè)都含有端缺失的集合，每一個(gè)都含有8個(gè)堿基的個(gè)堿基

39、的 限制性酶切位點(diǎn)和末端相連，例如，在限制性酶切位點(diǎn)和末端相連，例如，在xhol接頭接頭 (gctcgagg)中含有一個(gè)回文中含有一個(gè)回文xhol識(shí)別序列識(shí)別序列 (ctcgag)。 通過(guò)消解選擇性缺失帶有通過(guò)消解選擇性缺失帶有xhol的片段，然后的片段，然后 連接，這樣在靶連接，這樣在靶dna(lsl -ls3 和和ls-2-ls-4) 上能產(chǎn)生嵌套上能產(chǎn)生嵌套(nested)點(diǎn)突變。但并不是在點(diǎn)突變。但并不是在 連接區(qū)中所有的核苷酸的取代都產(chǎn)生突變，連接區(qū)中所有的核苷酸的取代都產(chǎn)生突變， 對(duì)于某些位點(diǎn)的堿基對(duì)偶然地和野生型靶序?qū)τ谀承┪稽c(diǎn)的堿基對(duì)偶然地和野生型靶序 列相匹配。內(nèi)部的缺失突變

40、也能通過(guò)連接兩列相匹配。內(nèi)部的缺失突變也能通過(guò)連接兩 個(gè)不相鄰的序列個(gè)不相鄰的序列(ls2-ls3)而產(chǎn)生。而產(chǎn)生。 ttcgagttcggttcgagttcggcattgccacattgccatagtag aagctcaagccaagctcaagccgtaacggtgtaacggtatcatc ttcgagttcggttcgagttcgggcgc aagctcaagccaagctcaagcccgcga ag gc ct t ttcttcg gc c aagaagc cgagctgagct tctcg gaggaggtagtag ccccatcatc ttcgagttcggttcgagttcg

41、ggcgct tc cg gaggaggtagtag aagctcaagccaagctcaagcccgcga ag gc ctcctccatcatc ttcttcg gctcgactcgaggggcattgccatagcattgccatag aagaagc cgagctgagctccccgtaacggtatcgtaacggtatc ttcttcgctcgagctcgaggggtagtag aagaagcgagctcgagctccccatcatc 靶dna野生型 末端缺失 接頭分區(qū)突變 tcgatcgaggggcattgccatagcattgccatag ccccgtaacggtatcgtaac

42、ggtatc 內(nèi)部缺失 ls1 ls2 ls3 ls4 ls1-ls3 ls2-ls4 ls2-ls3 xhol接頭 (gctcgagg) 連接后剪切 在需要產(chǎn)生定點(diǎn)突變的在需要產(chǎn)生定點(diǎn)突變的dna區(qū)域先刪除區(qū)域先刪除8 個(gè)堿基，使一段個(gè)堿基，使一段dna序列變成缺失了序列變成缺失了5 和和3 的端的的端的dna片段，再在斷裂端分別片段，再在斷裂端分別 接上同一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)作為接頭。接上同一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)作為接頭。 酶解后通過(guò)黏性末端連接，在這個(gè)片段酶解后通過(guò)黏性末端連接，在這個(gè)片段 中，接頭正好取代原序列中的中，接頭正好取代原序列中的8bp堿基堿基, 這樣既沒(méi)有改變周圍核苷酸的距離，又

43、這樣既沒(méi)有改變周圍核苷酸的距離，又 能產(chǎn)生嵌套能產(chǎn)生嵌套(nested)點(diǎn)突變點(diǎn)突變。 m. smith美美 1984年建立核年建立核 酸的定點(diǎn)突變酸的定點(diǎn)突變 技術(shù)技術(shù) 19931993年獲得了年獲得了 諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 寡核苷酸寡核苷酸 定向誘變定向誘變 寡核苷酸引物誘導(dǎo)突變 g c g g 突變體 a atp a kleanow 轉(zhuǎn)化 ligase e.coli 4dntps t a 野生型 2.kunkel 定點(diǎn)誘變法 由由kunkel t.a.1985年建立年建立 (1)將已插入目的將已插入目的dna的的m13 (rf)轉(zhuǎn)化入轉(zhuǎn)化入 e.coli(dut-ung-)進(jìn)行復(fù)制進(jìn)

44、行復(fù)制,子鏈中摻入了子鏈中摻入了u； (2)與突變引物退火與突變引物退火:取正鏈取正鏈m13與突變引物退火與突變引物退火; (3)制備異源雙鏈：用制備異源雙鏈：用kleanow酶，和酶，和t4連接酶連接酶 在在體外合成體外合成異源雙鏈；異源雙鏈； (4)將異源雙鏈轉(zhuǎn)化入野生型將異源雙鏈轉(zhuǎn)化入野生型e.coli中，尿嘧啶脫中，尿嘧啶脫 糖苷酶糖苷酶(ung)降解含降解含u的模板，僅含突變的模板，僅含突變dna的的 模板可得到擴(kuò)增。模板可得到擴(kuò)增。 g g g u g a a m13 將已插入目的dna的m13 (rf)轉(zhuǎn)化e.coli(dut-ung-) 進(jìn)行復(fù)制,子鏈中摻入了u 取正鏈m13與

45、 突變引物退火 a 用kleanow酶和 t4連接酶在體外 合成異源雙鏈 將異源雙鏈轉(zhuǎn)化入野生 型e.coli中尿嘧啶脫糖苷 酶(ung)降解含u的模板 僅含突變 dna的模板 可得到擴(kuò)增 u u u u u u u u g a u u u u uu u u a e.colie.colidutpasedutpase，它能使，它能使dutpdutp變成變成dumpdump，dumpdump是不能是不能 作為作為dnadna合成的底物，這樣它就不再能加入合成的底物，這樣它就不再能加入dnadna中。中。 尿嘧啶尿嘧啶n-n-糖苷酶（糖苷酶（uracil n-glycosylaseuracil n-

46、glycosylase），它可），它可 以切斷混合尿苷的糖苷鍵，形成無(wú)以切斷混合尿苷的糖苷鍵，形成無(wú)pupu和和pypy位點(diǎn)位點(diǎn) （apurinic or apyrimidinicapurinic or apyrimidinic ，apap），再由），再由apap內(nèi)切內(nèi)切 酶在酶在apap位點(diǎn)切出一個(gè)缺口，進(jìn)一步進(jìn)行切除修復(fù)。位點(diǎn)切出一個(gè)缺口，進(jìn)一步進(jìn)行切除修復(fù)。 3.硫代磷酸誘變法 已知有一些核酸內(nèi)切酶已知有一些核酸內(nèi)切酶( (banbanii,ii,hindhindiiii, , pst psti,i,ncincii i等等) )不能切割不能切割硫代磷酸硫代磷酸dnadna分子。分子。 此

47、方法的步驟是：此方法的步驟是： (1)(1)將突變的寡核苷酸引物與將突變的寡核苷酸引物與m13m13重組體退火；重組體退火； (2)(2)在具有在具有硫代磷酸硫代磷酸的條件下，加入的條件下，加入dna poldna pol合成新鏈。合成新鏈。 如此產(chǎn)生的異源雙鏈分子中，突變體鏈?zhǔn)橇虼姿崛绱水a(chǎn)生的異源雙鏈分子中，突變體鏈?zhǔn)橇虼姿?化的化的dna;dna; (3)(3)經(jīng)連接酶封口后經(jīng)連接酶封口后, ,用用ncincii i消化異源雙鏈。那么被切消化異源雙鏈。那么被切 割的將是非硫代磷酸化的親本鏈。割的將是非硫代磷酸化的親本鏈。 硫代脫氧胞苷三磷酸硫代脫氧胞苷三磷酸(dctp s) 一種硫代核

48、苷酸的分子結(jié)構(gòu)一種硫代核苷酸的分子結(jié)構(gòu) nh2 n o o s o n hopopopoch2 | | | o oh oh oh h h h h h oh 硫代磷酸誘變法 g g g ncii 位點(diǎn) a atp a a kleanow ncii ligase 外切酶 硫代 核苷酸 g g c kleanow 轉(zhuǎn)化 ligase 篩選突變體 4.pcr誘變法 以上方法的缺點(diǎn)是突變位點(diǎn)僅限于靶dna 的5端，而我們也希望在中心部位進(jìn)行誘變 欲 達(dá)此目的可用pcr法。因pcr產(chǎn)生的單個(gè)錯(cuò)配 堿基經(jīng)擴(kuò)增會(huì)摻入到模板序列中，最終產(chǎn)生突 變體的雙鏈。 后 higuchi,r等又建立了重組pcr，此法 可在

49、dna序列的任何部位產(chǎn)生突變位點(diǎn)。 混合,變性,退火 靶dna片段 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 引物b 引物c 不能擴(kuò)增 能擴(kuò)增 dna pol 用引物b和c進(jìn)行pcr 3 3 3 5 5 5 5.大引物誘變法 重組pcr誘變法需4種引物，三輪擴(kuò)增， 步驟繁瑣。于是后人又提出大引物誘變法。 pcr法的缺點(diǎn)是： (1)擴(kuò)增的產(chǎn)物常需要連接到載體上，然后 才能對(duì)突變的基因進(jìn)行表達(dá)，研究。 (2)dna的保真度低，產(chǎn)物需要測(cè)序。 53 pcr 多次循環(huán) 大引物 大引物誘變法 pcr

50、 pcr 5 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 3 實(shí)例實(shí)例3基因編碼序列的丙氨酸掃描誘變基因編碼序列的丙氨酸掃描誘變 研究目標(biāo)研究目標(biāo) 凋亡（apoptosis）是指在胚胎發(fā)生或在成體 組織細(xì)胞更新時(shí)，在特定的時(shí)間內(nèi)，在各 種組織中細(xì)胞的程序性死亡。一位細(xì)胞生 物家發(fā)現(xiàn)一個(gè)小的分泌蛋白能通過(guò)和fas蛋 白結(jié)合并使其失活，從而阻斷凋亡。fas蛋 白存在于某些特定細(xì)胞表面的一種膜結(jié)合 受體。這位科學(xué)家將她新發(fā)現(xiàn)的20 kda“抗 -凋亡”蛋白命名為“青春之泉”（fountain of youth ，foy）。 細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)是細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)是dna降解產(chǎn)生約為降解產(chǎn)

51、生約為180- 200bp的整倍數(shù)的整倍數(shù)dna片段，而這正好是纏片段，而這正好是纏 繞組蛋白寡聚體的長(zhǎng)度，提示染色體繞組蛋白寡聚體的長(zhǎng)度，提示染色體dna 恰好是在核小體與核小體的連接部位被切恰好是在核小體與核小體的連接部位被切 斷，這種斷，這種dna的有控降解是一種內(nèi)源性核的有控降解是一種內(nèi)源性核 酸內(nèi)切酶在核小體連接部位切斷染色體酸內(nèi)切酶在核小體連接部位切斷染色體 dna，在瓊脂糖凝膠電泳中就呈現(xiàn)特異的，在瓊脂糖凝膠電泳中就呈現(xiàn)特異的 梯狀梯狀ladder圖譜，而壞死呈彌漫的連續(xù)圖圖譜，而壞死呈彌漫的連續(xù)圖 譜譜。 細(xì)胞凋亡的過(guò)程細(xì)胞凋亡的過(guò)程 大致可分為以下幾個(gè)階段：大致可分為以下幾個(gè)

52、階段： 接受凋亡信號(hào)接受凋亡信號(hào) 凋亡調(diào)控分子間的相互作用凋亡調(diào)控分子間的相互作用 蛋白水解酶的活化蛋白水解酶的活化半胱天冬蛋白酶半胱天冬蛋白酶 （caspase） 進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過(guò)程進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過(guò)程 細(xì)胞凋亡的膜受體通路：細(xì)胞凋亡的膜受體通路： fas是一種跨膜蛋白，它與是一種跨膜蛋白，它與 fasl結(jié)合可以啟動(dòng)凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細(xì)胞凋亡。結(jié)合可以啟動(dòng)凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細(xì)胞凋亡。 首先配體誘導(dǎo)首先配體誘導(dǎo)受體三聚體化受體三聚體化，然后在細(xì)胞膜上形成，然后在細(xì)胞膜上形成 凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物，通過(guò)凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物，通過(guò)fas分子啟動(dòng)致死性信號(hào)轉(zhuǎn)分子啟動(dòng)致死性信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)，最終使細(xì)胞死亡。導(dǎo)，最終使細(xì)胞死亡

53、。 fas普遍表達(dá)，可出現(xiàn)于多種細(xì)胞表面，但普遍表達(dá)，可出現(xiàn)于多種細(xì)胞表面，但 fasl通常只出現(xiàn)于活化的通常只出現(xiàn)于活化的t細(xì)胞和細(xì)胞和nk細(xì)胞，因而細(xì)胞，因而 已被活化的殺傷性免疫細(xì)胞，往往能夠以凋亡途徑已被活化的殺傷性免疫細(xì)胞，往往能夠以凋亡途徑 置靶細(xì)胞于死地。置靶細(xì)胞于死地。 fas分子胞內(nèi)段帶有特殊的死亡分子胞內(nèi)段帶有特殊的死亡 結(jié)構(gòu)域（結(jié)構(gòu)域（dd, death domain）。）。 她用她用“抗抗- foy抗體抗體”從分泌表達(dá)的從分泌表達(dá)的cdna文庫(kù)文庫(kù) 中分離了中分離了foy cdna。通過(guò)。通過(guò)foy編碼序列編碼序列缺失作缺失作 圖圖鑒別出一個(gè)鑒別出一個(gè)60個(gè)氨基酸個(gè)氨基

54、酸的小區(qū)域，此區(qū)域?qū)Φ男^(qū)域，此區(qū)域?qū)?測(cè)定測(cè)定fas蛋白的失活蛋白的失活是絕對(duì)需要的。是絕對(duì)需要的。 另一位結(jié)構(gòu)生物學(xué)家用家用另一位結(jié)構(gòu)生物學(xué)家用家用x-衍射結(jié)晶學(xué)衍射結(jié)晶學(xué) 解析了解析了foy的蛋白結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上她決定用的蛋白結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上她決定用 寡核苷酸寡核苷酸-定向誘變?cè)诙ㄏ蛘T變?cè)?0個(gè)氨基酸的個(gè)氨基酸的foy功能域功能域 的不同位點(diǎn)上系統(tǒng)地改變殘基，以此獲得另一的不同位點(diǎn)上系統(tǒng)地改變殘基，以此獲得另一 個(gè)功能性資料。個(gè)功能性資料。 可利用的信息和試劑可利用的信息和試劑 （1）將含有）將含有185 氨基酸氨基酸的的 foy 可讀框（可讀框（open reading frame ，

55、orf） 的的650 bp foy cdna克克 隆到隆到e. coli 表達(dá)載體中，用來(lái)產(chǎn)生毫克量的功表達(dá)載體中，用來(lái)產(chǎn)生毫克量的功 能性能性foy蛋白。在組織培養(yǎng)基中加蛋白。在組織培養(yǎng)基中加1 ng/ml 可溶可溶 性重組性重組foy ，來(lái)阻止在檢測(cè)中，來(lái)阻止在檢測(cè)中fas介導(dǎo)的凋亡。介導(dǎo)的凋亡。 在細(xì)菌中表達(dá)的相同來(lái)源的在細(xì)菌中表達(dá)的相同來(lái)源的foy 蛋白用于蛋白用于蛋白蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)的測(cè)定質(zhì)結(jié)構(gòu)的測(cè)定和基因和基因 foy-fas體外結(jié)合的研究體外結(jié)合的研究。 （2）人類）人類fas基因定位于基因定位于10q23，其，其cdna長(zhǎng)為長(zhǎng)為 2534bp，編碼，編碼325個(gè)氨基酸殘基組成的個(gè)氨

56、基酸殘基組成的36kd的跨膜的跨膜 蛋白：蛋白：其其膜外膜外n端區(qū)為端區(qū)為155個(gè)氨基酸，含有信號(hào)肽個(gè)氨基酸，含有信號(hào)肽 和膜受體部分，能與其配體和膜受體部分，能與其配體fasl結(jié)合啟動(dòng)凋亡的信結(jié)合啟動(dòng)凋亡的信 號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。中部為跨膜區(qū)，由中部為跨膜區(qū)，由15個(gè)氨基酸殘基個(gè)氨基酸殘基 構(gòu)成。構(gòu)成。膜內(nèi)的膜內(nèi)的c端區(qū)含有端區(qū)含有145個(gè)氨基酸殘基，其中個(gè)氨基酸殘基，其中 的的80個(gè)氨基酸稱為個(gè)氨基酸稱為“死亡功能域死亡功能域”(death dormain)， 在傳導(dǎo)凋亡信號(hào)中起重要作用。在傳導(dǎo)凋亡信號(hào)中起重要作用。 155aa含信號(hào) 肽和受體 15aa 膜內(nèi)c端區(qū)145aa 死亡功能域 80aa fas蛋白的結(jié)構(gòu) （3）已知）已知foy功能域相應(yīng)的核苷酸序列有功能域相應(yīng)的核苷酸序列有10個(gè)密碼子所個(gè)密碼子所 編碼的氨基酸是帶電荷的氨基酸（編碼的氨基酸是帶電荷的氨基酸（lys、arg、glu和和 asp），可能是丙氨酸（），可能是丙氨酸（ala）取代的一個(gè)很好的靶點(diǎn)。）取代的一個(gè)很好的靶點(diǎn)。 她設(shè)計(jì)了她設(shè)計(jì)了6個(gè)寡核苷酸的引物，用個(gè)寡核苷酸的引物，用丙氨酸丙氨酸取代所有的取代所有的10 個(gè)帶電荷的氨基酸個(gè)帶電荷的氨基酸。 （4）用一個(gè)）用一個(gè)foy 細(xì)菌表達(dá)載體細(xì)菌表達(dá)載體pet