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文檔簡介
1、1 實實 驗驗 二二 細菌培養(yǎng)基的配制、滅細菌培養(yǎng)基的配制、滅 菌及接種、培養(yǎng)技術菌及接種、培養(yǎng)技術 2 第一部分第一部分 細菌培養(yǎng)基的制備、滅菌細菌培養(yǎng)基的制備、滅菌 目的要求目的要求 實驗材料實驗材料 實驗程序實驗程序 3 目目 的的 要要 求求 熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準備。熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準備。 掌握培養(yǎng)基和無菌水的制備方法。掌握培養(yǎng)基和無菌水的制備方法。 掌握高壓蒸氣滅菌技術。掌握高壓蒸氣滅菌技術。 4 實實 驗驗 材材 料料 藥品:牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、蒸餾水藥品:牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、蒸餾水等等。 高壓蒸氣滅菌鍋、烘箱、細菌過濾器、酒精燈。高壓蒸氣
2、滅菌鍋、烘箱、細菌過濾器、酒精燈。 其它:培養(yǎng)皿、試管、移液管、錐形瓶、燒杯、玻其它:培養(yǎng)皿、試管、移液管、錐形瓶、燒杯、玻 璃珠等。璃珠等。 5 實實 驗驗 程程 序序 玻璃器皿的洗滌和包裝玻璃器皿的洗滌和包裝 培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備 無菌稀釋水的制備無菌稀釋水的制備 培養(yǎng)基和玻璃器材等的滅菌培養(yǎng)基和玻璃器材等的滅菌 6 實驗程序實驗程序1 (玻璃器皿的洗滌和包裝)(玻璃器皿的洗滌和包裝) 清洗并烘干玻璃器皿:如培養(yǎng)皿、移液管、試管等。清洗并烘干玻璃器皿:如培養(yǎng)皿、移液管、試管等。 棉塞的制作棉塞的制作 包裝培養(yǎng)皿和移液管等。包裝培養(yǎng)皿和移液管等。 7 實實 驗驗 程程 序序2 (培養(yǎng)基的
3、種類)(培養(yǎng)基的種類) 據(jù)組成成分可分為據(jù)組成成分可分為: 1.合成培養(yǎng)基:由各種純化學物質按一定比例配制而成。合成培養(yǎng)基:由各種純化學物質按一定比例配制而成。 2.半合成培養(yǎng)基:有一部分純化學物質和另一部分天然物質配制半合成培養(yǎng)基:有一部分純化學物質和另一部分天然物質配制 而成。而成。 3.天然培養(yǎng)基:利用天然來源的有機物配制而成。天然培養(yǎng)基:利用天然來源的有機物配制而成。 從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為 1.液體培養(yǎng)基:不加凝固劑的液體狀態(tài)培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基:不加凝固劑的液體狀態(tài)培養(yǎng)基。 2.固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基中加入固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基中加入1530g/l左右的
4、瓊脂。左右的瓊脂。 3.半固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基中加入半固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基中加入35g/l左右的瓊脂。左右的瓊脂。 8 實實 驗驗 程程 序序2 (培養(yǎng)基的種類)(培養(yǎng)基的種類) 常用凝固劑為瓊脂(其次為明膠),又叫洋菜、凍粉。常用凝固劑為瓊脂(其次為明膠),又叫洋菜、凍粉。 9 實實 驗驗 程程 序序2 (培養(yǎng)基的配制方法和步驟)(培養(yǎng)基的配制方法和步驟) 1. 取一個取一個300ml燒杯,裝燒杯,裝150ml蒸餾水。蒸餾水。 2. 按配方逐一正確稱取各種成分,依次加入水中溶解。按配方逐一正確稱取各種成分,依次加入水中溶解。 注意:注意: a. 前一種成分溶解之后,才能加入下一種成分
5、前一種成分溶解之后,才能加入下一種成分 b. 可加熱促進各成分溶解可加熱促進各成分溶解 c. 加熱過程應不斷攪拌,以免糊底燒焦,并適當加熱過程應不斷攪拌,以免糊底燒焦,并適當 補充因蒸發(fā)而損失的水量。補充因蒸發(fā)而損失的水量。 培養(yǎng)基配方 牛肉膏蛋白胨氯化鈉瓊脂蒸餾水ph 數(shù)量0.75g1.5g0.75g3g150ml7.6 10 實實 驗驗 程程 序序2 (培養(yǎng)基的配制方法和步驟)(培養(yǎng)基的配制方法和步驟) 3. 調調ph值:用值:用10 naoh調調ph至至7.6,用精,用精 密密ph試紙對照。試紙對照。 4. 分裝:將培養(yǎng)基分裝于分裝:將培養(yǎng)基分裝于5支試管,其余全部支試管,其余全部 倒入
6、倒入250ml錐形瓶中,分別塞上棉塞。錐形瓶中,分別塞上棉塞。注意注意 不要污染棉塞和瓶口不要污染棉塞和瓶口。 5. 包扎成捆,掛上標簽,注明何種培養(yǎng)基。包扎成捆,掛上標簽,注明何種培養(yǎng)基。 6. 滅菌備用:培養(yǎng)基滅菌后必須在滅菌備用:培養(yǎng)基滅菌后必須在37下恒下恒 溫培養(yǎng)溫培養(yǎng)24h,確定無菌生長,方可使用。,確定無菌生長,方可使用。 11 實實 驗驗 程程 序序2 (培養(yǎng)基的分裝和斜面培養(yǎng)基的制作)(培養(yǎng)基的分裝和斜面培養(yǎng)基的制作) 每支試管裝的量為試管高度的每支試管裝的量為試管高度的1/41/3. 斜面長度為試管長度的斜面長度為試管長度的1/31/2. 12 實驗程序實驗程序2 (培養(yǎng)基
7、的配制方法和步驟)(培養(yǎng)基的配制方法和步驟) 13 實驗程序實驗程序3 (無菌稀釋水的制備)(無菌稀釋水的制備) 取一個取一個250ml的錐形瓶裝的錐形瓶裝90(或或99)ml蒸餾水,蒸餾水, 放放30顆玻璃珠顆玻璃珠(用于打破活性污泥、菌塊或土壤用于打破活性污泥、菌塊或土壤 顆粒顆粒)于錐形瓶內,塞棉塞、包扎,待滅菌。于錐形瓶內,塞棉塞、包扎,待滅菌。 另取另取5支支18mm180mm的試管,分別裝的試管,分別裝9ml 蒸餾水,塞棉塞、包扎,待滅菌。蒸餾水,塞棉塞、包扎,待滅菌。 無菌稀釋水為微生物分離實驗中所需要的材料。無菌稀釋水為微生物分離實驗中所需要的材料。 14 實驗程序實驗程序4
8、(培養(yǎng)基和玻璃器材等的滅菌)(培養(yǎng)基和玻璃器材等的滅菌) 加熱滅菌有加熱滅菌有干熱滅菌干熱滅菌和和濕熱滅菌濕熱滅菌。 干熱滅菌法:電熱烘箱作為干熱滅菌器干熱滅菌法:電熱烘箱作為干熱滅菌器 干熱滅菌的操作方法干熱滅菌的操作方法 a. 將待滅菌的物品放入恒溫箱,將溫度調節(jié)至將待滅菌的物品放入恒溫箱,將溫度調節(jié)至160 并維持并維持2h; b. 把恒溫箱的調節(jié)旋鈕調回零處,待溫度降到把恒溫箱的調節(jié)旋鈕調回零處,待溫度降到50 左右,才能將物品取出。左右,才能將物品取出。 15 實驗程序實驗程序4 (培養(yǎng)基和玻璃器材等的滅菌)(培養(yǎng)基和玻璃器材等的滅菌) 濕熱滅菌:高壓蒸氣滅菌法濕熱滅菌:高壓蒸氣滅菌
9、法 高壓蒸氣滅菌法的操作步驟如下:高壓蒸氣滅菌法的操作步驟如下: 1. 滅菌鍋內加入一定量的水。滅菌鍋內加入一定量的水。 2. 將待滅菌的物品放入鍋內,并關嚴鍋蓋。將待滅菌的物品放入鍋內,并關嚴鍋蓋。 注意:器物不能裝得太滿。注意:器物不能裝得太滿。 3. 接通電源,進行加熱。接通電源,進行加熱。 4. 排除高壓鍋內的冷空氣,可將排氣閥打開,待溫度排除高壓鍋內的冷空氣,可將排氣閥打開,待溫度 計指示溫度為計指示溫度為100時關閉排氣閥;或當排出的蒸氣相時關閉排氣閥;或當排出的蒸氣相 當猛烈且微帶藍色時關閉排氣閥。當猛烈且微帶藍色時關閉排氣閥。 16 實驗程序實驗程序4 (培養(yǎng)基和玻璃器材等的滅
10、菌)(培養(yǎng)基和玻璃器材等的滅菌) 5. 當壓力達當壓力達1.05kg/cm2(滅菌器內的溫度為滅菌器內的溫度為121) 即開始滅菌即開始滅菌,使其維持,使其維持1530min。對熱不穩(wěn)定的培。對熱不穩(wěn)定的培 養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物質時,應適當降低壓力養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物質時,應適當降低壓力 (0.56kg/cm2) ,延長時間。,延長時間。 6. 滅菌時間一到,切斷電源,滅菌時間一到,切斷電源,待壓力降至零時待壓力降至零時,才能,才能 打開排氣閥,然后打開滅菌器蓋,取出物品,排出鍋內打開排氣閥,然后打開滅菌器蓋,取出物品,排出鍋內 剩余水。剩余水。 7. 待培養(yǎng)基冷卻后置于待培養(yǎng)
11、基冷卻后置于37恒溫箱內培養(yǎng)恒溫箱內培養(yǎng)24h,若無,若無 菌生長則放入冰箱或陰涼處保存?zhèn)溆?。菌生長則放入冰箱或陰涼處保存?zhèn)溆谩?17 18 實驗程序實驗程序4 (培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法)(培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法) 間歇滅菌法:間歇滅菌法:即常壓滅菌,用于一些受高溫而破壞的培即常壓滅菌,用于一些受高溫而破壞的培 養(yǎng)基的滅菌。養(yǎng)基的滅菌。 操作方法:操作方法: a. 待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里,每天蒸煮待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里,每天蒸煮1次,次, 每次在每次在100煮沸煮沸3060min,連續(xù),連續(xù)3d重復進行。重復進行。 b. 在每兩次蒸煮之間,將物品(指培養(yǎng)基)放在在每兩次
12、蒸煮之間,將物品(指培養(yǎng)基)放在37 恒溫條件下培養(yǎng)恒溫條件下培養(yǎng)24h,這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘,這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘 留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體,以便下次蒸煮時殺滅。留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體,以便下次蒸煮時殺滅。 c. 第三次蒸煮之后基本無菌,但為了確保無菌仍要放在第三次蒸煮之后基本無菌,但為了確保無菌仍要放在 37恒溫條件下培養(yǎng)恒溫條件下培養(yǎng)24h,確定無菌才能使用。,確定無菌才能使用。 19 實驗程序實驗程序4 (培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法)(培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法) 過濾除菌法過濾除菌法: 不能用加熱滅菌的不能用加熱滅菌的 液體物質(如維生液體物質(如維生 素、血清),一般素、
13、血清),一般 可用細菌過濾器進可用細菌過濾器進 行除菌。行除菌。 20 第二部分第二部分 細菌純種分離、培養(yǎng)和接細菌純種分離、培養(yǎng)和接 種技術種技術 目的要求目的要求 實驗材料實驗材料 實驗程序實驗程序 21 目目 的的 要要 求求 掌握從環(huán)境中分離培養(yǎng)細菌的方法,從掌握從環(huán)境中分離培養(yǎng)細菌的方法,從 而獲得若干種細菌純培養(yǎng)技能。而獲得若干種細菌純培養(yǎng)技能。 掌握幾種接種技術。掌握幾種接種技術。 22 實實 驗驗 材材 料料 無菌培養(yǎng)皿無菌培養(yǎng)皿(直徑直徑90mm)10套、無菌移液管套、無菌移液管1ml2 支、支、10ml1支支。 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基1瓶,活性污泥或土壤或湖水瓶,活性
14、污泥或土壤或湖水1瓶,瓶, 無菌稀釋水無菌稀釋水90ml1瓶、瓶、9ml5管。管。 其它:接種環(huán)、酒精燈、恒溫箱。其它:接種環(huán)、酒精燈、恒溫箱。 23 實實 驗驗 程程 序序 細菌的純種分離細菌的純種分離 細菌的接種方法細菌的接種方法 24 實驗程序實驗程序1 (細菌的純種分離)(細菌的純種分離) 稀釋平板法稀釋平板法 平板劃線法平板劃線法 25 實驗程序實驗程序1 (細菌的純種分離(細菌的純種分離稀釋平板法)稀釋平板法) 1. 取樣。取樣。 2. 將將1瓶瓶90ml和和5管管9ml無菌水排列好,用記號筆無菌水排列好,用記號筆 依次編上依次編上10 1、 、 10 2、 、10 3、 、10
15、4、 、10 5、 、10 6。 。 在無菌操作條件下,用在無菌操作條件下,用10ml的無菌移液管吸取的無菌移液管吸取 10ml水樣水樣(或其它樣品或其它樣品)加入編號為加入編號為10 1無菌水 無菌水(內內 含玻璃珠含玻璃珠)中,將移液管吹洗三次,用手搖中,將移液管吹洗三次,用手搖10min將將 顆粒狀樣品打散。即為顆粒狀樣品打散。即為10 1濃度的菌液。用 濃度的菌液。用1ml無無 菌移液管吸取菌移液管吸取1ml 10 1濃度的菌液于編號為 濃度的菌液于編號為10 2 無菌水中,將移液管吹洗三次,搖勻即為無菌水中,將移液管吹洗三次,搖勻即為10 2濃度 濃度 菌液。同樣方法,依次稀釋到菌液
16、。同樣方法,依次稀釋到10 6 。 。 26 實驗程序實驗程序1 (細菌的純種分離(細菌的純種分離稀釋平板法)稀釋平板法) 稀釋液的制備稀釋液的制備 27 實驗程序實驗程序1 (細菌的純種分離(細菌的純種分離稀釋平板法)稀釋平板法) 3. 平板的制作平板的制作 取取10套無菌培養(yǎng)皿編號,套無菌培養(yǎng)皿編號, 10 4、 、10 5、 、10 6各 各3個,另一個個,另一個 為空氣對照。為空氣對照。 取取1支支1ml無菌移液管從無菌移液管從濃度小的菌液濃度小的菌液開始,以開始,以10 6、 、10 5、 、 10 4為序分別吸取 為序分別吸取0.5ml菌液于相應編號的培養(yǎng)皿內菌液于相應編號的培養(yǎng)皿
17、內(每次吸取每次吸取 前,用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勻前,用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勻)。 28 實驗程序實驗程序1 (細菌的純種分離(細菌的純種分離稀釋平板法)稀釋平板法) 3. 平板的制作平板的制作 加熱培養(yǎng)基,當其冷至加熱培養(yǎng)基,當其冷至45 左右時,右手拿裝有培養(yǎng)基的錐左右時,右手拿裝有培養(yǎng)基的錐 形瓶,左手拿培養(yǎng)皿,以中指、形瓶,左手拿培養(yǎng)皿,以中指、 無名指和小指托住皿底,拇指和無名指和小指托住皿底,拇指和 食指夾住皿蓋,靠近火焰,將皿食指夾住皿蓋,靠近火焰,將皿 蓋掀開,倒入培養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿蓋掀開,倒入培養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿 平放在桌上,順時針和逆時針來平放在桌上,順時針和
18、逆時針來 回轉動培養(yǎng)皿,使培養(yǎng)基和菌液回轉動培養(yǎng)皿,使培養(yǎng)基和菌液 充分混勻,冷凝后即成平板,倒充分混勻,冷凝后即成平板,倒 置于置于30培養(yǎng)培養(yǎng)2448h,然后觀,然后觀 察結果。察結果。 29 實驗程序實驗程序1 (細菌的純種分離(細菌的純種分離稀釋平板法)稀釋平板法) 3. 平板的制作平板的制作 取對照無菌培養(yǎng)皿,倒平板待凝固后,打開皿取對照無菌培養(yǎng)皿,倒平板待凝固后,打開皿 蓋蓋10min后蓋上,倒置于后蓋上,倒置于30培養(yǎng)培養(yǎng)2448h,然,然 后觀察結果。后觀察結果。 30 實驗程序實驗程序1 (細菌的純種分離(細菌的純種分離平板劃線法)平板劃線法) 1. 平板制作:平板制作:將融
19、化并冷至約將融化并冷至約50的肉膏蛋的肉膏蛋 白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內,使凝固成白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內,使凝固成 平板。平板。 2. 劃線:劃線:用接種環(huán)挑取一環(huán)樣品,左手拿培養(yǎng)用接種環(huán)挑取一環(huán)樣品,左手拿培養(yǎng) 皿,中指、無名指和小指托住皿底,拇指和食皿,中指、無名指和小指托住皿底,拇指和食 指夾住皿蓋,將培養(yǎng)皿稍傾斜,左手拇指和食指夾住皿蓋,將培養(yǎng)皿稍傾斜,左手拇指和食 指將皿蓋掀半開,右手將接種環(huán)伸入培養(yǎng)皿內,指將皿蓋掀半開,右手將接種環(huán)伸入培養(yǎng)皿內, 在平板上輕輕劃線在平板上輕輕劃線(切勿劃破培養(yǎng)基切勿劃破培養(yǎng)基)。劃線完。劃線完 畢蓋好皿蓋,畢蓋好皿蓋,30培養(yǎng)培養(yǎng)244
20、8h后觀察結果。后觀察結果。 31 實驗程序實驗程序1 (細菌的純種分離(細菌的純種分離平板劃線法)平板劃線法) 32 實驗程序實驗程序2 (細菌的接種技術)(細菌的接種技術) 接種方法:常用的有接種方法:常用的有斜面接種法斜面接種法、平板接種法平板接種法、液體接種法液體接種法、 試管深層固體培養(yǎng)基的試管深層固體培養(yǎng)基的穿刺接種法穿刺接種法。 接種工具:常用的有接種針、接種環(huán)、接種鉤、接種圈、接接種工具:常用的有接種針、接種環(huán)、接種鉤、接種圈、接 種鏟或接種鋤、玻璃涂棒等。種鏟或接種鋤、玻璃涂棒等。 圖6 33 實驗程序實驗程序2 (細菌的接種技術(細菌的接種技術斜面接種法斜面接種法) 左手平
21、托兩支試管,拇指壓住兩支試左手平托兩支試管,拇指壓住兩支試 管。外側是菌種試管,內側是待接種的空管。外側是菌種試管,內側是待接種的空 白斜面白斜面(兩支試管的斜面同時向上兩支試管的斜面同時向上) 。右手。右手 將棉塞旋松,以便在接種時容易拔出。將棉塞旋松,以便在接種時容易拔出。 右手拿接種環(huán),在火焰上先將右手拿接種環(huán),在火焰上先將環(huán)端環(huán)端燒燒 紅滅菌,然后紅滅菌,然后將有可能伸入試管的其余部將有可能伸入試管的其余部 位位也過火滅菌。也過火滅菌。 將兩支試管的上端并齊,靠近火焰,將兩支試管的上端并齊,靠近火焰, 用右手小指、無名指和手掌將兩支試管的用右手小指、無名指和手掌將兩支試管的 棉塞一并夾
22、住拔出,棉塞一并夾住拔出,棉塞仍夾在手中棉塞仍夾在手中,然,然 后讓試管口緩緩過火焰。后讓試管口緩緩過火焰。 1 2 3 34 實驗程序實驗程序2 (細菌的接種技術(細菌的接種技術斜面接種法斜面接種法) 將已灼燒過的接種環(huán)伸入菌種試管內。將已灼燒過的接種環(huán)伸入菌種試管內。先冷卻先冷卻, 而后再用環(huán)挑取少許菌種,將接種環(huán)抽出并迅速伸而后再用環(huán)挑取少許菌種,將接種環(huán)抽出并迅速伸 入待接種試管底部,在斜面上入待接種試管底部,在斜面上由底部向上劃線由底部向上劃線。抽。抽 出接種環(huán),塞上棉塞將試管插在試管架上,最后再出接種環(huán),塞上棉塞將試管插在試管架上,最后再 次燒紅接種環(huán),則接種完畢。次燒紅接種環(huán),則接種完畢。 4 5 67 8 35 實驗程序實驗程序2 (細菌的接種技術(細菌的接種技術液體接種和穿刺接種液體接種和穿刺接種) 液體接種法液體接種法(從斜面菌種接入培養(yǎng)液從斜面菌種接入培養(yǎng)液):用:用接種環(huán)接種環(huán)挑取斜面菌挑取斜面菌 種送入培養(yǎng)液中,使環(huán)在液體表面與管壁接觸輕輕研磨,將種送入培養(yǎng)液中,使環(huán)在液體表面與管壁接觸輕輕研磨,將 環(huán)上的菌種全部洗入培養(yǎng)液中,取出接種環(huán)塞上棉塞。將試環(huán)上的菌種全部洗入培養(yǎng)液中,取出接種環(huán)塞上棉塞。將試 管輕輕撞擊手掌使菌體在培養(yǎng)液中均勻分布。最后將接種環(huán)管輕輕撞擊手掌使菌體在培養(yǎng)液中均勻分布。最后將接種環(huán) 燒紅滅菌燒紅滅菌
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