肥大心肌細(xì)胞分析論文_優(yōu)秀論文

1、 肥大心肌細(xì)胞分析論文【摘要】目的：觀(guān)察壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞表面AT1和AT2受體mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化.方法：構(gòu)建壓力超負(fù)荷性心肌肥大模型, 于不同時(shí)間點(diǎn)急性分離心肌細(xì)胞.采用RTPCR法觀(guān)察肥大心肌細(xì)胞中AT1和AT2mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化.結(jié)果：隨著大鼠心肌肥厚程度的逐漸加重, 于術(shù)后4wk起, AT1與AT2mRNA的表達(dá)水平較之假手術(shù)組均逐漸升高, 8wk時(shí)繼續(xù)升高.主動(dòng)脈縮窄12wk組AT1的表達(dá)水平與8wk組無(wú)顯著性差異, 但AT2的表達(dá)水平從0.4380.088進(jìn)一步升高至0.5800.066, 且差異有顯著性（P【關(guān)鍵詞】心肌細(xì)胞受體血管緊張素II1型受體血管緊張素II2

2、型0引言目前已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面主要存在著血管緊張素（Ang）的兩種受體, 即型受體（AT1）及型受體（AT2）.已知AT1介導(dǎo)了幾乎所有Ang的生物學(xué)效應(yīng)1, 而AT2的功能至今尚不完全清楚.目前認(rèn)為, AT2與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、凋亡等生物過(guò)程有關(guān), 且在某些方面具有與AT1相拮抗的作用.AT2可以減輕或逆轉(zhuǎn)心臟纖維化以及血管重塑2, 從而對(duì)抗AT1介導(dǎo)的促纖維化作用；AT2可以引起血管舒張3, 而這也與AT1引起的血管收縮效應(yīng)相反.成年期AT2的表達(dá)水平低下, 在某些病理?xiàng)l件下,AT2及AT1的表達(dá)水平將會(huì)發(fā)生變化.由于這兩型受體可能存在拮抗作用, 因而在不同疾病條件下二者表達(dá)水平的變化將會(huì)對(duì)

3、心臟的功能和結(jié)構(gòu)起重要的調(diào)節(jié)作用.目前, 有關(guān)心肌肥大過(guò)程中心肌細(xì)胞上Ang受體動(dòng)態(tài)變化的報(bào)道不多.我們以壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 觀(guān)察在細(xì)胞肥大過(guò)程中其表面AT1和AT2受體mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及與心肌肥大之間的相互關(guān)系, 以期進(jìn)一步深入理解兩型受體在心肌肥大發(fā)生中的作用及其機(jī)制.1材料和方法1.1材料雄性SD大鼠36只, 體質(zhì)量220250g（西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心).Ang, collagenase, protease及BSA（Sigma公司）.Trizol及Taq酶（Promega公司）, dNTPs及100bpDNALadder（華美生物工程公司）.引物由上?？党缮?/p>

4、技術(shù)有限公司合成.其它試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純.1.2方法1.2.1壓力超負(fù)荷性心肌肥大模型的構(gòu)建將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為2組各18只, 腹主動(dòng)脈縮窄組于左腎動(dòng)脈上方小心分離長(zhǎng)約3mm的腹主動(dòng)脈, 套以?xún)?nèi)徑為0.8mm的銀夾造成縮窄；假手術(shù)組除不以銀夾縮窄腹主動(dòng)脈外, 其余操作同腹主動(dòng)脈縮窄組.術(shù)后分別飼養(yǎng)4wk（6只）、8wk（6只）及12wk（6只）.1.2.2心肌細(xì)胞的分離及心肌肥大指數(shù)測(cè)定采用膠原酶Langendorff法對(duì)心臟進(jìn)行逆行灌流,待灌流結(jié)束首先測(cè)取左心室質(zhì)量(包括左心室游離壁和室間隔), 計(jì)算左心室質(zhì)量與體質(zhì)量比值(LV/BW).而后獲取含有左心室游離壁和室間隔的肥大心肌細(xì)胞.由

5、于心肌細(xì)胞的體積和質(zhì)量較成纖維細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞等大的多, 因而經(jīng)50g溫和離心1min后, 在置換上清液的同時(shí)梯度恢復(fù)溶液中Ca2+的濃度.此過(guò)程重復(fù)34次后, 基本去除所含非心肌細(xì)胞4.提取部分心肌細(xì)胞,使用目鏡測(cè)微尺測(cè)量心肌細(xì)胞橫徑（TDM）.高倍鏡下（1040）隨機(jī)選取20個(gè)視野,計(jì)算其中桿狀心肌細(xì)胞橫徑, 取其均值為該例左心室心肌細(xì)胞橫徑（LVTDM）.1.2.3RTPCR一步法提取細(xì)胞總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, PCR擴(kuò)增.條件為：94變性1min,退火1min.72延伸1min, 共30個(gè)循環(huán), 而后于72再延伸5min.引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度如下所示.actin：正義鏈5CC

6、TGTACGCCAACACAGTGC3, 反義鏈5ATACTCCTGCTTGCTGATCC3, 211bp；AT1：正義鏈5CAGCCGTCATCTACCGAAAC3, 反義鏈5AGGAAAGGGAACACGAAGC3,142bp；AT2：正義鏈5ATCTGGCTGTGGCTGACTT3,反義鏈5AGCATATTTCTCAGGTGGG3, 362bp.以actin作為內(nèi)參照, 用二者凝膠成像后的灰度值與actin相比, 代表其相對(duì)表達(dá)水平.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以xs表示, GraphPadPrism統(tǒng)計(jì)軟件分析, 不同時(shí)間點(diǎn)的LV/BW, LVTDM, AT1和AT2mRNA的表達(dá)變化分析采用雙因

7、素方差分析, 各組間相互比較采用t檢驗(yàn), P2結(jié)果2.1左心室質(zhì)量/體質(zhì)量及心肌細(xì)胞橫徑大鼠腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后4, 8, 12wk時(shí)LV/BW, LVTDM與其同時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組相比均顯著增高(P2.2RTPCR與假手術(shù)組相比, 隨著大鼠心肌肥厚程度的加重, AT1與AT2mRNA的表達(dá)水平于術(shù)后4wk起逐漸升高, 8wk時(shí)繼續(xù)升高.12wk組AT1mRNA的表達(dá)水平(0.5050.059)與8wk組(0.4680.094)比較雖有升高的趨勢(shì), 但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而AT2mRNA的表達(dá)水平從0.4380.088進(jìn)一步升高至0.5800.066, 差異有顯著性.各時(shí)段假手術(shù)組心肌細(xì)胞中AT1與AT2mR

8、NA的表達(dá)水平均無(wú)明顯變化（P0.05, 圖1,2).3討論目前的資料表明, AT2受體的作用較為復(fù)雜有時(shí)甚至是相互矛盾的.研究結(jié)果提示AT2在細(xì)胞和組織中的作用與當(dāng)時(shí)的特定環(huán)境密切相關(guān)5.因此, 分離并觀(guān)察壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞AT1與AT2表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化, 對(duì)于研究其在壓力超負(fù)荷性心肌肥大過(guò)程中的作用是非常必要的.有關(guān)資料顯示：正常成年大鼠心肌細(xì)胞AT2處于較低水平, 心肌肥厚時(shí)AT2表達(dá)增加, AT1表達(dá)增加或降低的幅度趨緩6；心肌梗死后AT2與AT1(主要是AT1)均明顯上調(diào)7.我們的結(jié)果表明：正常情況下, 成年大鼠心肌細(xì)胞上AT1與AT2mRNA均處于較低水平.隨著大鼠心肌肥厚程度

9、的加重, AT1mRNA的表達(dá)水平于術(shù)后4wk起逐漸升高.術(shù)后8wk明顯升高, 在12wk繼續(xù)保持較高水平, 但8wk組與12wk組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.但AT2的表達(dá)水平從4wk起升高, 8wk時(shí)繼續(xù)升高, 而12wk時(shí)進(jìn)一步升高.結(jié)合此階段大鼠心肌細(xì)胞的病理改變主要以肥大為主, 提示此時(shí)AngII可通過(guò)細(xì)胞膜上表達(dá)逐漸上調(diào)的AT1促進(jìn)細(xì)胞的重塑.與表達(dá)上調(diào)并逐漸達(dá)到頂峰的AT1相比, AT2的上調(diào)幅度較大并有繼續(xù)增高的趨勢(shì).但此時(shí)AT2受體將發(fā)揮何種作用, 目前尚無(wú)定論.有研究表明AT2對(duì)肥大的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用.心肌梗死后, 阻斷AT1的同時(shí)活化的AT2在AT1阻斷劑的治療過(guò)程中發(fā)揮著重要

10、作用, 這表明AT1阻斷劑的作用部分是由活化的AT2介導(dǎo)的8；在成年肥大的大鼠心臟中, 抑制AT2將使左室對(duì)AngII的促生長(zhǎng)作用更為敏感9；而過(guò)度表達(dá)AT2將有助于保護(hù)心肌梗死重塑過(guò)程中轉(zhuǎn)基因小鼠的左室功能10.但也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)AT2對(duì)心功能也可有不利影響11-12,從而引起不斷進(jìn)展的泵功能衰竭、心律失常及心臟重塑.有關(guān)AT2在壓力超負(fù)荷性肥大心肌細(xì)胞中的作用, 我們的初步研究結(jié)果表明：在肥大心肌細(xì)胞中, AngII通過(guò)AT2的介導(dǎo)促進(jìn)TNF和IL1的生成及釋放, 說(shuō)明AT2與心肌重構(gòu)過(guò)程中炎癥的發(fā)生有關(guān), 而這可以進(jìn)一步引起心功能的失常和心衰的發(fā)生.總之, 我們的結(jié)果表明：壓力超負(fù)荷性心肌細(xì)

11、胞的肥大過(guò)程伴隨著細(xì)胞表面AT1與AT2表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化.AT2受體表達(dá)程度的增加可能與隨后的心肌改建及心力衰竭的發(fā)生有關(guān).【參考文獻(xiàn)】1RegitzZagrosekV,FielitzJ,FleckE.MyocardialangiotensinreceptorsinhumanheartsJ.BasicResCardiol,1998,93(Suppl2):37-42.2WuL,IwaiM,NakagamiH,etal.EffectofangiotensinIItype1receptorblockadeoncardiacremodelinginangiotensinIItype2receptornu

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