小鼠星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)及分離純化實驗方案

1、小鼠星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)及分離純化實驗方經(jīng)過相關(guān)文獻閱讀，參考了眾多對于小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)方案，對比了不同方案的利 弊優(yōu)缺，整合了相對符合本實驗室條件和實驗要求的方法，如有其他變更方案, 以修改后為準。1. 實驗材料與試劑剪刀、小銀子、小毛刷、DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、馬血清、0.25%, 0.05%胰蛋白酶、PBS液、青霉素、鏈霉素、培養(yǎng)皿離心管、50 mL細胞培養(yǎng)瓶、CO2 恒溫細胞培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、細胞板、熒光標記二抗、0.4% Trypan Blue 染色液、抗小鼠0X42單克隆抗體和新生SD小鼠等試劑配比：(1) DMEM 10:10:1DMEM, 10%FBSf 10%H

2、orse Serum, 1% Penicillin/Streptomycin (P/S)(2) DMEM 5:5:1DMEM, 5% FBS, 5% of Horse Serum, 1% P/S(3) SERUM FREE MEDIUM + GROWTH FACTORS (DMEM/F12無血清培養(yǎng)基+生長因子)25ji g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白,10nM生物素，30 nM亞硒酸鈉,g/ml putrescine （腐 胺），5p g/ml胰島素，20 nM hydrocortisone （氫化可的松），20 nM progesterone （孕激素）,1%P / S+生長因子（5ng/ ml的血小板

3、衍生生長甘軻遷TJW交電站工握因子PDGF-AA和5ng / ml堿性成纖維細胞生長因子bFGF)胰蛋口酶/ EDTA溶液0.05%胰蛋口酶+0.02%EDTA在W / O內(nèi)Ca2+ / Mg2 + 的HBSSDMEM/F12 containing 25 x g/ml transferrin, 10 nM biotin, 30 nM sodium selenite, 1 g/ml putrescine, 5 p g/ml insulin, 20 nM hydrocortisone, 20 nM progesterone, 1% P/S + Growth Factors (5 ng/ml PDG

4、F-AA and 5 ng/ml bFGF) Trypsin/EDTA solution 0.05% Trypsin + 0,02% EDTA in HBSS w/o Ca2+/Mg2+Laminar flow hoodDissecting magnifying glass Water bath at 37QCHumidified tissue culture incubator (37QC, 5% CO2) Sterilized microdissecting instruments: large dissecting scissors, mouse-teeth forceps, curve

5、d forceps and fine Dumont forceps Orbital Shaker (Boeco OS 20) Tabletop centrifuge50ml plastic conical tubes (Sarstedt, 62.547.004)T75 cm2 tissue culture flaskswith plug-seal (BD Falcon, 137787) Tissue culture plates (Falcon) Petri dishes (Sterilin) 30 p m sterile nylon mesh (Saatilene, Hitech)2 實驗步

6、驟21星形膠質(zhì)細胞的混合培養(yǎng)取新生SD小鼠若干只(出生24h內(nèi)),在無菌條件下斷頭，迅速剪開顱骨，取出腦組 織至盛有冷PBS液的培養(yǎng)皿中反復沖洗以去除血污；再把全腦移入另一盛有PBS液的培養(yǎng)皿中，用小毛筆輕輕刷去腦表面的腦膜和血管，用PBS液沖洗后 剪去腦干僅留大腦半球；用小剪刀充分剪碎腦組織，加入比組織塊總量多3050 倍的0.05%胰酶，再移入50 mL離心管，用吸管反復吹打消化至肉眼觀察無明 顯的腦組織團塊；加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉 素和100 ug/mL鏈霉素）終止消化，再次反復吹打制成單細胞懸液，配平, 1000 r/ min,離心5min

7、,棄上清；加定量完全培養(yǎng)液再次制成細胞懸液，更具實 驗需要接種入若干個50 mL細胞培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿中，置于5%CO2恒溫細胞培 養(yǎng)箱（37度）培養(yǎng)；3 h后更換1次培養(yǎng)液，以后每3 d換1次液，并在鏡下 觀察細胞的生長和存活情況。22星形膠質(zhì)細胞的分離和純化將培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中的混合膠質(zhì)細胞上清弄去，用0.01mol/L PBS洗2遍。用無血 清培養(yǎng)基0.25%胰酶6 mL加入培養(yǎng)瓶，37C消化15 min左右，至鏡下觀察 到大部分星形細胞脫落，將含有星形膠質(zhì)細胞的消化液立即置于等量含10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基中止消化，1000 r/ min離心5 min,再用PBS洗2遍后，重懸

8、于含10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基中，種于培養(yǎng)瓶中；將培養(yǎng)瓶置于37C細胞培 養(yǎng)箱穩(wěn)定貼壁1 d后，再用37C恒溫定軌搖床，200 r/min振搖2 h;吸取上清液 棄去（其中主要包括一些小膠質(zhì)細胞和部分少突膠質(zhì)細胞），貼壁細胞采用0. 25%胰酶37C消化后立即置于含10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基中，終止消化 后,1000 r/ min離心5 min,棄上清，將沉淀細胞重懸于含10%FBS的DMEM/F12培 養(yǎng)基，計數(shù)后調(diào)整細胞密度106/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，穩(wěn)定24h后可用于后 續(xù)實驗。23星形膠質(zhì)細胞的免疫細胞化學染色鑒定 本實驗建議選擇0X42作為小膠質(zhì)細胞的標志物

9、，能同時反映小膠質(zhì)細胞的激活 狀態(tài)，以0X42抗小鼠CD11b/c抗體免疫熒光染色法鑒定星形膠質(zhì)細胞。具體步驟：(1) 待小膠質(zhì)細胞長成片后，取出蓋玻片，依次用PBS液清洗3次，每次5 min,冰 丙酮固定15 min,干燥5 min, PBS漂洗3次；(2) 特異性抗體:按照說明書稀釋比要求稀釋抗體，加入抗體，放置37C孵育60min, 進行抗體標記。洗滌：1 x PBS (pH 7.4 )洗滌3次/15分鐘，晾干。(4)加入熒光標記抗體，37C孵育30mino 1 x PBS (pH 7.4 )洗滌3次/15分 鐘，晾干。封片：封片劑封片。(6)鏡檢：熒光顯微鏡下觀察，膠質(zhì)細胞包質(zhì)呈現(xiàn)較強黃綠色熒光，細胞核周圉 尤其明顯。注意事項1、選材注意選取新生小鼠(24h內(nèi))。取材過程盡可能保證無菌，盡量剔除腦膜 及血管和海馬部分。2、注意盡可能消除腦組織表面的殘血，避免血細胞及某些血清成分對膠質(zhì)細胞 貼壁的影響。3、應嚴格掌握好酶的消化濃度和消化時間。4、嚴格控制膠質(zhì)細胞培養(yǎng)條件。包括細胞培養(yǎng)用液(培養(yǎng)基，生長因子，血清,抗生素)的質(zhì)量，濃度