蛋白質純化與結晶的原理演示教學

1、精品文檔蛋白質純化與結晶的原理獲得蛋白質的晶體結構的第一個瓶頸，就是制備大量純化的蛋白質（10 mg），其濃度通常在10mg/ml以上，并以此為基礎進行結晶條件的篩選。運用重組基因的技術，將特定基因以選殖（clone）的方式嵌入表現(xiàn)載體（expression vector）內(nèi)，此一載體通常具有易于調控的特性。之后再將帶有特 定基因的載體送入可快速生長的菌體中，如大腸桿菌（Escherichia coli），在菌體快速生長的同時，也大量生產(chǎn)表現(xiàn)載體上的基因所解譯岀之蛋白質。一般而言純度越高的蛋白質比較有機會形成晶體，因此純化蛋白質的步驟就成為一個重要的決定因素。在取得高純度的蛋白質溶液后，接下來

2、就是晶體的培養(yǎng)。蛋白質晶體與其他化合物晶體的形成類似，是在飽和溶液中慢慢產(chǎn)生的，每一種蛋白質養(yǎng)晶的條件皆有所差異，影響晶體形成的變量很多，包含化學上的變量，如酸堿度、沈淀劑種類、離子濃度、蛋白質濃度等；物理上的變數(shù)，如 溶液達成過飽和狀態(tài)的速率、溫度等；及生化上的變數(shù)，如蛋白質所需的金屬離子或抑制劑、蛋白質的聚合狀態(tài)、等電點等，皆是養(yǎng)晶時的測試條件。截至目前為止，并無一套理論可以預測結晶的條件，所以必須不斷測試各種養(yǎng)晶溶液的組合后，才可能得到一顆完美的單一晶體（圖一）。蛋白質晶體的培養(yǎng)， 通常是利用氣相擴散法 （Vapor Diffusion Method） 的原理來達成；也就是將含 有高濃度

3、的蛋白質（10-50 mg/ml）溶液加入適當?shù)娜軇档偷鞍踪|的溶解度，使其接近自發(fā)性的沈淀狀態(tài)時， 蛋白質分子將在整齊的堆棧下形成晶體。舉例來說，我們將蛋白質溶于低濃度（1.0 M）的硫酸銨溶液中，將它放置于一密閉含有高濃度（2.0 M）硫酸銨溶液的容器中，由氣相平衡，可以緩慢提高蛋白質溶液中硫酸銨的濃度，進而達成結晶的目的（圖二）。蛋白質晶體在外觀上與其他晶體并無明顯不同之處，但在晶體的內(nèi)部， 卻有很大的差異。 一般而言，蛋白質晶體除了蛋白質分子外，其他的空間則充滿約40 %至60 %之間的水溶液，其液態(tài)的成分不僅使晶體易碎，也容易使蛋白質分子在晶格排列上有不規(guī)則的情形岀現(xiàn)，造成晶體

4、處理時的困難及繞射數(shù)據(jù)上的搜集不易等缺點。但也由于高含水量的特性，讓蛋白質分子在晶體內(nèi)與水溶液中的狀態(tài)，極為相似。所以由晶體所解岀的蛋白質結構，基本上可視為自然狀態(tài)下的結構。?蛋白質結構解析的方法簡介到目前為止，蛋白質結構解析的方法主要是兩種，x射線衍射和NMR。近年來還岀現(xiàn)了一種新的方法，叫做 Electron Microscopy。其中X射線的方法產(chǎn)生的更早，也更加的成熟，解析的數(shù) 量也更多，我們知道，第一個解析的蛋白的結構，就是用x晶體衍射的方法解析的。而NMR方法則是在90年代才成熟并發(fā)展起來的。這兩種方法各有優(yōu)點和缺點。首先來說一下，這兩種方法的一般的步驟和各自的優(yōu)點和缺點。電子顯微

5、鏡（electron microscopy）作為一種新型的技術，目前的應用還是非常少，并且比較狹窄，我可能等到最后在給它作些精品文檔 介紹，而且相信絕大多數(shù)人也沒有聽說過，也不會有很大的興趣。首先是X晶體衍射。首先要得到蛋白質的晶體。通常，都是將表達蛋白的基因PCR之后克隆到一種表達載體中，然后在大腸桿菌中誘導表達，提純之后摸索結晶條件，等拿到晶體之后，工作便完成的80%，將晶體進行 x射線衍射，收集衍射圖譜，通過一系列的計算，很快就能得到蛋白質的原子結構。用x射線的優(yōu)點是：速度快，通常只要拿到晶體，甚至當天就能得到結構，另外不受大小限制，無論是多大的蛋白，或者復合體，無論是蛋白質還是RNA、

6、DNA，還是結合了什么小分子，只要能夠結晶就能夠得到其原子結構。所以x射線方法解析蛋白的瓶頸是摸索蛋白結晶的條件。這個時候運氣就顯的特別重要。關于這個有好多有趣的離子。據(jù)說國外一個同學在摸索兩個月無果之后，毅然去度假，就將蛋白扔在一個很隨便的地方，等度假回來之后，去卩發(fā)現(xiàn)已經(jīng)結晶了。然后，來說一下 NMR。NMR （nuclear magnetic resonance）現(xiàn)象早已發(fā)現(xiàn)了很久，然后將這種方法用來解析蛋白結構，卻是近一二十年的事情。不過到今天為止，用nmr方法來解析結構已經(jīng)十非常成熟的方法。原理暫且放在一邊，先說常規(guī)步驟。首先通過基因工程的方法，表達出目的蛋白，提純之后，摸索一下蛋白

7、穩(wěn)定的條件， 如果蛋白沒有聚合，而且折疊良好，便將蛋白樣品（通常是1mM 3mM，500ul，Ph6 7的PBS）裝入核磁管中，放入核磁譜儀中，然后用一系列寫好的程序控制譜儀，發(fā)出一系列的電磁波， 激發(fā)蛋白中的H、N13、C13原子，等電磁波發(fā)射完畢，在收集受激發(fā)的原子所放岀的能量”其實也是小磁場，通過收集數(shù)據(jù)、譜圖處理、電腦計算從而得到蛋白的原子結構。它的優(yōu)點就是，蛋白在液體中得到結構，是一個動態(tài)的結構，事實上所有在pdb中或者文獻中發(fā) 表的NMR結構都是十個或者二十個結構的ensemble （集合），這就是因為這些結構都是進行能量優(yōu)化后符合條件的結構，或者說就是溶液中的蛋白結構。因為是動態(tài)

8、就很容易的研究蛋白與其他蛋白或者配基的相互作用。缺點是，受大小的限制，到目前為止NMR解析蛋白結構的上限是50kd。無論是晶體還是 NMR，蛋白都要符合下面的條件：首先表達量要大，象NMR要求1個mM500UL，這就要求十幾個毫克，結晶要摸索很多的條件也需要大量的蛋白。所以蛋白一定要在胞質精品文檔 中表達才行。其次，蛋白要折疊。我們知道許多蛋白，尤其是真核蛋白在大腸桿菌中是以包含體的形式存在，這種情況下是不行的，除非復性。如果你的蛋白在胞質中表達，如果你不確定是不是表達，可以從分子篩上的位置，或者掃CD確定一下，當然最簡單的是做一個 NMR 維譜，只需要幾分鐘。小于20Kd的蛋白可以考慮 NMR，因為NMR研究功能核相互作用方面是更加擅長的，而且不需要結晶，現(xiàn)在速度也不慢。如果比較大，可以考慮晶體解析。對于用NMR來解析結構，最重要的條件就是非常昂貴的核磁譜儀，以及同位素標記蛋白。只要采集了譜之后就算的得