腫瘤細(xì)胞遷移實驗講義分析（干貨分享）

1、腫瘤細(xì)胞遷移實驗講義抗腫瘤藥物5氟尿嘧啶對腫瘤細(xì)胞遷移的影響(細(xì)胞劃痕法）實驗導(dǎo)讀瘤組織的增殖失控、瘤細(xì)胞的分化異常、瘤細(xì)胞具有侵襲和轉(zhuǎn)移的能力是惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特征，而侵襲和轉(zhuǎn)移又是惡性腫瘤威脅患者健康乃至生命的主要原因.因此研究腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的規(guī)律及其發(fā)生機制,對惡性腫瘤的防治有重要意義。.文檔交流 僅供參考.腫瘤轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位侵入淋巴管、血管或體腔，至靶組織或靶器官，長出與原發(fā)瘤不相連續(xù)而組織學(xué)類型相同的腫瘤。前者稱為原發(fā)瘤，后者稱為轉(zhuǎn)移瘤或繼發(fā)瘤。.文檔交流 僅供參考.圖1腫瘤轉(zhuǎn)移示意圖 根據(jù)腫瘤異質(zhì)性理論，大多數(shù)惡性腫瘤最初雖屬單克隆起源,但它在不斷增殖演進(jìn)至臨

2、床明顯的腫瘤時,由于瘤細(xì)胞遺傳性狀的不穩(wěn)定性(來自基因突變或缺失等）而不斷地變異,造成該腫瘤內(nèi)瘤細(xì)胞亞群表型的多樣性，諸如瘤細(xì)胞的侵襲性、生長速率、轉(zhuǎn)移能力，核型乃至對激素的反應(yīng)性和抗腫瘤藥物的敏感性等,這些瘤細(xì)胞亞群具有被此不同的特性即所謂異質(zhì)性。異質(zhì)性與腫瘤轉(zhuǎn)移直接有關(guān)的就是癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能,癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能有高低之分,具有高轉(zhuǎn)移潛能的筋細(xì)胞易發(fā)生轉(zhuǎn)移。.文檔交流 僅供參考.腫瘤細(xì)胞的運動性，來源于細(xì)胞運動“接觸抑制”的概念.通過體外培養(yǎng)正常和惡性結(jié)締組織細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)正常纖維母細(xì)胞在移動過程中引起的皺棲腦膜與其他細(xì)胞的表面接觸時，往往產(chǎn)生細(xì)胞膜活動的抑制和移動中細(xì)胞的縮短,然后停止。當(dāng)纖維母

3、細(xì)胞生長過程中在培養(yǎng)皿上融合形成一單層時,細(xì)胞運動即顯著受到抑制。間變的肉瘤細(xì)胞則缺乏接觸抑制，瘤細(xì)胞的運動不會被正常纖維母細(xì)胞所抑制。.文檔交流 僅供參考.針對腫瘤轉(zhuǎn)移這一復(fù)雜的過程，人們研制了各種抗轉(zhuǎn)移藥物，如血小板凝集抑制劑、血管生成抑制因子、內(nèi)皮穩(wěn)定因子、干擾素以及其他化學(xué)藥物。.文檔交流 僅供參考.細(xì)胞劃痕法是測定了腫瘤細(xì)胞的運動特性的方法之一。其借鑒體外細(xì)胞致傷愈合實驗?zāi)Ｐ?，在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上，劃痕致傷,然后加入藥物觀察其抑制腫瘤細(xì)胞遷移的能力.下圖即為劃痕實驗的示意圖，圖中可見,在細(xì)胞層上出現(xiàn)一道空痕(A），當(dāng)加入藥物后，由于藥物的作用使細(xì)胞遷移受到抑制（B）,而未加入藥物的

4、細(xì)胞保持了原有的遷移能力，在一段時間后通過遷移將劃痕掩蓋（C)。.文檔交流 僅供參考.A C圖實驗結(jié)果（A表示在單層細(xì)胞上劃出的一道痕；B表示加入抑制劑,為陽性對照組;C表示未加入抑制劑，為陰性對照組）.文檔交流 僅供參考.一、實驗?zāi)康?了解腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的基本原理2了解測定細(xì)胞運動特性的方法細(xì)胞劃痕法二、實驗原理腫瘤細(xì)胞在體外仍具有遷移的能力，本實驗借鑒體外細(xì)胞致傷愈合實驗?zāi)Ｐ?利用細(xì)胞劃痕法測定了腫瘤細(xì)胞的運動特性.文檔交流 僅供參考.三、儀器和試劑1） 細(xì)胞系及其培養(yǎng):肝腫瘤細(xì)胞Hep2） 2孔板，移液器,倒置顯微鏡，3） 主要試劑:BS,DMEM培養(yǎng)液,025胰酶，胎牛血清，氟尿嘧啶溶液

5、(ug/ml)四、實驗步驟 5氟尿嘧啶溶液的配制 精密稱取10g用滅菌蒸餾水溶解，定容于100l容量瓶,精密移取溶液，稀釋至10ml，即得1ug/ml 5-氟尿嘧啶溶液。.文檔交流 僅供參考.。制備單層細(xì)胞將細(xì)胞密度為0105個/mL的HepG2細(xì)胞鋪于孔板(每孔500uL）上,加入含0胎牛血清的MPI140 培養(yǎng)液，培養(yǎng)162 h，使形成單層細(xì)胞。.文檔交流 僅供參考.劃痕以五氟尿嘧啶（5-u）為例，首先配制 g/L的母液，取5L該母液用S稀釋至1。1 mL，得到濃度為40 g/L的5F溶液。.文檔交流 僅供參考.用10uL移液槍槍頭(或者無菌牙簽)在單層細(xì)胞上呈“一字劃痕，用PBS清洗3次

6、,然后加入上面配好的5Fu溶液，平行兩個樣本，孵育24 h后換成含10胎牛血清的RMPI.1 培養(yǎng)液,孵育24 h。.文檔交流 僅供參考.觀察并拍照吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗次后，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。五、注意事項：1 實驗時應(yīng)注意細(xì)胞生長狀況，選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。對不同的細(xì)胞要觀察細(xì)胞的貼壁率等,確定實驗時細(xì)胞的接種數(shù)量和培養(yǎng)時間，保證培養(yǎng)終止時密度適當(dāng)。.文檔交流 僅供參考.2 在用B緩沖液沖洗時，注意貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細(xì)胞，影響實驗拍照結(jié)果。3 在藥物的篩選過程中，其對細(xì)胞遷移能力的影響也是重要的一方面。實驗設(shè)計過程中需要選擇適當(dāng)?shù)年栃詫φ战M和陰性對照組。.文檔交流

7、 僅供參考.六、思考題1。 如何用實驗驗證化學(xué)物質(zhì)能恢復(fù)或者增強細(xì)胞的遷移能力?2。 如何避免化學(xué)物質(zhì)濃度過高造成的細(xì)胞毒性對實驗的影響?七、參考文獻(xiàn)：1.司徒鎮(zhèn)強，吳軍正;細(xì)胞培養(yǎng);興界圖書出版公司；2004年3月第1版ary Birch， tephn itcell， andan R。 rt.Isolaiond harateiaton o man Melanoma Cell VariantsExpessing Hghand Low Lev of CD4. CANE RESRC 11；51:66067.文檔交流 僅供參考.3。何賢峰,楊述華等.唑來膦酸對骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 腫瘤防治研究 200;35（2