SDSPAGE蛋白電泳手冊

1、蛋白電泳手冊SDS-PAGE及 Westernblot蛋白電泳蛋白質(zhì)的電泳分離是重要的生物化學(xué)分離純化技術(shù)之一 , 電泳是指帶電粒子在電場作用下 向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象 . 根據(jù)所采用的支持物不同 , 有瓊脂糖凝膠電泳 , 淀粉 凝膠電泳 ,聚丙烯酰胺凝膠電泳等。其中 , 聚丙烯酰胺凝膠電泳 （PAGE）由于無電滲作用 ,樣 品用量少 （1-100 g） ，分辨率高，凝膠機械強度大 , 重復(fù)性好以及可以通過調(diào)節(jié)單體濃度 或單體與交聯(lián)劑的比例而得到孔徑不同的凝膠等優(yōu)點而受到廣泛的應(yīng)用。PAGE原理聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺 （簡稱Acr）和交聯(lián)劑 N，N亞甲基雙丙烯酰胺（簡稱 Bis）

2、 在催化劑作用下，聚合交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物進行電泳。 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）可根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所 產(chǎn)生的不同遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶。SDS-PAGE原理SDS是一種陰離子表面活性劑，能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì) 分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白 分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì) -SDS復(fù)合物在電泳時的遷移率，不再受原有電 荷和分子形狀的影響，而只是棒長的函數(shù)。這種電泳方法稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱 SDSPAGE）。實驗使用過程中，

3、還加入 DTT或者 * ，以打開蛋白間的二硫鍵，破 壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。 SDS PAGE最常采用垂直板不連續(xù)系統(tǒng)（分離膠與濃縮膠）。索引 蛋白電泳（ SDS-PAG）E 電泳試劑總表 制膠 上樣及電泳 染色蛋白提取蛋白定量Bradford 蛋白濃度測定試劑盒使用說明BCA蛋白濃度測定試劑盒使用說明Lowry 蛋白濃度測定試劑盒使用說明 蛋白分子量標準（圖） 考馬斯蛋白膠快速染色液WesternblotWesternblottingDAB 檢測試劑盒WesternblottingECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒Westernblotting 試劑盒使用說明 蛋白電泳試劑（部分試劑可以相互替換） 系號

4、貨號名稱1T8060TRIS三羥甲基氨基甲烷2G8200Glycine 甘氨酸3S8010SDS十二烷基硫酸鈉4A8080Acrylamide 丙烯酰胺5甲叉雙丙烯酰胺M8200N,N-MethyleneBisacrylamide6A8090AmmoniumPersulfate 過硫酸胺7D8220DTT二硫蘇糖醇8M8210 -Mercaptoethanol -*9T8090TEMED四甲基 *10A101030%丙烯酰胺（ 29:1 ）11S10514XSDS-PAG分E 離膠緩沖液（ PH=8.8）12S10524XSDS-PAG濃E 縮膠緩沖液（ PH=6.8）13P10164蛋白上樣

5、緩沖液 （ 含 -*）14P10154蛋白上樣緩沖液 （含 DTT） 15D10701MDTT16A103010%過硫酸氨17T10201MTris-HCL(PH6.8)18T10101.5MTris-HCL(PH8.8)19S101010%SDS20T10705Tris- 甘氨酸電泳緩沖液SDS-PAGE如今已形成成熟的方案，實驗室可根據(jù)自己的情況和習(xí)慣來選擇試劑。如選擇1、2、3、4、5、6、7、8、9 全部試劑可自己配制。也可以選擇配制好的試劑。如 10、11、 12、13/14 、16、9、20。還可選擇 10、13/14 、16、9、17、18、19、20。一，制膠凝膠配制表（一）分

6、離膠 12%分離膠 10%分離膠 8%濃縮膠（ 3%）總體積10ml10ml10ml5ml4X 分離膠緩沖液（ PH8.8） 2.5ml2.5ml2.5ml04X 濃縮膠緩沖液( PH6.8)0001.2530%丙烯酰胺 (29:1)4ml3.32.70.5ddH2O3.4ml4.1ml4.7ml3.2ml10%過硫酸銨100ul100ul100ul75ulTEMED10ul10ul10ul7.5ul 凝膠配制表（二） 分離膠 12% 分離膠 10%分離膠 8%濃縮膠（ 3%）總體積10ml10ml10ml5ml30%丙烯酰胺 (29:1)4ml3.3ml2.7ml0.5ml1MTris-HC

7、L(PH6.8)0000.625ml1.5MTris-HCL(PH8.8) 2.5ml2.5ml2.5ml010%SDS100ul100ul100ul50ulddH2O3.3ml4.0ml4.6ml3.75ml 10%過硫酸銨100ul100ul100ul75ulTEMED10ul10ul10ul7.5ul常規(guī) SDS-PAGR凝E膠可按上表一或者表二配制。 TEMED和 10%過硫酸銨最后加，在加入前需 混勻前面所加試劑。 10%過硫酸銨在 4有效期為一周， TEMED易揮發(fā)，使用后請蓋緊瓶蓋。 在常溫下膠 30 分鐘內(nèi)可以凝固，如溫度過低，可放 37溫箱凝固。灌完分離膠后，輕輕 的加 1m

8、lddH2O封上層，膠凝固后可見到分界線。灌濃縮膠時，先傾去水層，再用吸紙吸 干。灌濃縮膠后立刻插入梳子。濃縮膠凝固后，放入電泳液中（讓電泳液漫過加樣孔 ） ，輕輕的撥出梳子，可防加樣孔變形。配制量可按上表等比加減。如果所用膠濃度與上面不同，可自行調(diào)整，主要是加減30%丙烯酰胺的量（需要濃度總體積 /30%），最后用水補足總體積。二，上樣及電泳取 3 體積蛋白樣品加入 1 體積 4蛋白上樣緩沖液，混勻，沸水浴 5 分鐘。冷卻后離心取 上清上樣，一般還在樣品的相臨孔加上蛋白 Marker。上樣前將 5Tris- 甘氨酸電泳緩沖 液稀釋成 1（100ml 加入 400ml雙蒸水混勻 ） 。一般在濃

9、縮膠時電壓 80V，分離膠時電壓 120V。在目標蛋白跑到合適的地方，停止電泳。取下膠染色或者再進行下一步實驗。 注意事項1.SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例 （即： 1.4gSDS/g 蛋白質(zhì)），蛋白質(zhì)含量不可以超標， 否則 SDS結(jié)合量不足。2. 用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子量時，必須同時作標準曲線。不能利 用這次的標準曲線作為下次用。并且 SDS-PAGE測定分子量有 10誤差，不可完全信任。3. 有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（ - 胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在 * 和 SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)， SDS-聚丙烯酰

10、 胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量。4. 有的蛋白質(zhì)（如：電荷異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)）不能采用該 法測相對分子量。5. 如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象，可能是SDS不純引起。三，染色蛋白電泳完后，取出電泳玻璃板，小心撬開玻板 （一般膠會附在長玻板，即凹玻板一面） 用刀片小心切開分離膠與濃縮膠的交界處。丟棄濃縮膠，再用刀在膠左右兩邊與玻板凸起 交界處各畫一刀，放入電泳液中，一般膠會自然滑入溶液中。可進行下一步染色。我公司 所產(chǎn)蛋白快速染色液，可在半小時內(nèi)染出結(jié)果，詳情請見附四（ P1300）附一，蛋白提取 貨號名稱說明R0010高效

11、RIPA組織/ 細胞裂解液產(chǎn)品簡介：在普通 RIPA的基礎(chǔ)上改進而來 ,含蛋白酶抑制劑及 * 酸酶抑制劑 (配有一支PMSF).R0020RIPA組織/ 細胞裂解液RIPA經(jīng)典配方，適于絕大多數(shù)蛋白 - 蛋白相互作用的免疫實驗。組成：50mMTris-HCl(pH7.4),150mMNaCl,1%NP-40,0.1%SDS.(配有一支 PMSF保) 存： 4oC避光R0030非變性組織 / 細胞裂解液非變性條件下裂解的蛋白產(chǎn)物最大限度地保留了蛋白的特性和功能，如抗原- 抗體結(jié)合或 酶學(xué)活性，因此適宜于進行免疫共沉淀本系列試劑隨同配送一支 PMSF，請收到后 -20 保存。 RIPA裂解液 4保

12、存，如發(fā)現(xiàn)有少量沉淀，可常溫放置半小時，沉淀可消失，不影響使用。操作步驟：根據(jù)使用量，取每 1mlRIPA加入 10ulPMSF。使 PMSF的最終濃度為 1mM?；靹騻溆茫?PMSF 現(xiàn)用現(xiàn)加）。1，樣品前處理：a） 對于細胞：貼壁細胞用 PBS洗一遍，懸浮細胞直接離心收集，按照 6孔板每孔細胞量加 入 150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。b）對于組織樣品：把組織剪切成細小的碎片。按照每 20毫克組織加入 150-250 微升裂解液 的比例加入裂解液。 （ 如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋 白樣品，可以適當減少裂解液的用

13、量 ） 。用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。2，后處理：將裂解后的樣品 10000-14000g離心 3-5 分鐘（對應(yīng)小離心機為 16000轉(zhuǎn)），取上清，即可 進行后續(xù)的 PAGE、Western 和免疫沉淀等操作。注：本系列蛋白提取試劑所提取的蛋白由于含有去污劑，所以不適合于 Bradford 蛋白濃 度測定試劑盒，請選擇 BCA法或者 Lowry 法。附二，蛋白定量蛋白含量測定是以標準蛋白作為對照，根據(jù)蛋白濃度不同，吸光值不同而達到定量的目的。有些方法是理解蛋白本身的吸光值（紫外光譜吸收法）來定量，但更多的是用染料對蛋白 進行染色，利用染料與蛋白結(jié)合顯出與原染料及蛋白不同的吸光值來定量的。

14、后一種方法 應(yīng)用更普遍。蛋白定量方法的選擇，應(yīng)該考慮到蛋白結(jié)構(gòu)(標準品選擇)、蛋白溶液內(nèi)干擾物等因素的 影響。貨號名稱組成說明PC0010Bradford 蛋白濃度測定試劑盒5G250染色液100ml2-8干擾物質(zhì)少， Tris 、糖、甘油、 * 、氨、 EDTA等均不干擾測定。BSA(5mg/ml)1ml-20oCPBS稀釋液 30ml2-8PC0020BCA蛋白濃度測定試劑盒BCAReagent100ml2-8BCA法的顯著優(yōu)點是不受去垢劑的影響CuReagent3.0ml2-8BSA(5mg/ml)1ml-20oCPBS稀釋液30ml 2-8PC0030Lowry 法蛋白濃度測定試劑盒F

15、olin 酚甲試劑 A200ml2-8Lowry 法測定較為不受脂類物質(zhì)干擾，適于脂類含量較高的樣品測定。也能耐受相當濃度 的去垢劑如 SDS。Folin 酚甲試劑 B5ml2-8Folin 酚乙試劑20ml2-8BSA(5mg/ml)1ml-20oCPBS稀釋液30ml2-8附三，蛋白分子量標準（圖）附四，考馬斯蛋白膠快速染色液 （P1300）考馬斯亮藍蛋白膠快速染色液是一種即用型快速靈敏而且安全的染液，用于SDSPAGE或者非變性膠的快速染色，在半小時內(nèi)就可以出結(jié)果。靈敏度達10ng。使用方法：1. 將電泳后的 PAGE膠（以 8cm10cm大小為例）取下放入容器中，加入 50ml 雙蒸水

16、或去 離子水，加熱至沸騰后停止，（可選：繼續(xù)在脫色搖床上搖動 5 分鐘），棄去水溶液。2. 加入 20ml至 25ml 快速染色液（按盛膠容器的大小而定，以浸沒膠面為準），加熱至沸 騰后保持沸騰狀態(tài) 30-60 秒，停止加熱后繼續(xù)在脫色搖床上搖動 5-10 分鐘，棄去染色液 （此時蛋白條帶應(yīng)已可見）。3. 加入約 50ml水，加熱至沸騰后保持沸騰狀態(tài) 30-60 秒，停止加熱后繼續(xù)在脫色搖床上搖 動 5-10 分鐘，換水即可完成脫色，觀察結(jié)果。注意事項：1 染色前的清洗步驟 （第一步）中，水的質(zhì)量非常重要，質(zhì)量越好靈敏度越高，研究證明， 若用自來水加熱清洗，染色效果與靈敏度僅與常規(guī)甲醇考馬斯亮

17、藍染色 （分子克隆第二版） 相同。2 脫色時可用自來水清洗。3 若要得到無背景的染色膠，可重復(fù)脫色步驟或?qū)⒛z放在水中過夜。4 經(jīng)本產(chǎn)品染色的 PAGE膠，膠的縮漲度小于 5%，染色后的膠可在水中放置數(shù)月而無明顯脫 色。5 每次加熱后，繼續(xù)在脫色搖床上搖動 5 分鐘，可增強染色效果。6 本染色液有輕微腐蝕性，請帶手套操作。Westernblot經(jīng)過 PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體 （例如* 纖維素薄膜 ）上，固相載體以非共 價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上 的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標記的第二抗體起 反應(yīng)

18、，經(jīng)過底物顯色或 * 自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分，此 技術(shù)稱為免疫印跡（ Westernblot ）。Westernblotting 檢測系統(tǒng)除需要過氧化物酶標記的各種二抗外，還需要配套的顯色試劑。 索萊寶提供 DAB顯色和 ECL化學(xué)發(fā)光兩種試劑及相應(yīng)試劑盒。WesternblottingDAB 檢測試劑盒本試劑盒適合加一抗后的后續(xù)顯色。操作簡單，適合重組等高表達蛋白的檢測，其敏感性 不如 ECL法。編號名稱說明SW1010Westernblotting（ 小鼠 IgG）DAB顯色試劑盒可配制 250ml二抗和 100ml 顯色液，適合一抗為小鼠 IgGSW1020W

19、esternblotting（ 兔 IgG）DAB顯色試劑盒可配制 250ml二抗和 100ml 顯色液，適合一抗為兔 IgG。SW1030Westernblotting（ 山羊 IgG）DAB顯色試劑盒可配制 250ml二抗和 100ml 顯色液，適合一抗為山羊 IgGSW1040Westernblotting（ 小鼠 / 兔 IgG）DAB顯色試劑盒可配制 250ml二抗和 100ml 顯色液，適合一抗為小鼠和兔 IgG試劑盒內(nèi)容：1. 封閉試劑： 30g（可配制 400ml） 脫脂奶粉及其他蛋白，緩沖鹽等混合物。2.10 倍濃縮抗體稀釋液， 50ml。3.HRP標記二抗， 0.5ml ，

20、效價 1：500-3000。4.20 倍 DAB濃縮顯色液， 5mlA+5mlB。WesternblottingECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒本試劑盒適合加一抗后的后續(xù)顯色。敏感性比 DAB高 10倍。適合組織及細胞中常規(guī)蛋白的 檢測，但需有暗室等相關(guān)配套條件。編號名稱說明SW2010Westernblotting（ 小鼠 IgG）ECL 顯色試劑盒可配制 250ml二抗和 50ml 顯色液，適合一抗為小鼠 IgG。SW2020Westernblotting（ 兔 IgG）ECL 顯色試劑盒 可配制 250ml二抗和 50ml 顯色液，適合一抗為兔 IgG。SW2030Westernblottin

21、g（ 山羊 IgG）ECL 顯色試劑盒可配制 250ml二抗和 50ml 顯色液，適合一抗為山羊 IgG。SW2040Westernblotting（ 小鼠 / 兔 IgG）ECL 顯色試劑盒可配制 250ml二抗和 50ml 顯色液，適合一抗為小鼠和兔 IgG。試劑盒內(nèi)容：1. 封閉試劑： 30g（可配制 400ml） 脫脂奶粉及其他蛋白，緩沖鹽等混合物。2.10 倍濃縮抗體稀釋液， 50ml。3.HRP標記二抗， 0.1ml ，效價 1：2000-5000。4. ECL顯色液， 25mlA+25mlB。操作步聚 常規(guī)電泳轉(zhuǎn)膜后，1. 清洗轉(zhuǎn)印膜：將膜剝離下后，作好標記，一般在左上角剪一缺口

22、。室溫用TBS-T漂洗 3次每次 5min, 以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的 SDS，防止影響后面的抗體結(jié)合。2. 按5g封閉試劑加 100ml雙蒸水計，配制膜封閉液，配好的膜封閉液為乳白色懸液，將漂 洗過的轉(zhuǎn)印膜，封閉液內(nèi)，搖床震動，室溫封閉 30min。用 TBS-T，PH7.6 洗液，室溫漂洗 3 次每次 5min。3. 將 10抗體稀釋液用雙蒸水稀釋成 1（10ml10抗體稀釋液加入 90ml 雙蒸水，混勻， 可 4 保存三個月）。此稀釋液可作為一抗和二抗的稀釋液。4. 用 1的抗體稀釋液稀釋抗體。根據(jù)用量以及一抗的推薦稀釋濃度來稀釋一抗。將雜交 膜放入雜交袋中，加入一抗工作液，封口， 4孵育過

23、夜或 37搖動孵育 2h。此用過的抗 體一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步將膜沿電泳方向剪成 條，分別作好標記，分開孵育。5. 用 TBS-T，PH7.6洗液，室溫漂洗 3 次每次 5min。6. 用稀釋好的抗體稀釋液稀釋二抗。根據(jù)用量， DAB法按 10ml 抗體稀釋液加入 20ulHRP標 記二抗（ 1：500）的比例； ECL法按 10ml抗體稀釋液加入 5ulHRP標記二抗（ 1：2000）的 比例，配制二抗工作液，混勻。將雜交膜放入雜交袋中，加入二抗工作液，封口，37搖動孵育 1h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。7. 用 TBS-T，PH7.6洗液，室溫漂洗 3 次每次 10min。8. 顯色：a）DAB顯色：配制 DAB顯色，根據(jù)用量，取 TBS-T4ml，加入 DAB顯色液 A、DAB顯色液 B 各 200ul ，混勻，加在膜正面，室溫下顯色。在目標條帶顯出后，而且背景未出時，放入水 中終止顯色。b）ECL 化學(xué)發(fā)光法檢測：配制 EC