六淀粉樣變的診斷和分型進(jìn)展李劍.

1、基于質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)的淀粉樣變分型方法 李劍 北京協(xié)和醫(yī)院血液內(nèi)科 淀粉樣變是一種機(jī)制尚不明的系統(tǒng)性疾病 致淀粉樣蛋白：具有反向平行的折 疊二級(jí)結(jié)構(gòu) 伴侶蛋白共沉積 SAP蛋白 ApoE蛋白 Apo A-IV 蛋白 靶器官損害 沉積效應(yīng) 直接細(xì)胞毒作用 疑診淀粉樣變的可能非糖尿病性腎病綜合征 非缺血性的向心性肥厚的心肌病 不明原因肝大或者膽管酶増高 周圍或自主神經(jīng)病變 不可解釋的面部或頸部瘀斑或出血 巨舌 如何診斷？ 病理學(xué)診斷 組織活檢中發(fā)現(xiàn)均質(zhì)粉染物質(zhì) 剛果紅染色陽(yáng)性 活檢部位陽(yáng)性率 骨髓60% 腹壁皮下脂肪70% 唇腺50% 舌體80% 受累器官（腎-肝-心 90% 識(shí)別剛果紅:熒光VS偏

2、振光 淀粉樣變的類型多樣:剛果紅染色陽(yáng)性不夠 類型前體物來(lái)源治療AL輕鏈克隆性漿細(xì)胞化療/ASCT AA血清致淀粉樣變蛋 白A肝臟原發(fā)病治療SSA野生型甲狀腺轉(zhuǎn)運(yùn)球蛋白肝臟對(duì)癥處理ATTR突變型甲 狀腺轉(zhuǎn)運(yùn)球蛋白肝臟肝移植AFib纖維蛋白原a鏈肝臟肝移植A Apo A1載脂蛋白 Al肝臟/小腸肝移植透析相關(guān)卩2微球蛋白-間斷血濾 非AL型并不少見(jiàn) 英國(guó)注冊(cè)登記研究 Mayo診所的腎臟淀粉樣變亞型分布情況,% AL型vs. M蛋白有M蛋白+是否就是AL型淀粉樣變? AL型淀粉樣變是否都要有M蛋白+? AL型淀粉樣變絕大部分都有M蛋白 血免疫固定電泳（S-IFE 尿免疫固定電泳（U-IFE 血清游

3、離輕鏈比（FLCR 至少1個(gè)陽(yáng)性 N=133例AL型淀粉樣變 M蛋白+ AL型 心臟淀粉樣變性 n=143 ATTR （57%AL （43% SPEP/IFE/U-IFE+ n=76 AL n=56ATTR n=20 FLCR+ n=61 AL n=53 ATTR n=8 組織內(nèi)淀粉樣變蛋白的鑒定方法 免疫組化法/免疫熒光法（IHC免疫電鏡熒光法 已知突變基因的DNA測(cè)序 質(zhì)譜法 新鮮組織全蛋白質(zhì)譜 激光顯微切割+質(zhì)譜假陰性率高 J316例AL型中只有121例有陽(yáng)性組化結(jié)果/商品化抗體種類少 /抗體質(zhì)量影響 J蛋白構(gòu)象變化導(dǎo)致抗體結(jié)合位點(diǎn)喪失假陽(yáng)性率高-缺乏主導(dǎo)蛋白 組織泛染,k臥均陽(yáng)性 /標(biāo)

4、本處理過(guò)程中蛋白雜質(zhì)污染 免疫組化法不再推薦用于AL淀粉樣變分型高通量分析 直接顯示全部蛋白構(gòu)成，無(wú)需逐一檢測(cè)各種致病性蛋白 蛋白鑒定不受構(gòu)象變化影響 鑒定突變型蛋白不依賴于基因檢測(cè) 利于發(fā)現(xiàn)新的致病蛋白種類 激光顯微切割聯(lián)合質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)（LMD/MS 微量蛋白提取 LMD/MS鑒定亞型有著高特異性和敏感性 N 部位敏感性特異性備注 113神經(jīng)100%100%部分為IHC分型失敗病例2 41 心臟 98% 100% IHC分型成功率為42%321神經(jīng)100%NA均為IHC失敗病例。 10例ATTR的LMD/MS分型 結(jié)果與基因檢測(cè)完全相符4 127 腎臟 96% NA 大部分為IHC失敗的病

5、例;發(fā)現(xiàn)了新亞型ALect2 福爾馬林固定后的石蠟包埋組織回顧性分析 會(huì)診分析無(wú)需新鮮組織凍存 顯微切割 準(zhǔn)確定位出淀粉樣變物質(zhì)沉積區(qū)實(shí)現(xiàn)病變與正常組織的準(zhǔn)確分離 LMD/MS的方法學(xué)優(yōu)化 蛋白提取質(zhì)譜前處理質(zhì)譜結(jié)果分析 最佳的蛋白提取液微濾膜使用 微波處理加速流程emPAI定量蛋白 P積分特異性83.3% 質(zhì)譜結(jié)果的解讀:利用D積分確定是否為何種淀粉樣變 D-score =emPAI 1 st-emPAI2nd emPAIlst eniPAI 二豐度最高的致淀粉樣變蛋白的emPAI 1st eniPAI 二豐度次高的致淀粉樣變蛋白的emPAI 2nd 陽(yáng)性對(duì)照組的D積分=0.32-0.93

6、D積分=0.3可以確定出豐度最高的致淀粉樣變蛋白的致病蛋白 PUMCH 的 LMD/MS 研究 2000年1月至2014年6月期間我院確診的138例系統(tǒng)性淀粉樣變患者 有器官腫大和（或器官功能不全的臨床表現(xiàn) 組織活檢可見(jiàn)粉染無(wú)定形物質(zhì)沉積，剛果紅染色陽(yáng)性 P積分=5.0 proBNP4687 24h UP 1.32g ALP正常 腹壁脂肪-直腸-齒齦活檢均陰性 心肌活檢:光鏡C;剛果紅陰性 MS結(jié)果符合淀粉樣變 有ApoE, Apo A-IV,和SAP蛋白3種伴侶蛋白+ 高水平的lambda鏈 P積分=14.6 D積分=0.79 電鏡結(jié)果支持淀粉樣變 原發(fā)性輕鏈型（lambda鏈淀粉樣變（May。分期3期累及心臟-腎臟 AL型淀粉樣變的診斷流程活檢證實(shí)存在剛果紅染色陽(yáng)性血清IFE/尿IFE/血 清FLC陽(yáng)性是否為系統(tǒng)性病變陰性陰性考慮不像AL型篩查其他原因陽(yáng)性系統(tǒng) 型AL免疫熒光或LMD/MS確認(rèn)為輕鏈型局灶型AL陽(yáng)性抗?jié){細(xì)胞治療陰性或不 確定進(jìn)一步尋找其