人血漿非對稱性二甲基精氨酸濃度的RP HPLC測定法

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減人血漿非對稱性二甲基精氨酸濃度的RP-HPLC測定法（作者：單位：郵編：）【摘要】目的：建立一種測定人血漿中非對稱性二甲基精氨酸（Asymmetric Dimethylarginine ，ADMA濃度的反相高效液相色譜 法（RP-HPLC。方法：采用 Waters symmetry C18柱（5卩 m 3.90 mm X 150 mm,以0.05 mmol/L乙酸鈉（pH6.8）為流動(dòng)相A,甲醇為流 動(dòng)相 B,線性梯度洗脫：14%15 min, 31%25 min, 45%5 min （V/V/V）, 流速1.0 ml/min，熒光檢測，激發(fā)波長330 nm

2、,發(fā)射波長450 nm, 鄰苯二甲醛（OPA進(jìn)行柱前衍生，室溫下檢測。結(jié)果:ADMA在 0.05 5卩g/ml范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系，最小檢出量為0.05卩g/ml ,平均相 對回收率為（93.76 士 2.57 ） %日內(nèi)、日間平均變異系數(shù)分別為（3.25 士 1.59）%、（4.60 士 1.37）%。結(jié)論:本方法準(zhǔn)確、簡便、快速，適用于 科學(xué)研究和臨床檢測?！娟P(guān)鍵詞】非對稱性二甲基精氨酸色譜法反相高效液相血漿中非對稱性二甲基精氨酸 （Asymmetrical dimethylargi nine ,ADMA濃度變化與心血管疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，近年來研究顯示ADMA升高是一種新的心血管病危險(xiǎn)

3、因素1。關(guān)于血漿中ADMA濃度 的檢測方法，國外雖已有報(bào)道2，3，但操作繁瑣，干擾因素多。國 內(nèi)曾有采用正相色譜法的報(bào)道4。本研究在國內(nèi)外同類研究的基礎(chǔ) 上適當(dāng)改進(jìn)，采用反相色譜法，用一元線性梯度洗脫，建立一套準(zhǔn)確、 簡便、快速的高效液相色譜法檢測人血漿中ADMA濃度的方法，報(bào)告如下。1材料1.1試劑AMDA標(biāo)準(zhǔn)品、衍生劑OPA3-巰基丙酸均購自Sigma公司，HPLC分析純度99.99%;甲醇為一級色譜純，購自天津市四友生物醫(yī) 藥科技有限公司；硼酸為一級色譜純，購自上海試劑總廠；乙酸鈉、 冰乙酸、氫氧化鉀、5-磺基水楊酸為分析純，購自上海試劑總廠。 超 純水（18.25 Mcm）。1.2儀器

4、與設(shè)備 高效液相色譜儀為Agilent11OO系列，包括G1322 在線脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1316A柱溫箱、G1321A FLD熒光檢測 器；自動(dòng)進(jìn)樣器；Agile nt化學(xué)工作站（RevA.08.03.847）。高速 離心機(jī)（TGL-16G上海安亭科學(xué)儀器廠出品）；漩渦混合器（XW-80A, 上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠生產(chǎn)）；電子分析天平（AB204-A上海梅特勒- 托利多儀器公司靈敏度0.1 mg）；超純水制備機(jī)（杭州永潔達(dá)凈化科 技有限公司生產(chǎn)）。1.3 AMDA工作液配制 準(zhǔn)確稱取ADMA標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于100 ml容量 瓶中，用超純水溶解并定容，得濃度為 100卩g/ml AD

5、MA儲(chǔ)備液。再 用超純水依次稀釋為 1卩g/ml、2卩g/ml、4卩g/ml、8卩g/ml、10卩 g/ml、20卩g/ml、40卩g/ml的ADM工作液，貯存于4 C備用。1.4流動(dòng)相A配制 精密稱取乙酸鈉4.1 g,用重蒸水溶解后，在1000 ml容量瓶中定容，用2 mol/L冰乙酸調(diào)節(jié)pH值到6.8，即得濃度為 0.05卩mol/L，pH6.8的乙酸鈉溶液，然后用0.45卩m濾膜過濾，超 聲脫氣。1.5 OPA衍生劑配制 精確稱取OPA 20 mg力口 400卩l(xiāng)的甲醇，0.2 mol/L硼酸3.6 ml （pH=9.5），3-巰基丙酸20卩l(xiāng)，混勻避光（現(xiàn)配， 現(xiàn)用）。2方法和結(jié)果2.

6、1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18 柱（5卩 m 3.9 mmx 150 mn），保護(hù)柱： Waters Symmetry C18 保護(hù)柱（5卩 m 3.9 mmx 20 mm；流動(dòng)相：A為0.05卩mmol/L乙酸鈉（pH6.8），B為甲醇，按 B 14% 15 min，31% 25 min，45% 5 min （V/V/V）梯度洗脫；進(jìn)樣量 20卩l(xiāng) ;流速1.0 ml/min ;柱溫40 C；熒光檢測波長：激發(fā)波長 330 nm,發(fā)射波長450 nm。2.2血漿樣品處理方法于1.5 ml離心管（EP管）中精密加入待測血漿1.0 ml，加入20 mg 5-磺基水楊

7、酸，漩渦混勻5 min， 冰浴15 min，于12000 r/min 離心10 min，吸取上清液。2.3樣本柱前衍生 取“ 2.1 ”中上清液100卩l(xiāng)，加OPA衍生劑100 卩l(xiāng)，漩渦混勻避光2 min后，上機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣檢測，色譜圖見圖 1, 可見血漿中ADMAI形良好，分離完全，無雜質(zhì)峰干擾。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 于7支1.5 ml離心管中依次加入不同量的不 同濃度的AMD工作液，再各加入人空白血漿，配成終濃度依次為0.05a g/ml、0.1 卩 g/ml、0.2 卩 g/ml、0.5 卩 g/ml、1.0 卩 g/ml、2.0 卩 g/ml、5.0 a g/ml的血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液系列。

8、 再按血漿樣本處理方法處理后 分別測定，并記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)， ADMA濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得直線回歸方程 Area=60.90027848 x Amt+3.5852958, r=0.99973，最小檢出量0.05 a g/ml，其含量在0.055.0 a g/ml之 間有良好的線性關(guān)系。2.5精密度試驗(yàn) 按“2.3 ”項(xiàng)分別配制濃度為0.1 a g/ml、0.2 a g/ml、0.5 a g/ml的血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按血漿樣本處理方法處理后，日內(nèi)衍 生5次，隔日再衍生5次，分別計(jì)算日內(nèi)變異和日間變異。結(jié)果見表1。2.6回收率試驗(yàn)（相對回收率）按“ 2.3 ”項(xiàng)分別配制濃度為 0

9、.1a g/ml、0.2 a g/ml、0.5 a g/ml的血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液。再按血漿樣本 處理方法處理后測其濃度，以實(shí)測濃度與配制濃度之比乘以100%十算ADMA勺相對回收率，重復(fù)試驗(yàn)5次。結(jié)果見表2。3討論本研究方法在國內(nèi)外同類研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行了適當(dāng)改進(jìn)，采用線性 梯度洗脫。線性梯度洗脫能縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形， 提高檢測靈敏度等。本研究中 ADMAB峰干凈，形態(tài)良好、對稱，但 出峰時(shí)間較其他文獻(xiàn)報(bào)道3,4卻有所延長。這同血漿樣本處理方式 有很大的關(guān)系，國外同類研究對血漿樣本采用固相萃取分離，因此出峰可不考慮血漿中其他雜質(zhì)影響，而國內(nèi)同類研究受實(shí)驗(yàn)條件的限 制，對血漿樣本僅采用

10、血漿蛋白沉淀法，因此需排除血漿中其他雜質(zhì) 的影響。本研究采用 5-磺基水楊酸血漿蛋白沉淀法，血漿蛋白沉淀 較完全，但一開始雜質(zhì)峰仍較多，因此采用線性梯度洗脫，調(diào)整出峰 時(shí)間至1920 min，以減少雜質(zhì)峰的干擾，結(jié)果顯示 ADM/目標(biāo)峰出 峰良好，形態(tài)對稱。本研究建立的血漿ADM濃度RP-HPLC僉測方法，采用OPA前衍生、 線性梯度洗脫，具有快速、簡便、色譜峰形佳，結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)， 血漿中ADMAI低檢測濃度為0.05卩g/ml，精密度和相對回收率均符 合生物等效性指導(dǎo)原則的要求，而文獻(xiàn)報(bào)道稱健康人血漿ADMA水平是(1 士 0.1)卩mol/L (0.275 士 0.028卩g/ml

11、) 5，因此本方法適用于 科研試驗(yàn)研究和臨床檢測?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Sch nabel R, Bla nken berg S, Lubos E,et al. Asymmetric dimethylarg inine and the risk of cardiovascular eve nts and death in patie nts with coronary artery disease: results from the AtheroGe ne Study J. Circ Res,2005,97(5):e53-e59.2 Teerlink T, Nijveldt RJ, de Jong

12、S, et al. Determination of arginine,asymmetric dimethylarginine, and symmetricdimethylargininein human plasma and other biological samplesby high-performa nee liquid chromatography J. AnalBiochem,2002 ,303(2):131-137.3 Teerl inkT.Determi natio nof the en doge nous n itricoxidesyn thase in hibitorasymmetric dimethylargi nine inbiologicalsamples by HPLCM. Methods MolMed,2005,108:263-274.4 張潤香，