豬流行性腹瀉病毒毒株遺傳進(jìn)化分析

1、豬流行性腹瀉病毒毒株遺傳進(jìn)化分析豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的,以豬嘔吐、腹瀉、脫水為特征的急性高度接觸性腸道傳染病,各種年齡的豬均可感染,以哺乳仔豬發(fā)病和死亡最為嚴(yán)重。PEDV屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus),基因組為不分節(jié)段的線性單股正鏈RNA,靠近3′端5kb區(qū)域內(nèi)有5個(gè)主要的開放閱讀框,編碼有典型的冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白:N蛋白、M蛋白、sM蛋白和S蛋白;ORF3蛋白位于sM蛋白和S蛋白之間,編碼224個(gè)氨基酸多肽,是PEDV基因組編碼的唯一1個(gè)輔助蛋白。該病于1971年首次在英國(guó)報(bào)道,后相繼在比利時(shí)、德國(guó)、瑞士

2、、日本等國(guó)家報(bào)道,我國(guó)在1976年首次報(bào)道并分離毒株。隨后,中國(guó)使用歐洲株CV777的滅活苗或減毒苗進(jìn)行防控,極大地減少了該病的發(fā)生。但自2010年冬至2011年初,我國(guó)華南、華東和華北等地區(qū)開始暴發(fā)嚴(yán)重的仔豬腹瀉疫情,哺乳仔豬表現(xiàn)水樣腹瀉、嘔吐等主要臨床特征和腸道出血的主要病理特征,發(fā)病豬場(chǎng)哺乳仔豬的發(fā)病率100%,死亡率在80%以上,尤其是5日齡內(nèi)的仔豬,死亡率高達(dá)100%,給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。為能更好地預(yù)防和控制該病暴發(fā)和流行,有必要對(duì)該病病原PEDV進(jìn)行基因遺傳進(jìn)化分析。Chen等對(duì)12株中國(guó)不同地區(qū)的野毒株進(jìn)行ORF3基因的分析,表明中國(guó)毒株與韓國(guó)毒株有很近的遺傳進(jìn)化關(guān)系,

3、而且遠(yuǎn)離PEDV疫苗株。Yang等分析15株P(guān)EDV毒株的ORF3基因和M基因,表明在中國(guó)新近流行的PEDV毒株有了一定程度的 變異和進(jìn)化,是一個(gè)新的基因型。Gao等通過分析15株P(guān)EDV毒株的S基因和M基因發(fā)現(xiàn),新流行的毒株在S基因上有一個(gè)共同的特征。近幾年,PEDV ORF3蛋白的功能逐步被揭示,Wang等證明其是一種離子通道蛋白,當(dāng)ORF3基因的表達(dá)受到抑制后,病毒在Vero細(xì)胞上的產(chǎn)量明顯降低;當(dāng)PEDV毒株適應(yīng)細(xì)胞后,ORF3基因發(fā)生改變,PEDV的毒力也隨之降低;Park等通過ORF3基 因的遺傳進(jìn)化樹分析,證明ORF3基因可以作為區(qū)分高度適應(yīng)細(xì)胞的弱毒株與野毒株的遺傳標(biāo)記,而且O

4、RF3基因也可以作為豬流行性 腹瀉分 子流行病 學(xué)調(diào)查的一個(gè)有效的工具。由此可以看出,ORF3基因的確與PEDV的毒力相關(guān),采用ORF3基因研究新近流行PEDV毒株的遺傳變異規(guī)律具有可行性。目前尚未見到對(duì)全國(guó)所有分離的PEDV流行毒株的遺傳進(jìn)化分析報(bào)道。筆者對(duì)浙江某地及全國(guó)范圍內(nèi)流行的PEDV毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,旨在了解國(guó)內(nèi)PEDV流行毒株的遺傳進(jìn)化狀況,為新發(fā)PEDV的研究提供參考依據(jù)。1、材料與方法1.1試驗(yàn)樣品及處理2011年12月于浙江某豬場(chǎng)采集的49份腹瀉仔豬的肛門試子,用pH 7.4PBS緩沖液適當(dāng)稀釋,反復(fù)凍融3次,-80保存?zhèn)溆谩?.2引物設(shè)計(jì)與合成基于GenBank上發(fā)表的

5、PEDV的ORF3基因序列,利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,上游引物:5′-CCTAGACTTCAACCTTACGA-3′,下游引 物:5′-CAGGAAAAAGAGTACGAAAA-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為774bp,引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。1.3 RNA抽提按照Trizol reagent說明書進(jìn)行操作,抽提的RNA溶解在20μL RNase-free的DEPC水中,并儲(chǔ)存在-70冰箱。1.4 ORF3基因擴(kuò)增25μL反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)包含PEDV RNA 10μL,10×Buffer 5&

6、mu;L,2.5mmol/L dNTP 4μL,PEDV下游引物1μL,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1μL,RNA酶抑制劑0.5μL,ddH2O 3.5μL,室溫下混勻后,42,60min;72,15min。PCR總反應(yīng)體系為25μL,包含反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL,ORF3上游引物1μL(10μmol/L),下游引物1μL(10μmol/L),dNTP2μL,Buffer 2.5μL,EXTaq 0.25μL,然后用ddH2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件:94 預(yù)變性4min,94變性30s,55退火30s,72延伸1min,

7、30個(gè)循環(huán),72延伸5min。1.5 PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序以及ORF3基因遺傳進(jìn)化分析PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定后,克隆至pMD18-T載體中,轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆,進(jìn)行PCR和酶切鑒定,送至上海華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定結(jié)果與GenBank中登錄的65條PEDV的ORF3基因的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析,用ClustalX 1.8和MEGA 3.1等軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析。2、結(jié)果與分析2.1 ORF3基因的序列采自浙江某地豬場(chǎng)的49份樣品,經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序后,41份樣品為PEDV陽性,序列經(jīng)比對(duì)后同源性為99.6%100%。其中的2條序列CH-HZ-11(KC68

8、8871)、CH-HZ-11-2(KC81653)已遞交至GenBank。2.2 ORF3基因進(jìn)化樹分析2株代表性樣品與GenBank中參考序列(表1)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)表明:PEDV共分成4組(G1、G2、G3、G4及G4的2個(gè)亞組G4-1,G4-2)。2011-2012年主要來自廣東、廣西兩省(區(qū))的9條序列與其他省的3條序列組成獨(dú)立的G1組,歐洲的CV777及蘭州的毒株LZC毒株構(gòu)成G2組,韓國(guó)的減毒疫苗株atDR13、歐洲CV777疫苗株與中國(guó)CH-GS111-07、SD-M毒株構(gòu)成G3組,在G4中,韓國(guó)的14個(gè)毒株(2003-2007年)獨(dú)立構(gòu)成G4-1亞組,中國(guó)2006-20

9、12年的毒株與4條韓國(guó)2007年的毒株構(gòu)成G4-2亞組,本文所測(cè)代表性毒株屬于G4-2亞組。2.3 ORF3基因遺傳進(jìn)化分析本研究中擴(kuò)增的ORF3基因片段長(zhǎng)度為774bp,包含完整的ORF3閱讀框,675個(gè)核苷酸編碼224個(gè)氨基酸片段。在ATG啟動(dòng)子上游有46個(gè)核苷酸的一個(gè)基序(CTAGAC)。經(jīng)DNAStar軟件進(jìn)行核苷酸序列分析后,CH-HZ-11、CH-HZ-11-2兩個(gè)毒株與經(jīng)典CV777毒株相比有20個(gè)變異位點(diǎn),其中有8個(gè)位點(diǎn)導(dǎo)致氨基酸發(fā)生變化;與DR13毒株比較有12個(gè)變異位點(diǎn),其中1個(gè)位點(diǎn)導(dǎo)致氨基酸發(fā)生變化;與CV777疫苗株相比(除了CV777疫苗株有大片段缺失外)有12個(gè)變異

10、位點(diǎn),與國(guó)內(nèi)前期毒株CH-S相比有12個(gè)核苷酸變異位點(diǎn),但無氨基酸的統(tǒng)一變化。經(jīng)核苷酸序列分析后,每組的序列都有特異、統(tǒng)一的變化(表2),G1組有9個(gè)核苷酸變化,其中208位的核苷酸變化導(dǎo)致氨基酸發(fā)生變化(I→V)。G2組有6個(gè)核苷酸變化,其中有4處導(dǎo)致氨基酸發(fā)生變化(62位A→V,160位V→I,274位F→L,301位T→A)。G3主要是DR13的疫苗株atDR13(EU054930)在245295處有51個(gè)核苷酸的缺失,CH-GSJ111-07、DBI855、SD-M等毒株均在247295處有49個(gè)核苷酸的缺失。G4組中2個(gè)亞組在393b

11、p處(除CH-GSJII-07毒株外)有統(tǒng)一的核苷酸變化。G4-1與G4-2亞組相比(除了CH-S毒株外),有2個(gè)獨(dú)特核苷酸的變異(63、237處均是G4-1為C,G4-2為T)。G1組毒株和G4-2亞組的一個(gè)分支中的毒株同屬于2011-2012年,但G1的毒株卻自成一組,來源主要以廣東、廣西地區(qū)為主(除AJ1102、CH/HBBD/2001與ZJCZ4外)。G1組與其余3組的遺傳變異分析如下:G1組和G2組相比有21個(gè)核苷酸差異(表3),其中有9處導(dǎo)致氨基酸的變化(39位V→A,160位V→I,208位I→V,235V→I,274L→F,30

12、1A→T,320C→F,497N→S,502D→N)。G1組和G3組相比,有8個(gè)核苷酸的差異(G3組除了大片段的核苷酸的缺失外)。G1和G4相比有2個(gè)核苷酸的差異,其中238bp處導(dǎo)致氨基酸發(fā)生變化V→F。G1和G4-1亞組相比有2個(gè)核苷酸的差異,但均沒有氨基酸發(fā)生變化;與G4-2亞組相比有2個(gè)核苷酸的變化,其中502bp處引起氨基酸發(fā)生變化D→N,237bp處無氨基酸變化(除了SJZ-2011外)。2.4 ORF3基因的同源性分析對(duì)本文的參考序列與代表性毒株序列進(jìn)行核苷酸和相應(yīng)氨基酸同源性分析(表4),G1組內(nèi)所有核苷酸(及氨基酸)

13、序列同源性為98.8% 99.9%(98.7%100%),與G2、G3、G4-1、G4-2的核苷酸(及氨基酸)序列同源性分別為94.5% 96.6%(93.3% 96.0%)、96.1% 97.6%(97.1% 98.6%)、95.6% 97.6%(96.0% 98.7%)、95.0%97.2%(94.7%98.2%)。G2組內(nèi)毒株間的同源性為98.5%100%(98.2%100%),與G3、G4-1、G4-2的同源性分別為96.398.1%(95.7%97.6%)、95.6% 98.1%(94.2% 96.9%)、95.3%97.5%(93.8%96.9%)。G3組內(nèi)核苷酸同源性為99.8%

14、100%(由于CV777疫苗株、CH/GSJIII/07、SD-M毒株編碼的是截短的蛋白,而atDR13(EU054930)編 碼的是完整的ORF3閱讀框,分析氨基酸序列同源性時(shí)只使用at-DR13(EU054930)的序列和其他3組做了分析),與G4-1、G4-2亞組的同源性為97.3% 98.9%(98.1%99.5%)、97.0% 99.0%(98.1% 99.5%),G4組同源性為96.9%100%(96.4%100%),G4-1與G4-2的同源性為96.9%99.1%(96.9%100%)。CH-HZ-11與CH-HZ-11-2毒株序列的同源性為99.6%,2株序列與國(guó)內(nèi)前期毒株CH

15、-S的核苷酸(氨基酸)同源性為98.4%98.5%(99.1%99.6%),與本文中G1組的同源性為95.6% 96.7%(96.0%97.8%)。分析2株序列與韓國(guó)經(jīng)典毒株DR13、歐洲毒株CV777、CV777疫苗株核苷酸(氨基酸 )同源性分別為98.4% 98.5%(99.1%99.6%)、96.7% 96.9%(96.0% 96.4%)、97.6%97.8%。3、討論2006年前,我國(guó)豬場(chǎng)使用CV777的弱毒苗或滅活苗預(yù)防PED,使得PED處于可防控狀態(tài);2006年到2010年間,免疫疫苗的豬場(chǎng)偶爾會(huì)暴發(fā)PED;2010年后,PED在中國(guó)超過10個(gè)省區(qū)流行,甚至用疫苗免疫的豬場(chǎng)也發(fā)病,

16、這引起全國(guó)各地獸醫(yī)學(xué)者的急切關(guān)注。本研究中,采用RT-PCR方法對(duì)浙江某豬場(chǎng)49份樣品的PEDV的ORF3基因進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果有41份樣品為陽性,陽性率為80%。測(cè)序后,選擇2株樣品CH-HZ-11、CH-HZ-11-2的序列登錄到Gen-Bank中,所測(cè)序列包含完整的ORF3基因675bp,編碼224個(gè)氨基酸。每條序列啟動(dòng)子ATG上游均含有46個(gè)核苷酸的基序。文獻(xiàn)報(bào)道這些基序是亞基因組mRNA轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)。本文把CH-HZ-11、CH-HZ-11-2毒株序列 同GenBank中所有ORF3的序列進(jìn)行比對(duì),構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,然后剔除100%同源或同一地區(qū)高度同源的毒株序列,共67條序列進(jìn)行遺傳進(jìn)

17、化分析。此次分組地域性明顯,共分成4組,主要以華南地區(qū)為主的毒株組成G1組;以CV777為代表的歐洲毒株組成G2組;韓國(guó)的DR13、歐洲的CV777毒株的疫苗株組成G3組,其中包括中國(guó)最近分離的1株SD-M,還有2007年分離的CH-GSJ111-07毒株。G4組分為2個(gè)亞組(G4-1,G4-2),G4-1亞組主要以韓國(guó)2003-2009年之間的毒株為主。G4-2亞組以中國(guó)2006-2012年一些毒株為主,也包含了3株韓國(guó)2007年的毒株,其中中國(guó)2006-2008年的毒株自成一簇,而2011年到2012年的毒株自成一簇。由此可以看出,ORF3基因除可以區(qū)分弱毒的疫苗株和強(qiáng)毒株,還可以區(qū)分中國(guó)

18、、歐洲與韓國(guó)等不同國(guó)家的毒株。韓國(guó)學(xué)者Park等報(bào)道通過ORF3基因序列分析,PEDV分成3組(沒有包含中國(guó)新發(fā)的毒株);Pan等報(bào)道了CHGD-01毒株的全基因序列,并根據(jù)ORF3的氨基酸序列進(jìn)行了分析,表明CHGD-01毒株為1個(gè)單獨(dú)的分支,并列為單獨(dú)的一組;Yang等選了15株病毒進(jìn)行分析,分成3組,從進(jìn)化樹上看,CHGD-01毒株單獨(dú)1個(gè)分支,由于兩廣地區(qū)的毒株就僅此一株,被分在和歐洲毒株CV777為1組。而本文中G1組的CHGD-01和其他兩廣地區(qū)(8株)、河北(1株)、浙江(1株)、湖北(1株)的毒株屬于1個(gè)獨(dú)立的分支,與其他3組相比有9個(gè)核苷酸的變異。G1組有很明顯的地域性,主要

19、由兩廣地區(qū)毒株組成,結(jié)合Pan等的報(bào)道,證明華南地區(qū)PEDV毒株基因發(fā)生變異后,遠(yuǎn)離目前內(nèi)地流行的毒株(同源性為95.0%97.2%),成為1個(gè)新的基因型。這個(gè)結(jié)論也得到了全基因序列分析的證實(shí)。Wei等分析廣東毒株GD-1的全基因序列,表明此株病毒與GD-A和AJ1102歸為同一個(gè)組,與疫苗毒株CV777和其他國(guó)外毒株(包括DR13)關(guān)系較遠(yuǎn),成為1個(gè)新的基因型。施標(biāo)等對(duì)2011-2012年國(guó)內(nèi)新流行的毒株的全基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,結(jié)果表明GD-1、GD-A、CHGD-01、AJ1102與ZJCZ4幾個(gè)流行毒株單獨(dú)形成1個(gè)大的分支,自成1組,表明新近流行毒株已成為1個(gè)新的基因型,與國(guó)內(nèi)前期分離

20、毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本文所測(cè)毒株屬于G4-2組,2株序列核苷酸與氨基酸同源性均為99.6%,與國(guó)內(nèi)前期毒株CH-S的同源性高于與G1組的同源性,與CH-S相比有12個(gè)變異位點(diǎn),有了一定的變異,與韓國(guó)毒株親緣關(guān)系較近。相比較歐洲毒株,所有的中國(guó)毒株(G1,G4-2)都和韓國(guó)毒株親緣關(guān)系比較近,在剔除100%同源的序列時(shí),中國(guó)CH-HNHJ-08、CH-JL-08、CH-SHH-06三個(gè)毒株同屬G4-2組且和韓國(guó)的CPF299毒株100%同源,從進(jìn)化樹分支上看,中國(guó)2003-2009年的毒株與韓國(guó)毒株更親近。新近流行的部分毒株與中國(guó)2003-2009年流行的毒株屬于同一組的不同分支,表明新近流行的毒

21、株與2009年以前流行的毒株相比,有了一定的變異和進(jìn)化;另外華南地區(qū)流行的一些毒株已進(jìn)化成為1個(gè)新的基因型。本結(jié)論與PEDVS、M基因的遺傳進(jìn)化分析是一致的。Yang等分析了華中地區(qū)的15株P(guān)EDV的M基因與ORF3基因,結(jié)果這些毒株與2007年后的中國(guó)毒株、泰國(guó)毒株以及韓國(guó)毒株關(guān)系密切,且所分析中國(guó)毒株分屬于不同的亞組,表現(xiàn)出一定的遺傳變異。Li等分析了2011年收集的9個(gè)毒株的S基因序列,結(jié)果有3個(gè)毒株包括本文所用CHGD-01毒株自成1支,其他毒株與國(guó)內(nèi)早期毒株歸為1組。結(jié)合以上S基因及M基因的分析,本文認(rèn)為2011-2012年國(guó)內(nèi)普遍流行于豬場(chǎng)的PEDV毒株有2個(gè)基因型。同一地區(qū)同一年代的毒株經(jīng)過ORF3基因的遺傳進(jìn)化分析后,落入不同的組,如廣東毒株GD-B、廣西毒株CH-GXWP-2011毒株在G4-2組