RNA生物合成轉(zhuǎn)錄

1、RNA生物合成,轉(zhuǎn)錄,目的與要求,1、掌握轉(zhuǎn)錄的概念與特點 2、掌握并能敘述原核生物與真核生物中RNA聚合酶的組成及功能 3、掌握RNA轉(zhuǎn)錄過程 4、掌握mRNA,tRNA與rRNA轉(zhuǎn)錄后加工過程,DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的比較,相 同 點,模 板 兩股鏈均復(fù)制 模板鏈轉(zhuǎn)錄 合成方式 半保留復(fù)制 不對稱轉(zhuǎn)錄 原 料 dNTP NTP 聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 堿基配對 A-T，G-C A-U，T-A，G-C 產(chǎn) 物 半保留的雙鏈DNA 單鏈RNA,不 同 點,以DNA為模板 遵循堿基配對原則 都需依賴DNA的聚合酶 聚合過程都是生成磷酸二酯鍵 新鏈合成方向為53,概 述,一、RNA的生理功能

2、 DNA將攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)到RNA分子中，RNA分子以其信息指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成 二、RNA合成概況 在生物界，RNA合成有兩種方式：一是DNA指導(dǎo)的RNA合成，此為生物體內(nèi)的主要合成方式。另一種是RNA指導(dǎo)的RNA合成，此種方式常見于病毒。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的初級轉(zhuǎn)錄本是RNA前體（RNA precursor），需經(jīng)加工過程（processing）方具有生物學(xué)活性,第二節(jié) 轉(zhuǎn)錄,一、轉(zhuǎn)錄:由DNA指導(dǎo)的RNA合成,DNA以堿基互補原則，決定合成RNA的全部堿基成分及排列順序，將DNA模板上的遺傳信息傳遞到RNA分子的過程 1、反應(yīng)體系：DNA模板,NTP,酶，Mg2+,Mn2+ ，合成方向53。連接方式-

3、 3 , 5磷酸二酯鍵 2、特點：不對稱轉(zhuǎn)錄-DNA片段轉(zhuǎn)錄時，雙鏈DNA中只有一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板，這種轉(zhuǎn)錄方式稱作不對稱轉(zhuǎn)錄,模板鏈及反意義鏈：指導(dǎo)RNA合成的DNA鏈為模板鏈，又稱反意義鏈 編碼鏈及有意義鏈：不作為轉(zhuǎn)錄的另一條DNA鏈為編碼鏈，又稱有意義鏈 由于基因分布于不同的DNA單鏈中，即某條DNA單鏈對某個基因是模板鏈，而對另一個基因則是編碼鏈,5G C A G T A C A T G T C3 3c g t c a t g t a c a g5,DNA,5G C A G U A C A U G U C3,mRNA,N Ala Val His Val C,多肽鏈,轉(zhuǎn)錄,翻譯,編碼鏈

4、,模板鏈,不對稱轉(zhuǎn)錄:模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一單鏈上,3、原料：四種磷酸核苷NTP,DNA中的T在RNA合成中變?yōu)閁 4、合成過程: 連續(xù)，方向：53 5、合成部位：細(xì)胞核內(nèi),二、原核RNA聚合酶,組成：RNA聚合酶由5個亞基構(gòu)成，2為全酶（分子量為480kD ）， 2為核心酶 作用：識別DNA分子中轉(zhuǎn)錄的起始部位。 促進(jìn)與模板鏈結(jié)合，并使DNA雙鏈打開17bp。 催化NTP的聚合，完成一條RNA鏈的聚合反應(yīng)。識別轉(zhuǎn)錄終止信號，停止聚合反應(yīng)，參與轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,核心酶：能與DNA鏈結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄，但沒有特異性，轉(zhuǎn)錄出來的可能不是一個完整的基因序列,決定基因轉(zhuǎn)錄的特異性,亞基,分子量,每分子酶 中所

5、含數(shù)目,功能,36512 2,150618 1,與轉(zhuǎn)錄全過程有關(guān),155613 1,結(jié)合DNA模板,70263 1,辨認(rèn)起始位點,原核RNA聚合酶各個亞基的作用,特 點,1. 聚合速率慢，30-85NTP/秒 2.缺乏外切酶活性,無校對功能，錯誤率10-6 3.不同的因子識別不同的啟動子 4.可被藥物抑制（利福平） 人的RNA聚合酶對利福平不敏感。利用此特點可研制殺菌藥物,三、真核RNA聚合酶,真核較原核的酶復(fù)雜，已清楚的有RNA Pol,及Mt四型 組成和功能：均由多亞基構(gòu)成，聚合酶主要負(fù)責(zé)mRNA的合成； Pol主要負(fù)責(zé)rRNA的合成； Pol主要負(fù)責(zé)tRNA和5srRNA的合成,三種RN

6、A聚合酶對轉(zhuǎn)錄抑制劑鵝膏覃堿的敏感性反應(yīng)不同,種類,對鵝膏覃堿的反應(yīng),耐受,極敏感,中度敏感,四、啟動子與終止子,一）啟動子 1、原核啟動子：約55bp,分為起始點（start site）、結(jié)合部位、識別部位 起始點：轉(zhuǎn)錄起始部位以+1表示，轉(zhuǎn)錄的第1個核苷酸常為嘌呤-G,A 結(jié)合部位：約6bp組成,是高度保守區(qū),共有序列為5-TATAAT-3,位于起始點上游-10。因Tm低,DNA易解開雙鏈，為RNA聚合酶提供場所 識別部位：約6bp組成,在-35處,為高度保守區(qū),序列5-TTGACA-3, s因子識別此部位,-35和-10都是大致位點,啟動子：RNA聚合酶結(jié)合DNA的部位，包括一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控

7、組件,TTGACA盒子,TATA盒子,啟動子區(qū),結(jié)構(gòu)基因,10bp,1,轉(zhuǎn)錄,初級轉(zhuǎn)錄物RNA,35bp,2、真核啟動子結(jié)構(gòu),25處含AT富集區(qū), 共有序列TATAA （TATA box） -70處含共有序列CAAT ,還含許多其它box ,例如:GC-box,E-box等含增強子(enhancer)和靜息子(silencer)RNA pol和 RNA pol與聚合酶所識別的啟動子差異較大,二）終止信號,特點：終止部位含GC富集區(qū)與AT富集區(qū),它們分別形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)和連續(xù)的U區(qū)，以終止轉(zhuǎn)錄 蛋白因子輔助識別終止信號，參與終止,五、轉(zhuǎn)錄過程-轉(zhuǎn)錄起始,1.RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合 （亞基辨認(rèn)-3

8、5區(qū),2.DNA雙鏈的打開RNA pol （全酶移向-10區(qū),3. RNA鏈上合成第一個磷酸二酯鍵,5-pppGpN-OH-3,亞基脫落,轉(zhuǎn)錄過程,二）延長 轉(zhuǎn)錄泡：是由DNA雙鏈,RNA聚合酶與新合成的轉(zhuǎn)錄本RNA局部形成的結(jié)構(gòu),它貫穿于延長過程的始終 過程：在起始階段形成第一個磷酸二酯鍵后，RNA聚合酶核心酶沿模板向下游移動，核苷酸之間以3,5磷酸二酯鍵相連，合成方向53，合成的RNA自3末端逐步延長。合成出的RNA與DNA形成雜交分子,約12bp，因結(jié)合不緊很易脫離,轉(zhuǎn)錄復(fù)合物：酶-DNA-RNA：轉(zhuǎn)錄空泡,三）終止 合成移到終止信號時,酶不滑動,聚合停止,轉(zhuǎn)錄完成 特點：因子參與的終止

9、：r因子與RNA產(chǎn)物中富含C的部位結(jié)合,并誘使RNA聚合酶構(gòu)象改變停止滑動; 因子的解螺旋酶活性,利于RNA產(chǎn)物的釋放,一）原核生物的轉(zhuǎn)錄終止,1. 依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止,2. 不依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止,因子,1. 識別結(jié)合富含C的RNA鏈,功能,2. ATPase活性,3. 解螺旋酶活性,RNA 聚合酶,因子附在RNA鏈上,因子,RNA 鏈形成一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停止，因子利用ATP能滑行,因子發(fā)揮解螺旋酶活性，解開發(fā)夾和RNA-DNA,依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止,不依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止,四 真核生物轉(zhuǎn)錄特點,啟動子復(fù)雜,某些基因不含TATA box，由起動序列參與基本轉(zhuǎn)錄的開始 順式作用元件:真核生物

10、中轉(zhuǎn)錄起始中起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的DNA序列 -35區(qū) 5 -TATA (TATA盒) -70-110區(qū) CAAT盒 GC盒 （真核TATA序列的位置不像原核-35和-10那樣典型，某些真核生物基因也可以沒有TATA序列,轉(zhuǎn)錄因子與反式作用因子,轉(zhuǎn)錄因子與反式作用因子: 調(diào)節(jié)基因表達(dá)的蛋白為轉(zhuǎn)錄因子；它們與特異的順式作用元件相互作用,并激活另一基因的轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物,結(jié)合順序,真核轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止序列，在3端之后有共同序列AATAAA及多個GT序列，mRNA在轉(zhuǎn)錄終止序列處被切斷,AATAAA,GTGTGTG,AAUAAA,GUGUGUG,AAUAAA,GUGUGUG,酶切,加尾信號,GC豐富序列

11、,AATAAA,GTGTGTG,AAUAAA,GUGUGUG,酶切,繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，但5端沒有“帽子”，產(chǎn)物被降解,加尾,轉(zhuǎn)錄后的加工,原核RNA不需加工，邊轉(zhuǎn)錄邊翻譯,真核RNA需要加工,rRNA,tRNA,mRNA,5加帽,3加尾,剪接,在轉(zhuǎn)錄過程中,轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行,第三節(jié) 真核生物轉(zhuǎn)錄后的加工,意義：轉(zhuǎn)錄生成的前體RNA,無生物學(xué)活性,需加工變?yōu)槌墒?、有活性的RNA 加工種類：剪切與剪接、末端添加核苷酸、修飾、RNA編輯,一、mRNA前體的加工,一）生成特點： 原核 ：mRNA是多順反子(polycistronic),每分子RNA中含幾種蛋白質(zhì)信息，RNA壽命短，轉(zhuǎn)錄沒完時翻譯即開始 例:乳糖操縱

12、子，含Z,Y,A三個基因,分別編碼半乳糖苷酶、透過酶及乙?；D(zhuǎn)移酶,真核：單順反子,一個mRNA僅編碼一種蛋白質(zhì) 外顯子: 在真核生物基因中編碼蛋白質(zhì)的序列 內(nèi)含子:非編碼蛋白的序列,因其插于外顯子之間又稱插入序列,居間序列 hnRNA: 為mRNA的前體,轉(zhuǎn)錄物中外顯子與內(nèi)含子間隔排列，需經(jīng)剪接加工后生成mRNA,二） mRNA前體加工過程,真核： 5末端帽子 部位：核內(nèi) 3端多聚A尾 部位：核內(nèi),胞質(zhì)有酶也可進(jìn)行 剪接作用 部位：胞核 甲基化(甲基化發(fā)生在剪接之前,在非編碼區(qū)分子中含1-2個m6A ) RNA編輯(某些mRNA的核苷酸序列,在生成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后還需插入、刪除或取代一些核苷酸殘基

13、,方能生成具有正確翻譯功能的模板,遺傳信息在mRNA水平上的改變過程，稱為RNA編輯,原核：多順反子mRNA在RNase作用下轉(zhuǎn)變?yōu)閱为毜捻樂醋?5加帽,pi,5pppG,磷酸酶,ppi,5pG,pppG,5GpppG,甲基化酶,CH3,mGpppG,O,H,O,H,帽1,帽0,帽2,甲基鳥苷5，5-三磷酸,3加尾,AAUAAA,AAAAAAAAA,加尾,AATAAA,GTGTGTG,AAUAAA,GUGUGUG,AAUAAA,GUGUGUG,酶切,轉(zhuǎn)錄的終止,加尾信號,GC豐富序列,polyA尾（約20200個A,A,A,A,A,A,A,斷裂基因：真核生物的基因由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相隔

14、開但又連續(xù)鑲嵌而成,外顯子（exon): 基因中出現(xiàn)在mRNA的序列,內(nèi)含子（intron）： 基因中不出現(xiàn)于mRNA而被剪接掉的序列,核內(nèi)不均一RNA （hnRNA）：真核生物中編碼蛋白質(zhì)基因的初級轉(zhuǎn)錄本，包括5帽子、3poly(A)尾、外顯子、內(nèi)含子，經(jīng)剪接加工成為mRNA,剪接,剪接:在細(xì)胞核內(nèi), hnRNA剪切掉內(nèi)含子,將多個外顯子連接為成熟mRNA的過程為剪接 例:同一轉(zhuǎn)錄本, 在不同的組織, 因剪接差異產(chǎn)生各自不同的mRNA 剪接的本質(zhì)：磷酸酯鍵的轉(zhuǎn)移 剪接特點 ：剪接部位的結(jié)構(gòu)為內(nèi)含子末端的特定序列，分布在內(nèi)含子的三個部位，5端剪切點為GU;3端剪切點為AG；靠近3端含A序列的分

15、支點,mRNA的剪接： hnRNA被剪接體作用，剪除內(nèi)含子、連接外顯子，產(chǎn)生成熟的mRNA的過程,外顯子,內(nèi)含子,DNA,mRNA,轉(zhuǎn)錄,形成套索RNA，外顯子靠近,剪接體,去除套索RNA，外顯子連接,成熟mRNA,mRNA的剪接,套索結(jié)構(gòu),外顯子,外顯子,內(nèi)含子,內(nèi)含子5端斷開,前一個外顯子的3末端攻擊下后個外顯子的5末端,前后外顯子的連接,二、tRNA前體的加工,1、切除多余的核苷酸：RNase p切除5 端多余的核苷酸；Rnase D切除3端多余的核苷酸 2、剪切內(nèi)含子：核酸內(nèi)切酶切除內(nèi)含子,連接酶進(jìn)行連接 3、修飾與3末端加-CCA: 修飾包括甲基化,脫氨基,還原反應(yīng)等，在核苷酸基轉(zhuǎn)移

16、酶催化下完成3末端添加CCA,tRNA的加工,內(nèi)含子編碼區(qū),內(nèi)切核酸酶,外切核酸酶,5,3,OH 3,DNA,內(nèi)含子,初級轉(zhuǎn)錄物,3端加CCA-OH,3,除去內(nèi)含子 （內(nèi)切酶與連接酶,CCA-OH 3,成熟 tRNA,5,CCA-OH,內(nèi)含子,5和3端的酶切 3加上CCA 去掉內(nèi)含子 特異部位堿基的加工,三、rRNA前體的加工,一）特點： 1、rRNA拷貝多,原核5-10個拷貝;真核:果蠅260個拷貝;Hela細(xì)胞1100個拷貝 2、rRNA基因之間以縱向串聯(lián)的方式重復(fù)排列,二）加工過程,1、剪切作用：需核酸酶參與2、甲基化修飾：修飾在堿基上 3、自我剪接：一種核酶的作用 5S的加工變化不大 原核rRNA加工：rRNA含非轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)，其產(chǎn)物中含tRNA 真核rRNA加工： 1. 5S自成體系加工少無修飾和剪接。2. 45S加工中含剪切和甲