基因克隆步驟完整版

1、學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò)，僅供學(xué)習(xí)和參考 ,如有侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除1 總 RNA 提取(1) 液氮研磨或冰上勻漿實(shí)驗(yàn)材料；先將 1ml Trizol 加到離心管中待用(2) 將研磨好的樣品加到離心管中混勻，室溫放置5 min ;打開離心機(jī)預(yù)冷(3) 力卩200 L氯仿，振蕩15 sec室溫放置3 min，分層； 4C, 12,000g，離心 15 mi n；(5) 取上清，加500 Z異丙醇，混勻，室溫放置10 min;(6) 4C, 12,000g，離心 10 mi n；(7) 棄上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗滌沉淀，振蕩充分；再用100%乙醇清洗(8) 4oC，7,500g，離心 5 mi

2、n ；(9) 棄上清，離心，用槍吸取多余液體，放在超凈臺(tái)里干燥后，加50 yLDEPC 水，80C保存。此操作中所用到的器皿均需經(jīng)過 DEPC 滅活 RNA 酶處理。提取的總 RNA 需經(jīng) RNA 電泳檢測(cè)質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。OD260 值為核酸的吸收值，OD280值為蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0間一般說明該核酸蛋白含 量在允許的范圍內(nèi)，可正常使用；此外還有OD230值為多糖和酚類的吸收值，比較干凈的核酸OD260/230值能達(dá)到2.2左右。RNA濃度計(jì)算公式：總RNA濃度(血/mL) =A260 稀釋倍數(shù) 40。2 反轉(zhuǎn)錄 /cDNA 第一鏈的合成純化RN

3、A以去除基因組 DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reage ntwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)說明書進(jìn)行。其體系為：Total RNA1yg5XgDNA Eraser Buffer2yLgDNA Eraser1yLRNase Free dH2O補(bǔ)齊至 10yL條件為： 42oC, 2min；RNA 純化后,即可進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。其體系為：5 PrimeScript Buffer 2 (for Real Time)4yLPrimeScript RT enzyme mix I1yLRT Primer Mix1yL上一步的反應(yīng)液10yL

4、RNase Free dH2O補(bǔ)齊至 20yL操作條件為：(1) 37oC 放置 15 min；(2) 85oC, 5 sec；(3) 4oC 保存。3 PCR按TaKaRa公司的Premix TaqVersion 2.0操作，PCR反應(yīng)體系如下：Premix Taq25 yL模板5yL引物 1 (10 yM)1 yL引物 2 (10 yM)1 yLddH2O18yLPCR反應(yīng)條件為：94預(yù)變性5min; 94C變性30s, 53C退火30s, 72C 延伸30s,循環(huán)36次；72C延伸10min。PCR反應(yīng)完畢，取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（若割膠回收則用 10 yL反應(yīng)產(chǎn)物）。4 基因

5、克隆及測(cè)序4.1 PCR 產(chǎn)物切膠回收將 PCR 產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳， 在紫外燈下觀察并切下預(yù)期大小的 DNA 片段。使用 TIANGEN 公司的 Universal DNA Purification Kit 割膠回收試劑 盒進(jìn)行純化，步驟如下：平衡吸附柱：向吸附柱 CB2中(吸附柱放入收集管中)加入 500 L平衡 液BL , 13,400X g離心1 min,倒掉收集管中的廢液，吸附柱 CB2重新套回收集 管中；(2) 按100 mg agarose膠加入100 L溶液PC,置于50C中10 min左右， 中途混勻幾次，至膠完全融化；(3) 將樣品倒入一個(gè)吸附柱 CB2 中(吸

6、附柱放入收集管中) ，室溫下 13,400 x g離心1 min,倒掉收集管中的廢液，吸附柱 CB2重新套回收集管中；(4) 向吸附柱CB2中加入600 Z漂洗液PW (加乙醇)，室溫下13,400x g離 心1 min，倒掉收集管中的廢液，吸附柱 CB2重新套回收集管中；(5) 重復(fù)上一步驟；將吸附柱CB2放入收集管中，室溫下13,400x g離心2 min，盡量除去 漂洗液，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干；(7) 將柱子套入一新的滅菌 1.5 mL 離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加 50丄 洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，13,400x g室溫離心2 min,收集到的洗脫 液即為回收的

7、 DNA 純化液；(8) 取5讓的純化液體進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，以檢查純度，并測(cè)量溶液 中 DNA 含量。4.2目的片段與載體連接(1) 膠回收產(chǎn)物與T載體連接體系，參考Takara公司pMD18-T載體的試劑 盒說明書。在滅菌的0.5 mL離心管中配制如下溶液(10卩1)：回收 DNALigation SolutionpMD18-T Vector16C反應(yīng)30分鐘，所得產(chǎn)物保存于4C冰箱備用4.3連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5a(1)將5山連接產(chǎn)物加入到100此E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)離 心管混勻內(nèi)容物，冰上靜置 30 min；42C水浴熱激轉(zhuǎn)化90 sec立即放回冰上，放置3 min;(3) 每管加入500此LB 培養(yǎng)基 (室溫放置),37C 160-180 rpm振蕩培養(yǎng) 45-60 min,使菌體復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因；(4) 在含有Amp (100財(cái)/mL)的選擇性平板上加入60-100 L菌液，用無 菌涂布棒輕輕涂布均勻后，用 Parafilm 膜封好；(5) 將培養(yǎng)皿正放，37oC約50 min,待液體全部吸收后，倒置平板繼續(xù)培養(yǎng) 10-16 h。4.4轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定(1) 用無菌槍頭挑取 LB 平板上 3-5個(gè)單菌落，分別接種到 3.5 mL LB 液體 培養(yǎng)基中(含 100 fg/mL Amp)，37C, 165rpm振蕩培養(yǎng) 1