未甲基化cpg脫氧寡聚核苷酸（cpg odn）對小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生ige的抑制作用

1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文未甲基化CpG脫氧寡聚核苷酸（CpG ODN）對小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IgE的抑制作用姓名：謝海瑞申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：兒科學(xué)指導(dǎo)教師：李文益20070520叟！塑芏焦壘圭圭堅薹絲四鰱氫裹鐾掛螢酸魚鯉盟：基硅塑照主壘！鯉控墅掛星未甲基化脫氧寡聚核苷酸（ ）對小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的抑制作用臨床碩士研究生：謝海瑞指導(dǎo)老師：李文益教授專業(yè)：兒科學(xué)摘要變態(tài)反應(yīng)性疾?。?）是指機體被某種變應(yīng)原物質(zhì)致敏后，再次與類似變應(yīng)原性的物質(zhì)接觸后所產(chǎn)生的異常或過強的免疫反應(yīng)所導(dǎo)致的疾病。笛床常見變態(tài)反應(yīng)性疾病包括支氣管哮喘、過敏性鼻炎和蕁麻疹等。其中支氣管哮喘在全世界范圍內(nèi)是最常見的慢性病之一，發(fā)病率呈上升

2、趨勢。目前針對變態(tài)反應(yīng)性疾病的治療手段主要是藥物對癥治療，傳統(tǒng)的免疫治療也因自身的局限性使其在臨床的應(yīng)用受到限制。因此尋求新的有效的治療方法就顯得非常重要。目前認(rèn)為，變態(tài)反應(yīng)性疾病是以型免疫應(yīng)答為主的慢性炎癥。近來研究發(fā)現(xiàn)，未甲基化脫氧寡聚核苷酸（，治療變態(tài)反應(yīng)性疾病取得了顯著療劃。有研究認(rèn)為， 是通過直接或問接激活多種免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生型細(xì)胞因子，如、等，從而抑制型細(xì)胞因子、的產(chǎn)生川，進(jìn)一步抑制細(xì)胞產(chǎn)生，抑制嗜酸細(xì)胞聚叟墅芏焦造圭圭里羹焦匹鰱氫塞塞絲豎酸啞業(yè)盟塵鼠鯉塑斑亡生醴煎地型拄旦集和活化。但亦有研究發(fā)現(xiàn)，去除或的作用， 仍然可以抑制變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生【。因此，有關(guān) 的作用機理還有待進(jìn)一步研

3、究。為此，我們以小鼠脾細(xì)胞的產(chǎn)生為指標(biāo)，從不同角度研究了 的抑制作用及其可能的機制，使得對 的認(rèn)識更加全面，為臨床治療提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。材料和方法取正常雌性小鼠，制備單個小鼠脾細(xì)胞懸液或純化細(xì)胞懸液，在存在或不存在情況下，用刺激培養(yǎng)細(xì)胞，用方法檢測培養(yǎng)上清中產(chǎn)生的量，觀察不同時間或不同濃度加入 對小鼠脾細(xì)胞或純化細(xì)胞產(chǎn)生的影響。在 存在的情況下，用一刺激培養(yǎng)細(xì)胞，并分別加入抗或抗，收集培養(yǎng)天的細(xì)胞上清液，用方法檢測產(chǎn)生的量，觀察抗或抗對抑制產(chǎn)生作用的影響。在 存在或不存在情況下，用或不用標(biāo)記后，再用刺激培養(yǎng)細(xì)胞，天后收集細(xì)胞，經(jīng)相應(yīng)熒光抗體染色后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，觀察 對細(xì)胞分裂和活化

4、的影響。結(jié)果未經(jīng)任何刺激的正常小鼠脾細(xì)胞不產(chǎn)生，而當(dāng)一刺激后能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量， 在 時開始抑制的產(chǎn)生， 時達(dá)顯著抑制。 在培養(yǎng)小時內(nèi)加入時，能完全抑制的產(chǎn)生，隨加入時魚！ ！塑莖絲迨主圭生基地匹鰱氫壅鐾籃笪壁四垡型越！基照麴照亡生！醇笪控剜縫旦問的推遲抑制作用呈逐漸減弱趨勢。在給予 同時加入抗或抗單克隆抗體可使水平較單用 組明顯增高，但與乙組比較仍明顯減低）在純化細(xì)胞培養(yǎng)組，明顯抑制由刺激產(chǎn)生的，差異具統(tǒng)計學(xué)意義（）。未經(jīng)任何刺激的小鼠細(xì)胞、和只有極少表達(dá)：經(jīng)刺激后，細(xì)胞表面，的表達(dá)有所增加，而刺激組則顯著地促進(jìn)了、及的表達(dá)。未經(jīng)任何刺激的小鼠細(xì)胞不發(fā)生分裂，在刺激下，細(xì)胞分裂次，而加入組細(xì)

5、胞只分裂了次。結(jié)論能夠抑制刺激小鼠脾細(xì)胞和純化細(xì)胞產(chǎn)生，其抑制作用呈劑量依賴性和時間限制性?？购涂箚慰寺】贵w不能完全拮抗 對產(chǎn)生的抑制作用。裂。顯著促進(jìn)了細(xì)胞活化，但抑制了刺激引起細(xì)胞分抑制產(chǎn)生的部分機制可能是通過直接作用于細(xì)胞發(fā)揮作用，而且可能與抑制細(xì)胞分裂有關(guān)。關(guān)鍵詞：；：脾細(xì)胞；純化細(xì)胞：小鼠叟塑生焦造童圭里差韭畦戰(zhàn)氫壅基籃萱醴匿啦盟！基鯉塑墼芒生！匹鰹地趔韭旦 ： ： ： ， ， ， ， ， （） 【 ， ， ， ， ， 。， 叟！題莖焦遣童圭里莖絲匹雎氫蹇鐾筮萱醒立毪！盟！基鯉墊盥亡生蛭鮑婭劐佳圍 ， ， ？ 一。 ， ， ， ， 魚：！塑芏焦迨童圭里莖絲匠熊氫塞毽絲繾墼叢盟！基鰹塑

6、厘生生！畦地地劍韭盈 ， 叫一 （） ， （髓） ，一 、 ， ， ， ， 叟！塑生絲絲塞圭望墨伍匹勝氫蹇壅燕塹酸魚墮墮盟塵基鯉麴墼！竺生！匝鮑控剜掛璺吖 ； ：； ；叟！：！墅芏焦堡圭圭里基絲匹題氳囊鐾攘篷酸西垡型越！鼠鰉墊照亡生！鰉曲婭趟掛里第章引言、變態(tài)反應(yīng)性疾病概述變態(tài)反應(yīng)性疾病包括支氣管哮喘（哮喘）、變態(tài)反應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性皮炎、食物及藥物過敏等。在變態(tài)反應(yīng)性疾病中，以哮喘研究最多，其流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示：隨著環(huán)境污染、吸煙、食品工業(yè)發(fā)展和居民盛行室內(nèi)裝修，哮喘的患病率逐年升高，發(fā)病率在地區(qū)問有很大差異，歐美一些國家可高達(dá)，其中巴西、哥斯達(dá)黎加、秘魯和烏拉圭。兒童的哮喘發(fā)病率在，澳大利

7、亞，每個歲以下的兒童中就有一個患哮喘。年抽樣調(diào)查我國歲兒童哮喘的患病率平均為，“，年再次進(jìn)行的抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，哮喘患病率為，較之年前明顯升高。世界衛(wèi)生組織認(rèn)為：全球哮喘發(fā)病率平均每年增加，全世界哮喘患者逾億，每年死于哮喘的病人達(dá)萬多【 。據(jù)比利時過敏研究所的估計，近十年來，西歐的哮喘患者增加了一倍。在美國，自年代初期以來，哮喘猛增了，因此說，哮喘是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病。隨著對各種炎癥性細(xì)胞及其介質(zhì)，包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在內(nèi)的傳統(tǒng)“結(jié)構(gòu)”細(xì)胞及其分泌成分，細(xì)胞因子和粘附因子等的廣泛而深入的研究，人們更加明確地認(rèn)識到變態(tài)反應(yīng)性疾病是由多種細(xì)胞、數(shù)十種炎性介質(zhì)、細(xì)胞

8、因子參與的炎癥過程。機體對特異性過敏原產(chǎn)生的超強免疫反應(yīng)是變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。而的產(chǎn)生在變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病過程中起著核心作用。目前普遍承認(rèn)的變態(tài)反應(yīng)的發(fā)病機制是：過敏原一抗原提呈細(xì)胞一細(xì)胞激活一類細(xì)胞增加一細(xì)胞激活一特異性分泌增加一與肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞表面的叟！墅芏焦亟塞圭里差絲啵雌氫塞塞拯藍(lán)醒啦盟！基鯉塑照亡壘！匝曲地型掛圍受體結(jié)合一誘導(dǎo)階段效應(yīng)階段一再次進(jìn)入體內(nèi)的過敏原與肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞表面的結(jié)合一肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒一啟動早期反應(yīng)的病理過程（病人出現(xiàn)臨床癥狀）一遲發(fā)期反應(yīng)的病理過程。目前對于過敏性疾病的治療手段主要從兩個方面考慮：一方面盡可能找出變應(yīng)原，避免與其

9、再次接觸；另一方面，阻斷或干擾變態(tài)反應(yīng)的某些環(huán)節(jié)、從而防止其發(fā)生發(fā)展。目前，臨床經(jīng)常采用的治療是：一、藥物治療，主要通過抑制前列腺素（）的產(chǎn)生（如阿司匹林腎上腺皮質(zhì)激素）、抑制介質(zhì)釋放（如色甘酸二鈉、腎上腺素、異丙腎上腺素、氨茶堿腎上腺皮質(zhì)激素）、拮抗生物活性介質(zhì)（如苯海拉明、撲爾敏、息斯敏、阿司匹林）、改善器官反應(yīng)（如葡萄糖酸鈣、腎上腺素、腎上腺皮質(zhì)激素、抗膽堿藥 受體激動荊）等途徑來中和效應(yīng)分子與炎癥介質(zhì)或抑制炎癥細(xì)胞的功能來進(jìn)行抗過敏治療。隨著制藥工業(yè)的發(fā)展，藥物治療已使大多數(shù)哮喘、鼻炎等變態(tài)反應(yīng)性疾病獲得有效控制，但對部分患者控制并不理想。二、特異性脫敏療法（變應(yīng)原特異性免疫治療），即

10、采用特異性變應(yīng)原通過注射或其它途徑多次接觸患者，以提高機體對致敏原的耐受能力，從而達(dá)到患者接觸較大劑量變應(yīng)原也不發(fā)生臨床癥狀的治療方法。對于這種傳統(tǒng)的免疫治療，用于治療變應(yīng)性哮喘已有多年。盡管從理論上講，它亦能下調(diào)反應(yīng)，使已經(jīng)存在的抗原特異性的反應(yīng)向反應(yīng)轉(zhuǎn)變，從而抑制的合成。但在臨床應(yīng)用中，療效不夠明顯，而且療程長，使患者難以堅持，更令人不安的是抗原進(jìn)入體內(nèi)可能會引起嚴(yán)重的變態(tài)反應(yīng)，故而傳統(tǒng)免疫治療在哮喘治療中的地位受到嚴(yán)重挑戰(zhàn)【，。因此，仍需尋找和探索新的治療手段。、的研究概況以往人們一直認(rèn)為，細(xì)菌不具有免疫原性，不能刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。自年代，有人提出外源性的可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生干擾

11、素的假說后，直叟！塑塋焦迨主圭望莖絲匹照氫裹摧絲登壁魚塑！盟坐基畦堡墮亡生延煎塑趔佳盟到年，等【發(fā)現(xiàn)，從卡介苗（）中提取的片段可以激活小鼠的自然殺傷（）細(xì)胞，誘導(dǎo)其分泌干擾素（），產(chǎn)生抗腫瘤活性，使人們對除基因遺傳以外的另一重要功能，即的免疫學(xué)功能有了初步的認(rèn)識。麗且研究發(fā)現(xiàn)，是細(xì)菌而不是脊椎動物的可以誘導(dǎo)細(xì)胞的激活。采用人工合成寡聚脫氧核苷酸的方法研究發(fā)現(xiàn)，具有免疫刺激活性的片段均含有非甲基化二核苷酸核心（“”代表磷酸二酯鍵）及其特定的側(cè)翼序列，其結(jié)構(gòu)特征為嘌呤嘌一嘧啶嘧啶的六堿基序列。等【 稱之為基序（，等【 】稱其為免疫刺激序列（ ，）。另外有人將含有基序的稱為 ，將含有基序的寡核苷酸稱

12、為。最近研究發(fā)現(xiàn)， 在小鼠【棚或猴子的哮喘或蕁麻疹模型中可以阻止變態(tài)反應(yīng)癥狀的發(fā)生。實驗已證明， 可以腹腔注射【】，也可以氣道栩、口服哪、經(jīng)皮膚給藥，不但可以抑制變態(tài)反應(yīng)的急性發(fā)作所導(dǎo)致的氣道高反應(yīng)性、粘液異常分泌、平滑肌痙攣及氣道內(nèi)嗜酸細(xì)胞浸潤等癥狀，而且阻止慢性進(jìn)程【，并對具有遺傳易感基因的新生鼠亦有劃】。最近亦有報道，用豚草， 耦聯(lián)抗原在豚草生長季節(jié)治療過敏性鼻炎取得了一定的效果【。目前，盡管 的激活免疫應(yīng)答方面的作用已經(jīng)明確，但其作用機理并不十分清楚。研究認(rèn)為， 對機體各種免疫細(xì)胞都具有免疫刺激作用，它通過內(nèi)吞作用和或與樣受體（）相互作用能直接影響細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。它能引起細(xì)

13、胞分化，直接刺激細(xì)胞分泌、等細(xì)胞因子和免疫球蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)，包括 、和。能直接激活抗原遞呈細(xì)胞（），包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，誘導(dǎo)其產(chǎn)生一、等型為主的細(xì)胞因子，并可上調(diào)和共刺激分子的表達(dá)。 不能直接活化叟！塑圭莖焦造圭圭型基絲匹避氫塞鐾焦萱酸畦墜鞋塵鼠硅墅照主生！曼鯉控剜拄圍細(xì)胞。但它能在抗原提呈細(xì)胞存在時使淋巴細(xì)胞上類抗原與共刺激分子（、與）的表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)型免疫應(yīng)答。抑制型免疫應(yīng)答，進(jìn)一步來抑制的產(chǎn)生，阻止變態(tài)反應(yīng)發(fā)生。大量動物的哮喘模型，】及人單個核細(xì)胞體外刺激試驗，】也證明 使類細(xì)胞因子（、等）含量升高，而類細(xì)胞因子（如，等）及含量降低。但亦有研究證明

14、 對變態(tài)反應(yīng)的抑制作用不依賴于類的細(xì)胞因子【。由此，我們推斷， 也許還通過細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)以外的其他途徑來實現(xiàn)抑制的產(chǎn)生，因此，我們以小鼠脾細(xì)胞的產(chǎn)生為指標(biāo)，試圖研究 在細(xì)胞群體水平、單個細(xì)胞水平上對細(xì)胞產(chǎn)生的作用，為臨床應(yīng)用研究提供了實驗依據(jù)。叟！塑空垡籃圭圭塑薹氆匠鰱氫裹鏊毯籃四！啦！盟：基腔堡照主生匹鮑地題佳旦第章材料與方法動物來源雌性、鼠，周齡，購自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心。主要試劑和材料 （）由上海生工生物工程公司合成，全鏈硫代磷酸化修飾，純化。 抗小鼠單克隆抗體（）抗小鼠單克隆抗體（叫）抗小鼠乙單克隆抗體（）抗小鼠單克隆抗體（）抗小鼠單克隆抗體（）公司公司公司公司公司公司德國美國美國

15、美國美國美國抗小鼠單克隆抗體（）公司抗小鼠單克隆抗體（）公司美國美國底物抗小鼠 試劑盒或孔平底培養(yǎng)板公司公司公司美國美國美國公司美國牛血清白蛋白（）北京鼎國生物公司中國叟！蘭蘭！塑堂焦鹼垂垂生基焦鯉照氫塞鐾籃萱酸！匹立型越基礁麴墮亡生！呈曲挫剜佳旦胎牛血清（）巰基乙醇青、鏈霉素培養(yǎng)液孔平底板主要儀器臺式冷凍離心機一超凈工作臺二氧化碳培養(yǎng)箱倒置顯微鏡生物顯微鏡超低溫冰箱 通用型酶標(biāo)儀酸度計杭州四季清公司公司公司公司公司公司公司 中國美國美國美國美國美國美國德國新加坡英國日本日本美國美國德國旋渦震蕩器高壓滅菌鍋德國日本 電子消毒柜康寶公司中國電子分析天平上海分析儀器廠中國電動移液器法國叟：題圭莖焦

16、鱟塞圭里薹焦魚睦墅墨裹鐾絲董熊壁壘墜！盟！基睦塑墅芝生！畦盟越翻掛星流式細(xì)胞儀超聲清洗機低溫冰箱低溫冰箱超純水制備系統(tǒng)電熱恒溫水槽搖床（ ）主要試劑配制方法：配制：-25 -20，公司昆山超聲儀器廠海爾公司海爾公司博迅公司美國中國江蘇中國青島中國青島美國中國上海英國超純水充分混勻，調(diào)值至，高壓滅菌分鐘，保存。液的配制：葡萄糖酚紅 超純水充分混勻，調(diào)到，過濾，分裝，保存。叟 ：蘭！一墅芏焦逢塞紅細(xì)胞裂解液的配制：圭生羹些匹避氫裹鐾絲萱壁垂墮盟！匭畦塑照亡生！蛭曲弛劐拄盟超純水充分混勻，調(diào)至，過濾，分裝，保存。完全 的配制： 培養(yǎng)液（已滅活） 充分混勻，調(diào)為，無菌岬濾膜過濾除菌。保存。免疫磁珠分選

17、細(xì)胞緩沖液幾混勻，調(diào)至左右，保存。細(xì)胞標(biāo)記緩沖液及樣本稀釋液 充分混勻，調(diào)至，保存。叟！竺 ！塑生堡迨圭圭里基絲匝鰱氫塞塞拭篷酸照型盟塵鼠硅塑照主生！畦鯉控劁韭星細(xì)胞表面分子染色緩沖液配制：混勻，調(diào)至左右，保存實驗分組每組實驗均設(shè)置陰性對照組（組）、陽性對照組（組）、實驗組（因給予的刺激條件不同而分為多組）。具體分組如下（小鼠脾細(xì)胞懸液簡寫為，純化細(xì)胞懸液簡寫為）：實驗： 豹劑量依賴實驗陰性對照組：陽性對照組： ；（）（ ）； 組：（）；）（）： 組：（）（）（）；組：（）（，）（）；實驗： 的時間關(guān)系實驗陰性對照組：陽性對照組： ；，（）（）； 組：（）（，培養(yǎng)時加入）； 組：（）（）（，培

18、養(yǎng)后第天加入）； 組：（）（ ）（；（，培養(yǎng)后第天加入）；組：（）（）（。培養(yǎng)后第天加入）；叟！塑芏焦迨圭圭衛(wèi)基絲些匹鞋氫裹鐾絲螢壁！旦盟盟：退壁塑世亡生醇曲地趔佳旦 組：（）（）（ ，培養(yǎng)后第天加入）；組：（）（）（ ，培養(yǎng)后第天加入）實驗；及【一對 作用的影響實驗陰性對照組： ；陽性對照組：（）（）； 組：（）（）（）：組：（ ）（）（一組：（）“）（實驗： 對小鼠脾純化細(xì)胞的作用實驗）（）（）陰性對照組：；陽性對照組：（）（）； 組：（）（）（）；組：（）（“）（ ）實驗： 對細(xì)胞活化的影響實驗陰性對照組：陽性對照組：（）（）；組：（，）（）（ ）；實驗：對細(xì)胞分裂的影響實驗陰性對照組：

19、 ；陽性對照組：（）（）； 組：（）（）（）：培養(yǎng)前均用標(biāo)記。叟！ ！塑莖焦逢主圭里基絲睦勝氫囊塞筮壁鰓！魚壘鰱盟塵墼硅塑擅主生！鹺盟艘墅焦里制備小鼠脾細(xì)胞懸液在平皿中加入少量瞌液，處死小鼠后分離脾臟，在平皿中研磨脾臟使用目的篩網(wǎng)過濾以后轉(zhuǎn)移至管。）將 離心管中的脾細(xì)胞經(jīng)，離心分鐘。棄上清，加入 紅細(xì)胞裂解液。室溫條件下靜置分鐘。）在細(xì)胞懸液中加入 液。，離一，分鐘，棄上清重復(fù)步驟）后，棄上清，加 ，篩網(wǎng)過濾后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，然后加 將細(xì)胞終濃度調(diào)至。免疫磁珠分選小鼠細(xì)胞）分離小鼠脾細(xì)胞并計數(shù)（具體步驟同，但不必調(diào)細(xì)胞濃度）。）將制各好的小鼠脾細(xì)胞以，離分鐘后，棄上清，并吸干殘液。）以“細(xì)胞的比

20、例加入緩沖液重懸細(xì)胞。）再以社，細(xì)胞比例加入微珠（生物素標(biāo)記）后得混合液體，充分混勻后，放環(huán)境孵育分鐘。）洗滌：以 細(xì)胞的比例加入緩沖液經(jīng)，離分鐘后，棄上清，吸干殘液。）以細(xì)胞的比例加入緩沖液重懸細(xì)胞，準(zhǔn)備磁力分離。）用移液器吸取 緩沖液沖洗柱后，將準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液置于柱中，下接 試管，用以收集無標(biāo)記細(xì)胞。然后用緩沖液（每次 ）洗滌柱次。）將柱移至另無菌收集試管中，把緩沖液加至柱中，快速推壓柱上的活塞，擠出并收集細(xì)胞，后將其懸浮于 完全培養(yǎng)液中，茹調(diào)整叟！墅生焦熊查圭壁驀焦魚四避氫裹毽撼萱酸魚璺鰱盟塵照腱塑趄亡生！延鮑埡趔縫旦細(xì)胞濃度至。）然后取少許細(xì)胞懸液加入 細(xì)胞（抗生物素微珠）后放環(huán)境孵育分鐘。撿測細(xì)胞純度是。細(xì)胞培養(yǎng)將小鼠脾細(xì)胞懸液（ ），細(xì)胞（ ）加入到孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔 ，設(shè)個復(fù)孔。分別給予相應(yīng)的刺激條件，將培養(yǎng)板置于（、孵箱中培養(yǎng)天，用法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中含量。另將小鼠脾細(xì)胞懸液（ ），用標(biāo)記或不予標(biāo)記直接加入到孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔