生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)一凝膠過濾層析分離蛋白質(zhì)

1、生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)課要求 試劑用后及時(shí)歸位 及時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按時(shí)完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告 離開時(shí)做好清潔工作,實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書寫,標(biāo)題日期 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、實(shí)驗(yàn)原理 三、操作步驟 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 五、分析討論,實(shí)驗(yàn)基本操作,一、玻璃儀器的洗滌 二、吸量管及微量取樣器的使用 三、溶液的混勻 四、離心機(jī)的使用,實(shí)驗(yàn)一 凝膠過濾層析法分離蛋白質(zhì),1.掌握凝膠過濾層析法的基本原理； 2.掌握凝膠過濾層析法分離蛋白質(zhì)的過程。,一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、 實(shí)驗(yàn)原理,1. 常用生化實(shí)驗(yàn)技術(shù),分光光度技術(shù) 電泳技術(shù) 離心技術(shù) 層析技術(shù),2. 層析技術(shù)（色譜技術(shù)）,是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)差異（吸附 力、溶解度、

2、分子形狀和大小、分子極性、分子親 和力等）建立起來的技術(shù)。,（1）層析系統(tǒng)的基本組成,固定相 + 流動(dòng)相,固體物質(zhì) / 固定于固體物質(zhì)的成分,可以流動(dòng)的物質(zhì)：如水和各種溶媒,待分離混合物（A、B）隨流動(dòng)相通過固定相,由于理化性質(zhì)差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、 溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含 量對比）不同,與固定相相互作用力越弱的組分，隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí) 受到的阻滯作用小，移動(dòng)速度快,（2）層析法的分類,按兩相所處狀態(tài)分類,按層析原理分類,按操作形式不同分類,（3）層析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),分離效率高 分析速度快 具有極高的靈敏度 應(yīng)用范圍廣,適用： 雜質(zhì)多、含量少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生

3、 物樣品的分離分析,3. 凝膠過濾層析法（gel filtration chromatography）,（1）原理： 根據(jù)分子大小的差別進(jìn)行分離。每個(gè)凝膠顆 粒好象一個(gè)篩子，小分子物質(zhì)可以進(jìn)入顆粒內(nèi)部， 大分子物質(zhì)被排阻在外。,又名分子篩過濾，排阻層析,（2）凝膠的特點(diǎn),屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條 件較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，不需要 有機(jī)溶劑，對于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。,交聯(lián)葡聚糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 瓊脂糖凝膠,（3）凝膠的選擇,葡聚糖凝膠 (商品名: Sephadex，Dextran) 型號: G-10 G-200,多孔網(wǎng)孔結(jié)構(gòu),數(shù)字愈小,交聯(lián)度越大,被篩分物

4、質(zhì)的分子量也愈小,Sephadex G-50： 對多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍(分子量)為: 1500 30000 Sephadex G-200： 對多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍(分子量)為: 5000 80000,例：,B. 瓊脂糖凝膠 ( 商品名: Sepharose , Bio- gel A ) 對實(shí)驗(yàn)條件要求高 ( 溫度, pH ) 40 4.5- 9.0 工作的下限是葡聚糖凝膠工作的上限, 用于大分子物質(zhì)的分離,C. 聚丙烯酰胺凝膠 商品名: Bio gel P（生物膠P）,三、實(shí)驗(yàn)操作,1. 柱的選擇 直徑： 15 cm 一般長度：直徑 = 10：1 20：1 本實(shí)驗(yàn)玻柱： 直徑0.8 1.5

5、cm 長度 17 20cm,2. 凝膠選擇、制備,血紅蛋白 溶菌酶 分離 （64500） （11400） 選擇 Sephadex G-50,Sephadex G-50： 對多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍(分子量)為: 1500 30000,制備： 將干膠顆粒懸浮于5 10倍的蒸餾水或洗脫液中 充分溶脹，溶脹之后將極細(xì)的小顆粒傾瀉出去,3. 凝膠裝柱,柱固定于架子上，垂直放置，關(guān)住出口 自頂部緩緩加入葡聚糖懸液，使G-50 開始下沉， 至1 2cm時(shí)，打開出口 凝膠逐層上升，至頂部 2-3cm時(shí)，關(guān)閉出口,注意點(diǎn)：,垂直放置 防止氣泡產(chǎn)生 防止柱的分層,4. 平衡,放置一段時(shí)間，約40分鐘（使凝膠更好的壓實(shí)）,注意：,防止床面干涸，可適當(dāng)補(bǔ)充蒸餾水,5. 加樣, 加樣前打開出口，使床面的蒸餾水流出，正好露 出床面時(shí)，立即關(guān)閉出口（將干未干） 用滴管將混合樣品(0.6ml，即血紅蛋白和溶菌酶 各0.3ml)緩緩沿柱內(nèi)壁小心加于床表面 打開出口，使樣品進(jìn)入床內(nèi)，直到床面重新露出, 立即加入12倍于樣品體積的蒸餾水,6. 洗脫,當(dāng)此少量蒸餾水接近流干時(shí)，反復(fù)多次加入蒸 餾水，進(jìn)行洗脫，直到兩帶分開 檢查Hb在層析床中色帶位置，待Hb洗脫完后， 用試管分步收集洗脫液 10d/管，每管加NaOH 2d，CuSO4 2d 檢查溶菌酶洗脫情況，若為紫色，