PCR常見問題與對策分析

1、PCR 常見問題與對策分析【摘要】 PCR (多聚酶鏈式反應.polymerase chain reaction)是從20世紀80年代發(fā)展的體外核算擴增技術(shù)。 PCR 技術(shù)可以說是生物工程、 生物醫(yī)學領域的一項具有創(chuàng)時 代意義的程碑，它具有簡便、快速、重復性好、產(chǎn)率高、敏 感、特也等諸多突出的優(yōu)點， 本文針對一些有關 PCR 技術(shù)中 常見問題進行了分析?！娟P鍵詞】 PCR 技術(shù)；常見問題；問題分析【中圖分類號】 Q503 【文獻標識碼】 A 【文章編號】 1005-0019 ( 2014) 03-0559-02關于核算的研究已經(jīng)有一百多年的歷史了， 20 世紀 60 年代末開始， 人們便致力于

2、研究基因體外分的技術(shù)， 在 1985 年 Mullis 等人發(fā)明了聚合酶鏈反應，其原理是在試管中給 DNA 的體外合成提供了適合復制的條件， 與 DNA 的體內(nèi)復 制很相似。但 Mullis 所使用的 Klenow 酶不耐高溫， 90 攝氏 度時會變性失活。直到 1988 年， SaKi 等人從嗜熱桿菌中提 取了一種耐高溫的 DNA 聚合酶才得以解決這一問題。 在 PCR 技術(shù)被人們廣泛使用過程中，也出現(xiàn)了很多見或少見的問 題，筆者對此類問題進行了總結(jié)及歸納，并給出了相應的對1 片狀帶或涂抹帶在 PCR 擴增時偶爾會出現(xiàn)片狀帶、 涂抹帶或地毯樣帶等 現(xiàn)象。原因有可能是dNTP的濃度太高，Mg2

3、+的濃度太高， 循環(huán)次數(shù)太多或者脫貨溫度太低等引起的；也可能是模板降 解時，所使用的酶的質(zhì)量太差或是酶的使用量過多所引起 的。出現(xiàn)此類問題時一般解決方法為： 可以適當?shù)慕档?dNTP 的濃度和Mg2+濃度、減少循環(huán)次數(shù)、升高退火溫度、更換 模板或增加模板量、減少酶使用量等。2 擴增條帶PCR 擴增的關鍵環(huán)節(jié)有很多，其中包括模板 DNA 的特 性、酶的活性及質(zhì)量、引物的特異性與質(zhì)量、 PCR 擴增時的 反應條件等，不出現(xiàn)條狀帶時應該對上述環(huán)節(jié)進行針對性分 析。（1）模板的來源不同，則在反應時所使用的量也會不 同，模板的質(zhì)和量不同，則反應效果有可能不同，如當真核 基因組 DNA 作為模板時， 所使

4、用的模板量應該比原核的多。 模板的純度也會對PCR擴增有一定的影響，如含有Taq或雜 蛋白時會影響反應的效率。（2）引物的質(zhì)量、濃度、兩條引物濃度是否相同是相 影響 PCR 擴增時常見原因之一。（3）由于 Taq 酶容易被污染或失活， 也會影響反應 PCR的反應效果（4）PCR 產(chǎn)物的電泳檢測時，最好為當日檢測且一般 不要超過48h，超過48h后會出現(xiàn)帶形不規(guī)則，甚至消失等 現(xiàn)象。3 非特異性擴增帶PCR 擴增后所出現(xiàn)的條帶跟預計時的大小不同， 或同時 出現(xiàn)多個特異性擴增帶或非特異性條帶等，此類現(xiàn)象的發(fā)生 可能以下幾種可能。第一種是引物與靶序列沒有完全互補、或引物發(fā)生了聚 合形成二聚體。第二種

5、是脫貨溫度過低、 Mg2+ 的濃度過高或者是與PCR 循環(huán)次數(shù)過多等因素有關。 第三種是酶量過多或酶的質(zhì)量不合格。 對于此類現(xiàn)象的發(fā)生其對策主要包括重新設計引物，減 少酶量或調(diào)換為零一種來源的酶、適當增加模板量，降低引 物量，減少；循環(huán)次數(shù)，適當提高退火的溫度或者可以采用 二溫度點法等。4 假陽性假陽性是指樣品出現(xiàn)了目的 DNA 擴增條帶的現(xiàn)象，其 原因是存在擴增產(chǎn)物或模板的交叉污染，這種污染發(fā)生的原 因有以下兩種可能。第一種是空氣中的小片段核酸受到了污染，這些小片段 比靶序列短，但是具有一定的同源性?？苫ハ噙M行拼接，與 引物進行互補后， 可以擴增出 PCR 的產(chǎn)物， 從而導致了假陽 性的產(chǎn)生

6、。解決此類問題的對策是利用巢式 PCR 方法來消除 或減輕。第二種是大片段或整個基因組的交叉污染，導致了假陽性。當出現(xiàn)這種假陽性時有以下幾種解決方法：為了防止 目的 DNA 濺出離心管之外或吸入加樣槍內(nèi)，操作時應該盡 量小心輕柔。將所有可以高壓的器材或試劑進行高壓消 毒，所使用的進樣槍頭或離心管等均應一次性使用等。在 必要時，加入標本之前，試劑和反應管等物品要進行紫外線 照射，這樣就可以破壞存在的核酸了。5 母鏈結(jié)合當PCR反應加熱至90 C95 C左右時，會使模板 DNA 產(chǎn)生變形，解開時為單鏈。當退火冷卻至55C60 C左右時，因為引物分子量較小，運動速度較快，和母鏈碰撞的機 會會很多，所

7、以退火時引物優(yōu)先會與母鏈互相結(jié)合。引物如 果太大，會導致退火時無法激發(fā)模板，即引物無法優(yōu)先與模 板鏈互相結(jié)合，而是與較多的互補模板鏈互相結(jié)合。所以引 物不能太大，一般不可以超過 30 個脫氧核苷酸的長度。6 緩沖液PCR 緩沖液不僅對 pH 的變化有緩沖作用，而且有利于 模板退火和引物的 K 離子，以及含有能夠激活 DNA 聚合酶 的 Mg2+ 離子， 還有 DNA 聚合酶的穩(wěn)定劑等。 所以緩沖液中 通常會含有 MgCI2、Tris?HCI （ pH =8.4，室溫）、KCI、明膠 等。Mg2+離子對Taq酶的活性以及專一性都具有一定的影 響，Mg2+離子濃度過高時，Taq酶專一性降低而活性會

8、加強， 所以當Mg2+離子的濃度過高，會導致非特異性擴增產(chǎn)物積 累，而當 Mg2+ 離子的濃度過低， 會導至擴增量降低。 MgCI2 最佳濃度一般為 1.5mmoI/mL 左右。7 原料以及反應體系加入 PCR 反應體系中的 dNTP （是四種脫氧核苷磷酸的 統(tǒng)稱），即：dCTP、dTTP、dGTP、Datp，它們分別由，四種 普通的脫氧核苷酸在消耗 ATP 的基礎之上活化而形成的。 例 如如: ATP+dNDP ADP+dNTP。由此可見 dNTP 是消耗了 ATP 活化的脫氧核苷酸，已經(jīng)具備了反應時所需要的所有能量， 所以 PCR 反應體系不需要再添加 ATP 了。8 結(jié)語近幾年來， 眾多學者對 PCR 技術(shù)進行了研究與改進， 經(jīng) 過他們不斷的探索與創(chuàng)新， PCR 技術(shù)有了進一步的發(fā)展與完 善，并且已經(jīng)派生出反轉(zhuǎn)錄 PCR、原位PCR、熒光PCR、單 細胞 PCR 等各式各樣的新型的 PCR 技術(shù)， 并且這些 PCR 技 術(shù)進行相互融合，繼而為分子生物學領域的研究的深入開展 提供了高質(zhì)量的技術(shù)方面的保障，為公共衛(wèi)生事業(yè)提供了快 捷、方便、靈敏的檢測手段，為生命科學的研究及發(fā)展打開 了一扇扇嶄新的大門。參考文獻1 劉本舉 .與 PCR 技術(shù)有關的常見問題答疑 J. 生