優(yōu)化高效液相色譜法檢測(cè)雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留情況

1、優(yōu)化高效液相色譜法檢測(cè)雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留情況諾氟沙星(NO)、恩諾沙星(EN)、環(huán)丙沙星(CIP)、達(dá)氟沙星(DAN)和沙拉沙星(SA)為常見的氟喹諾酮類抗菌劑，目前在畜禽生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用 此類藥物使用不當(dāng)導(dǎo)致的藥物殘留可能直接危害人體健康，也可能使致病菌產(chǎn)生耐藥性，間接對(duì)人類健康造成影響 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均規(guī)定了氟喹諾酮類藥物的最高殘留限量 檢測(cè)動(dòng)物源食品中氟喹諾酮類藥物殘留的方法有微生物法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法、電解分析法、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)等 目前，在雞肉產(chǎn)品的檢測(cè)中，常采用的方法是動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類藥物殘

2、留檢測(cè) 高效液相色譜法(農(nóng)業(yè)部 1025 號(hào)公告 14-2008) 本試驗(yàn)以此標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)前處理方法，優(yōu)化了檢測(cè)過程 經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，該法非常適合大批量處理樣品，大量節(jié)省了處理時(shí)間和所需耗材，較大幅度降低成本，方法的靈敏度和回收率均可滿足我國(guó)現(xiàn)行獸藥殘留檢測(cè)分析的要求1 材料與方法1 1 藥品和試劑恩諾沙星對(duì)照品、環(huán)丙沙星對(duì)照品、諾氟沙星對(duì)照品、達(dá)氟沙星對(duì)照品、沙拉沙星對(duì)照品，均為中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品，磷酸二氫鉀、磷酸、三乙胺、氫氧化鈉溶液(分析純，廣州試劑廠)，乙腈(色譜純，F(xiàn)isher 公司)1 2 儀器和設(shè)備Agilent 高效液相色譜儀( 美國(guó) Agilent 公司) 配熒光檢

3、測(cè)器，高速勻質(zhì)機(jī)及振蕩器(德國(guó) IKA 公司)，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(美國(guó) Thermo 公司)1 3 試液配制分別稱取恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星對(duì)照品各10 mg，置于同一個(gè) 10 mL 容量瓶中，用 0.05 mol·L 1的氫氧化鈉溶液溶解定容至刻度，制得質(zhì)量濃度均為 1 mg·mL 1的混合儲(chǔ)備溶液 準(zhǔn)確稱取達(dá)氟沙星對(duì)照品10 mg，0. 05 mol·L 1的氫氧化鈉溶液溶解定容至 10 mL，使其質(zhì)量濃度為 1 mg·mL 1 準(zhǔn)確稱取沙拉沙星對(duì)照品10 mg，0. 05 mol·L 1的氫氧化鈉溶液溶解定容至

4、10 mL，使其質(zhì)量濃度為 1 mg·mL 1置 2 8 冰箱中保存?zhèn)溆?，有效?1 個(gè)月取上述恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星的混和儲(chǔ)備液 100 μL，達(dá)氟沙星儲(chǔ)備液 20 μL，沙拉沙星儲(chǔ)備液 200 μL，置于同一個(gè) 100 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，配置成恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的質(zhì)量濃度為 1 μg·mL 1，達(dá)氟沙星質(zhì)量濃度為0. 2 μg·mL 1，沙拉沙星質(zhì)量濃度為 2μg·mL 1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液提取液:稱取 2 g 三氯乙酸于容量瓶中，加水至100 mL，制得的三氯乙酸溶液

5、與乙腈按體積比 3 1的比例混合，攪拌均勻，得到提取液磷酸/三乙胺溶液:取磷酸 3. 4 mL，用水稀釋至1 000 mL，配成 0. 02 mol·L 1的磷酸溶液，用三乙胺調(diào) pH 至 2. 4 臨用配制(易產(chǎn)生沉淀)1 4 測(cè)定方法1 4 1 供試材料的制備 將市售的雞肉樣品用高速勻漿機(jī)絞碎得到供試試料，將空白雞肉樣品絞碎得到空白試料，在空白試料中添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為空白添加試料1 4 2 提取與凈化 稱取 1 g 試料，置于勻漿杯中，加提取液 4 mL，高速勻漿 1 min 勻漿液轉(zhuǎn)入 15 mL聚丙烯離心管中，振蕩 30 min，16 000 r/min，離心 8

6、min，取上清液過 0. 2 μm 濾膜，裝入進(jìn)樣瓶，待測(cè)1 4 3 色譜條件 色譜柱:Agilent TC-C18250 mm ×4. 6 mm(i d)，粒徑 5μm 流動(dòng)相:V(0. 02 mol ·L 1磷酸/三乙胺溶液) V (乙腈) = 80 20 流速:1mL·min 1 檢測(cè)波長(zhǎng):激發(fā)波長(zhǎng) 280 nm ;發(fā)射波長(zhǎng)450 nm 進(jìn)樣量:20 μL1 5 線性范圍與檢出限空白樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)液配制成的諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、沙拉沙星系列標(biāo)準(zhǔn)溶液 高效液相色譜儀檢測(cè)后，以峰面積為縱坐標(biāo)，藥物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)

7、，進(jìn)行線性回歸分析 在空白樣品中添加不同質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1. 4;的方法進(jìn)行處理，檢測(cè)后取信噪比 S/N = 3 對(duì)應(yīng)的樣品濃度為方法檢出限(LOD)，信噪比 S/N =10 對(duì)應(yīng)的樣品濃度為方法定量限(LOQ)1 6 回收率和精密度向空白待測(cè)樣品中分別添加 3 個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)液，按1. 4;的方法進(jìn)行處理，每個(gè)濃度重復(fù)5 次，連續(xù)做 3 個(gè)批次，計(jì)算回收率和變異系數(shù)2 結(jié)果與分析2 1 色譜分析在試驗(yàn)選定的條件下，測(cè)得諾氟沙星的保留時(shí)間為 6. 67 min，環(huán)丙沙星為 7. 19 min，達(dá)氟沙星為8. 18 min，恩諾沙星為 9. 07 min，沙拉沙星為 12. 93m

8、in，峰形尖銳，分離完全，空白組織樣品在上述保留時(shí)間無干擾峰出現(xiàn)(圖 1)2 2 方法的檢出限及標(biāo)準(zhǔn)曲線空白雞肉樣品中添加不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 ，諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的殘留定量限為 10 μg · kg 1，達(dá) 氟 沙 星 的 殘 留 定 量 限 為 2μg·kg 1，沙拉沙星的殘留定量限為 20μg·kg 1諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的線性范圍為 10 100 μg·kg 1，達(dá)氟沙星為 2 20μg·kg 1，沙拉沙星為 20 200 μg·kg 1 對(duì)質(zhì)

9、量濃度不同的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液進(jìn)行色譜分析，工作曲線的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表 1 可見，本方法靈敏度高、線性范圍較寬，有一定的實(shí)用價(jià)值2 3 方法的回收率與精密度對(duì)雞肉樣品分別進(jìn)行4 個(gè)濃度的添加試驗(yàn)，測(cè)得的回收率為84.71% 99.66%，批內(nèi)變異系數(shù)為020% 4. 42% ，批間變異系數(shù)為 0. 33% 2. 68% (表 2)2 4 抽樣檢測(cè)從市場(chǎng)上購(gòu)買 30 個(gè)雞肉樣品，每份樣品 2 個(gè)重復(fù)，按本方法進(jìn)行制樣和檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一例雞肉樣品中諾氟沙星殘留量為 43. 5 μg·kg 1，平行樣品中諾氟沙星的質(zhì)量濃度為 41. 4 μg·kg

10、 1，其余樣品均未檢出氟喹諾酮藥物的殘留 表明該方法檢測(cè)雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留量的重現(xiàn)性非常好，相對(duì)偏差保持在 3%之內(nèi)，數(shù)據(jù)可靠3 討論與結(jié)論3 1 樣品前處理方法的優(yōu)化動(dòng)物源食品中基質(zhì)干擾復(fù)雜，富含脂肪和蛋白質(zhì)，選擇并優(yōu)化樣品的前處理方法對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性尤為重要 本試驗(yàn)在農(nóng)業(yè)部 1025 號(hào)公告-14-2008 所采用方法的基礎(chǔ)上，對(duì)樣品的前處理過程進(jìn)行了一定的優(yōu)化 該標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法采用磷酸鹽緩沖液提取完后，離心取上清液，過固相萃取柱，從而除去樣品中的雜質(zhì) 本試驗(yàn)的提取液由乙腈與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% 的三氯乙酸按體積比 1 3 混合而配得，蛋白質(zhì)在酸性條件下變性，離心出沉淀除掉雜質(zhì)，而提取液中加入

11、乙腈也與流動(dòng)相中乙腈比例吻合，出峰較好比較其他相關(guān)研究，仲鋒在雞組織中檢測(cè)氟喹諾酮類藥物殘留量的回收率為 70% 107%，變異系數(shù)小于 10%;陳紅等在雞排泄物中檢測(cè)氟喹諾酮類藥物的回收率為 75% 以上，批內(nèi)變異系數(shù)在2. 2% 10% 之間，批間變異系數(shù)在 6. 2% 13. 0%之間;而本試驗(yàn)測(cè)得的回收率為 84. 71% 99. 66%，批內(nèi)變異系數(shù)為 0. 20% 4. 42%，批間變異系數(shù)為0. 33% 2. 68% 相較而言，本試驗(yàn)的回收率有了明顯穩(wěn)定的提高，精密度和準(zhǔn)確度也相應(yīng)改善了，定量限能滿足日常采集樣品的檢測(cè)范圍，而且檢測(cè)的效率大大增加，節(jié)省了柱子的成本，減少了處理的時(shí)

12、間，非常適用于樣本量較大時(shí)的殘留檢測(cè)3 2 檢測(cè)方法的穩(wěn)定性將新鮮配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液 50 μg·kg 1于 4 冰箱中避光保存 1、3、5、7 d 后上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果表明，被測(cè)藥物保留時(shí)間基本不變，但濃度明顯降低，可見標(biāo)液在保存過程中不穩(wěn)定，因此在測(cè)定過程中應(yīng)該做到現(xiàn)用現(xiàn)配，處理完后的樣品也應(yīng)及時(shí)上機(jī)3 3 結(jié)論本試驗(yàn)在農(nóng)業(yè)部 1025 號(hào)公告-14-2008 所采用方法的基礎(chǔ)上，對(duì)樣品的前處理過程進(jìn)行了優(yōu)化，使樣品處理快捷便利，靈敏度高，重現(xiàn)性好，明顯降低批量樣品的檢測(cè)成本，可有效應(yīng)用于雞肉食品品質(zhì)的日常監(jiān)控參考文獻(xiàn):1 李俊鎖，邱月明，王超 獸藥殘留分析M 上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2