甲狀腺乳頭狀癌基因譜表達的初步研究

1、DOC格式論文，方便您的復制修改刪減甲狀腺乳頭狀癌基因譜表達的初步研究（作者：單位：郵編：）【摘要】目的：利用基因芯片篩選與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展和與惡性度相關(guān)的基因。方法：分別選取高、低分化甲狀 腺乳頭狀癌組織標本，抽提、純化mRNA，同法再純化同患者的正常甲狀腺組織的 mRNA ;用Cy5熒光染料對甲狀腺乳頭狀癌組織 mRNA作探針標記，以Cy3熒光染料對正常黏膜組織的 mRNA作探 針標記，一同和可檢測4 096個基因片段的BiostarH 40 s型基因芯 片進行雜交得到的雙色熒光標記芯片， 將之分別掃描入計算機，進行 結(jié)果分析。結(jié)果：高、低分化2種芯片上均有大量基因片段出現(xiàn)了的 高

2、/低表達的情況，高分化芯片上異常表達片段數(shù)量為低表達 351條, 高表達417條，低分化芯片上異常表達者為低表達 410條，高表達 415條。在2種芯片中均有相同表達差異趨勢的基因片段中，共計有90條基因片段出現(xiàn)低表達，其中隨惡性度增高而降低的基因有19條; 有78條片段呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，其中隨惡性度增高而表達增加的有 25 條。表達異常的片段功能較分散；有大量的不明功能的片段發(fā)現(xiàn)。結(jié) 論：甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展不能用單一的基因變異解釋，而是由多基因共同作用的結(jié)果，并且變異具有明顯的個體性差異；甲狀腺 乳頭狀癌的惡性度與多個基因片段異常表達相關(guān)。很多新發(fā)現(xiàn)的片段的功能不明了，對于確定甲狀腺乳

3、頭狀癌的發(fā)生發(fā)展內(nèi)在機制仍有待 研究。【關(guān)鍵詞】基因芯片；基因表達；甲狀腺癌ABSTRACT Objective: To screen genes that were correlative with careinogenesis, development and malignance of papillary thyroid carcinoma using cDNA microarray. Method: Two pieces of papillary thyroid carc inomatissue with differe ntmalignance degree and samples

4、from normal thyroid tissue were collected for mRNA extractio n and purificatio n. Marked the purified mRNA from carc inoma tissue with Cy5 deoxycytid ine triphosphate for probes labeli ng and mRNA from no rmal tissue with Cy3 JdCTP separately, mix these two kinds of mRNA probes together and the n hy

5、bridize to the cDNA microarray. If Cy3 signal is stronger, the spot on the microarray would be green, means low expressed gene. While stronger Cy5 signal will lead to a red spot, which means over expressed gene. Experiment gets 2 pieces of double Jcolor cDNA microarrays and the n they were sca nned

6、into computer and analyzed. Result: Differences were found between carcinoma tissue and normal thyoid tissue in their gene fragmentsexpression.In the well _differentiated chip, there are 351 low expressed and 417over expressedgene fragmentspresented. To the poorlydiffere ntiated chip, the corresp on

7、dence nu mber was 410 and 415.90 low expressed and 78 over expressed genes fragme nts were in dividuallyprese nted in both chip segme ntswith similarexpressi on trend, of which, expressi on of 25 seemed correlated to malig nant degree. Large qua ntity of genes with unknown fun cti ons were found. Co

8、nclusion: The carcinogenesis, development and malig nance degree of papillary thyroid carc inoma is resulted from differe nt kinds of abno rmality of polyge nes not a sin gle gene. Since functions of many gene fragments has been unknown to us yet, further study still n eeds to be done.KEY WORDS Gene

9、 chip; Gene expression; Thyroid carc inoma甲狀腺癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤，病理分型上分為4種：乳頭狀癌、濾泡型癌、髓樣癌、未分化癌，其中又以乳頭狀癌(papillarythyroid carci noma ， PTC)所占比例最大，約為70%左右，故而獲得 了更多的研究關(guān)注。在以往的文獻中，對于乳頭狀癌異常基因片段表 達情況的研究多為某一片段，難于產(chǎn)生較為全面的認識。本實驗即利 用基因芯片對甲狀腺乳頭狀癌的基因進行大規(guī)模片段的研究，對其基因譜表達作一初步分析。1材料與方法1.1材料1.1.1標本制備所有病例均來自哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院。術(shù)前選擇單

10、側(cè) 甲狀腺發(fā)生腫瘤病例，手術(shù)中切取腫瘤組織和對側(cè)腺體正常組織，分別進行液氮冷凍保存。術(shù)后根據(jù)病理診斷，確定為單側(cè)甲狀腺乳頭狀 癌者標本留用，否則篩除。最終樣本皆為女性。1.1.2基因芯片上海博星公司產(chǎn)BiostarH _40 s基因芯片。1.1.3實驗試劑均由上海博星公司對外試驗室提供，包括TRIzol，異丙醇,氯仿, RNeasy Midi kit 75142， Easy Exteact，75% 乙醇(RNase free)， MillijQ水(RNasefree)，無水乙醇，雜交試劑盒等。其中 TRIzol購自 LifeTechnologies 公司，試劑盒中 RNAlater，DEPC，

11、RNAsecure TM Reage nt 購自 Qiage n 公司。1.1.4儀器與設(shè)備S_200 純化柱購自 Amersham Pharmacia Biotech Inc， CT02 50型真空濃縮儀購自 CHRIST Ltd.，GenePix 4 000B 型芯片 掃描儀購自AXON Ltd，核酸分析儀產(chǎn)自 Biochrom Ltd. Cambridge CB4 OFJ England ，MillijQ 水生成儀購自 MILIPORE Ltd.，DY891 型電動玻璃勻漿機產(chǎn)自寧波新芝科器研究所，F(xiàn)R280型電泳儀和FR 200型凝膠成像儀產(chǎn)自上海復日科技，QL901型漩渦混合器購自

12、海門市麒麟醫(yī)用儀器廠，DND9052型雜交箱產(chǎn)自上海精宏實驗設(shè)備有限公司1.1.5計算機處理軟件采用GenePix Pro 3.0計算機處理軟件1.2方法1.2.1組織標本的獲取手術(shù)中甲狀腺腫瘤標本切下后，立即切取腫瘤組織和對側(cè)腺體組織標本，分別置入冷凍管中，標明實驗組和對照組編號，迅速投入液氮容器冷卻，整個過程在3 min內(nèi)完成。術(shù)后對腫瘤組織和對側(cè)腺 體組織作病理以明確病理性質(zhì)。留用標準為：單側(cè)乳頭狀癌，對側(cè)組 織為正常腺體、組織切片內(nèi)未見微轉(zhuǎn)移灶或其他良性病變。1.2.2分組按照分化程度，將高分化、低分化乳頭狀癌分別進行試驗。1.2.3總RNA提取將超低溫保存的樣品稱重、碾磨、勻漿、多次

13、離心得到RNA沉淀后，加入RNase free的Milli_|Q水溶解，保存。1.2.4探針標記與雜交預雜交、在冰浴中進行探針標記（對癌組織用Cy5熒光染料作 標記，作對照的同患者的對側(cè)正常甲狀腺組織則以 Cy3熒光染料作 標記）、雜交、洗片，芯片晾干后掃描入計算機。1.2.5計算機處理將掃描結(jié)果進行計算機處理，測定基因變化情況。2結(jié)果2.1總RNA檢驗結(jié)果兩組樣本的mRNA質(zhì)量及數(shù)量經(jīng)檢測全部合格，符合實驗要求。2.2基因芯片的原始情況基因芯片的熒光標記圖像（圖1）疊加，掃描入計算機后，進 行分析處理?；蚱伪磉_高低的判定方法為：以Y軸表示Cy5熒光的雜交信號相對強度,X軸示Cy3的雜交信

14、號強度，作圖（圖2）， 每一個數(shù)據(jù)點代表芯片上1個基因點的雜交信號。結(jié)果可見大部分基 因信號位于45度線附近，Cy5/Cy3的比值在0.52.0之間，在此 范圍基本屬于非差異性表達；遠離45度角直線的點（Cy5/Cy3的比值 在0.52.0范圍之外）則提示基因片段存在差異性表達，低于0.5者 為低表達，高于2.0為高表達。2.3表達差異基因分類結(jié)果高、低分化兩種芯片上均有大量基因片段出現(xiàn)了的高/低表達的情況，高分化芯片上異常表達片段數(shù)量為低表達351條，高表達417條，低分化芯片上異常表達者為低表達 410條，高表達415條。在2 種芯片中均有相同表達差異趨勢的基因片段中，共計有 90條基因片

15、 段出現(xiàn)低表達，占基因檢測總數(shù)的2.20%，其中隨惡性度增高而降低 的基因有19條；有78條片段呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，占總數(shù)的 1.90%， 其中隨惡性度增高而表達增加的有 25條。表1中列出了 2張芯片中 Cy5/Cy3值超過8的片段。表1低、高分化甲狀腺乳頭狀癌最高表達基因片段對照簡表（略）3討論甲狀腺癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，甲狀腺惡性腫 瘤中PTC最常見。國際上公認PTC的病理診斷標準為細胞核呈毛玻 璃樣伴有核溝及核內(nèi)包涵體1 。但惡性腫瘤具有異質(zhì)性，有些PTC 并不具有上述特征，一些良性甲狀腺病變也有類毛玻璃樣核。 在活檢 及細針吸取甲狀腺標本中，一些 PTC單憑HE染色，鏡下難以與

16、良 性病變區(qū)別，易造成誤診和漏診，延誤病情，臨床實際工作中需要新 的可靠的標記物協(xié)助 PTC診斷鑒別。明確甲狀腺乳頭狀癌的基因譜 變化對明確甲狀腺乳頭狀癌的分子生物學發(fā)生、臨床快速診斷以及將來的個性化基因治療都有意義。基因芯片雜交技術(shù)是近幾年新發(fā)展的具有突破性的基因水 平檢測技術(shù)，實驗方法簡便，結(jié)果準確，具有高通量、高特異性的特 點2，可以同時檢測幾千乃至上萬基因片段的表達情況，最適合于腫瘤基因的大規(guī)模分析3。本次實驗所用基因芯片為包含有16類 共4 096個基因探針，可檢測的基因片段有原癌基因和抑癌基因、離子通道和運輸?shù)鞍住⒓毎芷诘鞍最?、外壓反?yīng)蛋白、細胞骨架和運 動、細胞凋亡相關(guān)的蛋白等

17、15類已知的及若干功能尚未明了的未知 片段在2種芯片中，各自有約20%左右的片段發(fā)生異常表達， 由此可見，發(fā)生變異的甲狀腺癌基因片段是多量存在的，并非只是個別片段。比照差異片段，只有總計約 4.1%的片段在高低表達的芯片 上都有相同的異常表達趨勢，并且其中一些片段尚和惡性度的高低有 著相關(guān)性。由此說明，PTC盡管在光鏡下有著類似的表現(xiàn)，但是在 基因水平上，個體差異是巨大的，并且差異最大的片段并非完全吻合， 也正是因為這個原因，說明 PTC患者對相同化療方案的敏感度必然 不同。對于今后的擬行化療的 PTC患者，使用基因芯片進行相應(yīng)的 藥物敏感度篩查是治療前一項必要步驟。 對于表達趨勢相同的片段而

18、 言，很可能是造成PTC最終表達的根本所在，追尋腫瘤發(fā)生發(fā)展的 原因，這些共性表達的片段是今后重點研究的對象。在最高表達片段中，如 BF698911、NM_003385、 BX537530、BF698898等，集中隸屬于細胞信號和傳遞蛋白片段、 蛋白翻譯合成類片段。另外，在全部的異常表達片段中，細胞信號和 傳遞蛋白片段、其它未知片段所占比例最大?？梢娦盘栂到y(tǒng)及蛋白質(zhì) 合成的異常很可能是PTC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。對于以上 4個片段， 有必要進行進一步的研究以明了其在 TPC中的具體作用。在PTC，目前手術(shù)仍然是治療的主要方法，但是對于一些 主觀上排斥手術(shù)或客觀上不宜進行手術(shù)的患者，卻仍然欠缺理想的

19、非手術(shù)治療手段4。惡性腫瘤的治療方法在當代已經(jīng)有了比較大的發(fā)展，除了傳統(tǒng)的三大治療方法，一些新型的治療方法日益顯示出旺盛 的生命力，生物學治療已經(jīng)成為公認的腫瘤第四療法， 如白介素應(yīng)用 于某些腫瘤的治療，已取得了顯著效果?；蛑委煂儆谏飳W治療的 一種，是一種非常有發(fā)展前景的方法。腫瘤是基因病，理論上有個性 化的基因治療是最理想的措施。針對性的基因治療有可能使以手術(shù)和 1311放療為主的治療方式1,5 發(fā)生根本性的變化，但前提是明確 腫瘤基因譜的變化，對癥下藥。在共同高表達最明顯的片段中，功能 已知的為NM_000584，即白介素8的mRNA，白介素家族或許是可 以達到一定治療效果的突破口。在本次試驗中，同樣可以發(fā)現(xiàn)基因芯片在當前臨床應(yīng)用仍 然有一些局限性。如單張芯片造價較高、相應(yīng)的試驗需要配套的設(shè)備、 靈敏度較高易出現(xiàn)假陽性等。在大樣本的對照試驗未果之前，目前似 乎尚不能單純依靠基因芯片進行 PTC的臨床診斷。但是，對于其遠 期的個性化生物治療、抗癌藥物敏感性的判斷等方面，有著良好的應(yīng) 用前景。對于此次試驗得到