KRAS基因在胰腺疾病中突變的檢測(cè)及其臨床意義

1、【摘要】目的：探討KRAS基因突變?cè)谝认偌膊≈械呐R床意 義和在胰腺癌診斷中的價(jià)值。 方法：合酶鏈反應(yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 （PCR-SSCP） 方法 分別檢測(cè)胰腺癌、癌旁組織、手術(shù)切緣正常組織、慢性胰腺炎 石蠟包埋組織的KRAS突變并進(jìn)行DNA測(cè)序確認(rèn)。結(jié)果胰腺癌K RAS 12密碼子突變率 （792%）顯著高于慢性胰腺炎 （33 3 % ， P0 . 01），且在切緣正常組織一癌周導(dǎo)管增生一癌周不典型增 生一胰腺癌過(guò)程中，突變率有逐漸上升的趨勢(shì)。突變方式以 12 密碼子 GGT-GAT 、GTT、CGT 為主，同一例患者突變方式一致。 KRAS 基 結(jié)論：KRAS基因突變?cè)谝认侔┌l(fā)生中起作用

2、，但 因突變作為胰腺癌診斷的分子標(biāo)志缺乏特異性。 【關(guān)鍵詞】胰腺癌；慢性胰腺炎；KRAS基因；突變 胰腺癌臨床確診時(shí)大多已屬晚期，其 5年生存率僅為 1 5。提高其早期發(fā)現(xiàn)率可使更多患者獲得手術(shù)切除的機(jī)會(huì)而 提高其生存率。眾多研究表明，KRAS基因與胰腺癌高度相關(guān)， 其第一外顯子 12密碼子的點(diǎn)突變?cè)谝认賹?dǎo)管腺癌組織中高達(dá) 70%100 %，且是胰腺腫瘤發(fā)生的早期事件，可用于早期診 斷胰腺癌。而近來(lái)研究卻表明，KRAS突變亦可見(jiàn)于良性胰腺疾 病及正常胰腺，對(duì)它可作為胰腺癌早期診斷的分子標(biāo)志提出了 疑問(wèn)。本研究旨在探討KRAS突變?cè)谝认偌膊≈械呐R床意義和在 胰腺癌診斷中的價(jià)值。 材料和方法 1對(duì)

3、象選擇：收集上海長(zhǎng)海醫(yī)院1996年1月至2000 年2月 。包括：胰 良惡性胰腺疾病術(shù)后石蠟包埋組織標(biāo)本，診斷由手術(shù)及病理證 實(shí)，所有病例均有完整的手術(shù)記錄資料及臨床資料 腺導(dǎo)管腺癌患者的胰腺導(dǎo)管腺癌 24 例、癌旁胰腺導(dǎo)管增生 58例、 癌旁胰腺導(dǎo)管不典型增生 19例和手術(shù)切緣正常胰腺 16 例；惡性 胰腺黏液性囊腺瘤 1 例；慢性胰腺炎 24 例，選擇胰腺導(dǎo)管增生 組織蠟塊，慢性胰腺炎患者經(jīng)15年隨訪全部健在，且無(wú)一例 發(fā)展為胰腺癌。 7例正常胰腺組織為非胰腺疾病患者尸檢標(biāo)本。 胰腺癌細(xì)胞株 Patu 一8988 由德國(guó) Marbury 市 Philips 大學(xué)分子生物學(xué)和分子病理學(xué)研究所

4、 Elsasserlt 士 惠贈(zèng)。 2 .標(biāo)本處理：每份標(biāo)本一部分切成5 m薄片，HE染色光 鏡下組織鑒定，另取 10 m 薄片 3 5片（表面積約 10 cm2） 放 入1 5 ml 消毒塑料離心管中， 經(jīng)二甲苯脫蠟， 乙醇漂洗， 離心 后干燥沉淀物。 3 DNA 的提?。翰捎弥x心式小量組織基因組DNA 抽提 試劑盒 （上海華舜生物工程公司 ），按說(shuō)明書(shū)操作。經(jīng)純度鑒定 后一 20 C備用。 4 半巢式聚合酶鏈反應(yīng) （PCR） ：引物合成：由上海生工生 物工程公司合成，其序列為 R1=5 ACT GAATATA A ACTTGTGGTAGTTGGACCT 3 ： R2 ：R3=5 =5 T

5、CAAAGAATGGTCCTGGACC 3 TAATATGTCGACTA A A ACAAGATTTACCTC 3 配對(duì)方式為 R1 R2, R1. R3。半巢式PCR需經(jīng)2次PCR , 1次酶切。DNA擴(kuò)增儀為Perkin-Elmer 9600 型，PCR試劑盒購(gòu) 于Promega 公司的PCR Core系統(tǒng)。PCR反應(yīng)總體積50 l，含4 種dNTP，濃度各 0.2 mmol /L, MgC12 1.5 mmol /L, PCR 緩沖液1 X （不含MgC12），引物濃度各為1mol /L, Taq酶 1 . 25U / 50 l。每次PCR均設(shè)臵陰、陽(yáng)性對(duì)照各1例，陽(yáng)性對(duì)照 所用模板及引

6、物系Promega公司配給。R1和R2為引物，PCR 參數(shù)為95 C、5 min預(yù)變性，加入 Taq酶，94 12 1 min , 52 C 1 min , 72 C I. 5 min，循環(huán)25次，最后72 C 5 min。擴(kuò)增片段為 157 bp，酶切條件為50 l反應(yīng)體系中含 0. 25 l BstN1（Bio-lab 公司）、0. 5 l BSA、5 I緩沖液，60 C酶切2 h，煮沸滅活酶。 取2 l酶切產(chǎn)物用作第2次PCR模板，R1和R3為引物，PCR條件 同前，惟循環(huán)次數(shù)為3O次。擴(kuò)增片段為135 bp，取8 l產(chǎn)物作2% 瓊脂糖凝膠電泳分析。 5 .單鏈多態(tài)構(gòu)象性分析（SSCP）

7、:為尋找基因變異，每一 被檢樣本均在 12%非變性聚丙烯酰胺凝膠下進(jìn)行電泳，觀察 SSCP條帶情況。以正常人外周血白細(xì)胞DNA擴(kuò)增產(chǎn)物為陰性 4C、 對(duì)照、胰腺癌細(xì)胞株 Pam-8988 DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物為陽(yáng)性對(duì)照， 電 泳前將PCR產(chǎn)物煮沸5 min熱變性，立即臵冰浴，然后經(jīng) 35V電泳，電泳21 h左右，至二甲苯青距膠底部約 0 . 5C1TI , 結(jié)束電泳，以銀染顯示條帶，照相分析。對(duì)每個(gè)樣本均經(jīng)23 次電泳以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。 6 . DNA測(cè)序：所有經(jīng)PCR-SSCP篩選分析、顯示條帶異 常的胰腺癌和慢性胰腺炎患者的 PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收式純化、克隆入 pUCm-T 載體中，并進(jìn)行插入

8、片段的序列分析。測(cè)序用 PE 公司測(cè)序試劑盒， 在PE公司ABI PRISM 377 DNA測(cè)序儀上進(jìn)行。 7 .統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)軟件，采用丫檢驗(yàn)、Fisher 確檢驗(yàn)和 t 檢驗(yàn)。 結(jié)果 1 KRAS 12密碼子突變檢測(cè)結(jié)果：由表 1可知，由切緣正 常組織一癌周導(dǎo)管增生組織一癌周不典型增生組織一胰腺癌組 織的過(guò)程中， KRAS 12密碼子突變率有逐漸上升的趨勢(shì)，且胰 腺癌組突變率明顯高于正常胰腺、慢性胰腺炎、切緣正常組織 及癌周導(dǎo)管增生組 （P0 01）。 突變方式以 12密碼子 GGT-GAT 、 GTT、 CGT 為主，未見(jiàn) 13密碼子突變 （表2） 。 2胰腺癌組織 KRAS

9、 12 密碼子突變與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系： 由表3可知，胰腺癌組織 KRAS 12密碼子突變與各臨床病理參數(shù) 無(wú)明顯相關(guān)性。 3KRAS 12 密碼子突變與慢性胰腺炎臨床狀況的關(guān)系： 由表4可知， KRAS 12密碼子突變與慢性胰腺炎各項(xiàng)臨床參數(shù)無(wú) 明顯相關(guān)性。 口 號(hào)， RAS為一基因家族， 轉(zhuǎn)導(dǎo)了 RAS基因的NIH/3T3細(xì)胞能發(fā)生轉(zhuǎn)化，從而確定了 其癌基因的地位。RAS突變能導(dǎo)致保守區(qū)氨基酸序列改變，產(chǎn) 生持續(xù)性刺激信號(hào)，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)。 文獻(xiàn)報(bào)道胰腺癌KRAS突變率高達(dá)70%100 %,且?guī)缀醵技?于第 1 外顯子的 1 2密碼子。 KRAS 1 2密碼子的野生型為 GGT ， 突

10、變型常見(jiàn)為GAT、GTT、CGT，此三種類型占所有突變類型 的60 %100 %。Cerny等在亞硝胺誘發(fā)敘利亞倉(cāng)鼠胰腺癌 的模型中發(fā)現(xiàn)，在誘變劑作用下，胰腺導(dǎo)管腺癌發(fā)生之前存在 小灶性增生、乳頭狀增生和原位癌的序列性導(dǎo)管損傷，其中均 可檢測(cè)到KRAS基因異常，因而認(rèn)為K RAS突變是胰腺導(dǎo)管腺癌 發(fā)生的早期事件。因此，KRAS突變可能預(yù)示著潛在的早期胰腺 癌，這也就是KRAS基因突變的早期診斷價(jià)值之所在。而最近 Rivera 等在 42例慢性胰腺炎患者中篩選出 11 例存在導(dǎo)管增生 者為實(shí)驗(yàn)組，4例無(wú)導(dǎo)管增生者為對(duì)照組檢測(cè)KRAS突變，應(yīng)用 顯微切割法 (microdissection) 在

11、組織切片上精確地切割胰腺 導(dǎo)管上皮，經(jīng)抽提DNA、PCR擴(kuò)增、探針雜交、DNA直接測(cè)序， 結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組18 % (2 /11)患者存在KRAS突變，對(duì)照組均為陰 性，因而得出：慢性胰腺炎有胰腺導(dǎo)管增生且存在 KRAS突變是 慢性胰腺炎向胰腺癌發(fā)展的潛在原因。對(duì) 774 例慢性胰腺炎患 者(1991 1999 年)的回顧性分析表明， KRAS12 密碼子平均突 變率為13 % J。而最近對(duì)2 015例慢性胰腺炎患者的流行病學(xué) 研究發(fā)現(xiàn)，慢性胰腺炎患者發(fā)生胰腺癌的危險(xiǎn)性較正常人群顯 著為高， 而且胰腺癌的發(fā)生與慢性胰腺炎病程呈正相關(guān)， 經(jīng)10、 20年的隨訪，分別有 2%和 4%的慢性胰腺炎發(fā)展為

12、胰腺癌，從 而提出， 慢性胰腺炎傾向于向胰腺癌發(fā)展 H J 。一個(gè)正常細(xì)胞轉(zhuǎn) 化為惡性表型之前必須經(jīng)歷多種變化，有研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌周 組織發(fā)生胰腺導(dǎo)管增生顯著高于非惡性對(duì)照組，與癌變模型極 相似，提出可能由胰腺導(dǎo)管增生向胰腺癌發(fā)展。 Luttges 等 J 發(fā)現(xiàn)，KRAS突變陽(yáng)性的胰腺導(dǎo)管腺癌，其癌旁組織胰腺導(dǎo)管增 生亦存在KRAS突變。因此，目前認(rèn)為，慢性胰腺炎與胰腺導(dǎo)管 腺癌的相關(guān)性本質(zhì)上是由于慢性胰腺炎中存在胰腺導(dǎo)管增生， 其被認(rèn)為是胰腺導(dǎo)管腺癌發(fā)生中的一個(gè)環(huán)節(jié)，KRAS突變是此種 細(xì)胞演進(jìn)過(guò)程中的分子事件。 目前KRAS突變存在在研新藥安卓 健，司美替尼。 表明KRAS突變?cè)谝认侔?是否合并胰島 期隨訪慢性胰腺 是否可作為胰 本研究中胰腺癌KRAS基因突變率（79 %）顯著高于慢性胰 腺炎（33 . 3%），表明以KRAS基因?yàn)榉肿訕?biāo)志診斷胰腺癌敏感 性較高，但缺乏特異性。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在切緣正常組織一癌周 導(dǎo)管增生組織一癌周不典型增生組織一胰腺癌組織的過(guò)程中， KRAS突變率有逐漸升高的趨勢(shì)， 且發(fā)現(xiàn)無(wú)KRAS突變的胰腺癌， 其癌旁和手術(shù)切緣各種組織均無(wú) KRAS突變。對(duì)突變者的PCR 產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)，胰腺癌與慢性胰腺炎 KRAS 12 密碼子突變方式 均表現(xiàn)為 GGpGAT 、GTT、CGT ，且同一例患者突變方式一致。 此雖與