細胞工程疑難解析

1、哈九中生物組 甄靚靚,細胞工程疑難解析,植物細胞工程,胚狀體是在植物細胞、組織或器官體外培養(yǎng)過程中，由一個或一些體細胞經(jīng)過胚胎發(fā)生和發(fā)育過程，形成的與合子胚相類似的結(jié)構(gòu)?？蛇M一步發(fā)育成植株。,1、胚狀體與叢芽的區(qū)別？,叢生芽-由植物器官和愈傷組織發(fā)育出來的群體叢生芽苗，大多是多細胞形成，雙極性，結(jié)構(gòu)完整，去分化容易，再分化中等。,植物細胞工程,脫分化不需要光照。 1.見光的話愈傷組織（高度液泡化薄壁細胞團）會發(fā)育成篩管組織，影響其進一步分化，且易褐化。,2、脫分化過程是否需要光？為什么菊花脫分化需要光？,2.有光時愈傷組織的形成變慢，植物細胞在光照條件下會自發(fā)進行光合作用，光合作用的結(jié)果是生成

2、糖類，但其過程中必然需要分流出一部分物質(zhì)和能量參與進去，從而使完成修復過程的物質(zhì)和能量的總量減少。而且較強光照會使植物自發(fā)分化，減慢脫分化過程。,植物細胞工程,1.同樣作為碳源和能源物質(zhì)，蔗糖較葡萄糖能更好地維持培養(yǎng)基內(nèi)的低滲環(huán)境。配制相同質(zhì)量分數(shù)的培養(yǎng)基，蔗糖形成的滲透壓要明顯低于葡萄糖，若采用葡萄糖作為碳源，易使植物細胞脫水而生長不良。同時，植物細胞吸收蔗糖的速率要明顯慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的滲透壓可較長時間地保持相對穩(wěn)定。,3、植物組織培養(yǎng)基，為何添加的是蔗糖而不是葡萄糖?,2.植物組織培養(yǎng)過程中，要特別注意防止培養(yǎng)基受到微生物的污染。微生物生長所需的碳源最適合的是葡萄糖，而

3、較少利用蔗糖，因此采用蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源，可在一定程度上減少微生物的污染。,3.從能源供應來說，相同物質(zhì)的量濃度下，蔗糖比葡萄糖提供的能量多。,動物細胞工程,早期胚胎培養(yǎng)是一種特殊的動物細胞培養(yǎng)。,1、動物細胞培養(yǎng)、早期胚胎培養(yǎng)的關(guān)系,兩種技術(shù)所用的培養(yǎng)液從成分種類上沒有太大區(qū)別。,但早期胚胎在體外培養(yǎng)過程中，往往會停止在某一階段不再發(fā)育，這種現(xiàn)象稱為發(fā)育阻滯。發(fā)育阻滯是胚胎體外培養(yǎng)中的一個主要障礙，通過改進培養(yǎng)液成分和建立體細胞共同培養(yǎng)體系克服。所以在早期胚胎培養(yǎng)中液要額外添加一些營養(yǎng)物質(zhì)，例如核苷酸，維生素C等。,動物細胞工程,從細胞接種到分離再接種培養(yǎng)的這段時間稱為一代。例如某一細胞系

4、為第40代細胞，表示該細胞系已傳代40次。 細胞的代次與細胞增殖次數(shù)（又叫細胞世代數(shù)）不同，對于傳了“一代”的細胞，在該細胞群體中有的細胞經(jīng)歷了5個細胞世代數(shù)（5次分裂）,2、原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)如何區(qū)分，動物細胞培養(yǎng)中的“一代”的含義？,動物細胞工程,這與病毒的結(jié)構(gòu)有關(guān)，較復雜的病毒外邊還有由脂質(zhì)和糖蛋白構(gòu)成包膜（被摸）。 植物病毒不能介導植物細胞融合的原因，就是絕大部分植物病毒缺少被膜這個結(jié)構(gòu)。所以融合就無從談起了。那少數(shù)有被膜的病毒，又缺乏必需的糖蛋白，目前尚沒有應用成功的先例。 （選修三52頁）,3、植物細胞融合為什么不用滅活病毒作為誘導劑？,動物細胞工程,4、細胞融合過程中PEG的作用

5、,動物細胞工程,注入核常用于胚胎細胞核移植 注入完整的體細胞常用于體細胞核移植,5、核移植時，注入核和完整體細胞的區(qū)別,動物細胞工程,6、單克隆抗體制備過程,獲取B淋巴細胞與骨髓瘤細胞,B淋巴細胞,骨髓瘤細胞,單克隆抗體制備過程,實際操作中B淋巴細胞用的是無菌操作取出小鼠脾臟，剪碎，研磨后獲取的將脾臟細胞懸液。 骨髓瘤細胞采用的是體外培養(yǎng)的對數(shù)生長期細胞或體內(nèi)生長的腫瘤分離骨髓瘤細胞，制備細胞懸液。,細胞融合,分泌抗體 不能無限增殖,不分泌抗體 能無限增殖,B淋巴細胞,骨髓瘤細胞,分泌抗體 能無限增殖,雜交瘤細胞,融合后產(chǎn)生的不同細胞,B淋巴細胞,骨髓瘤細胞,雜交瘤細胞,脾細胞X脾細胞,骨髓瘤

6、細胞X骨髓瘤細胞,脾細胞,骨髓瘤細胞,目標細胞,怎樣篩選？,DNA合成的兩條途徑,堿基和核苷,糖+氨基酸,HGPRT酶 TK酶,（應急途徑）,（主要途徑）,核苷酸,DNA,HAT選擇培養(yǎng)液由黃嘌呤、氨基嘌呤和胸腺嘧啶三種成分組成，三種成分簡稱HAT。氨基嘌呤有阻斷DNA主要合成途徑的作用。,HAT選擇培養(yǎng)液的作用,堿基和核苷,糖+氨基酸,HGPRT酶 TK酶,氨基嘌呤阻斷,（應急途徑）,（主要途徑）,核苷酸,DNA,在HAT培養(yǎng)基中， 用來制備雜交瘤細胞的骨髓瘤 細胞為HGPRT-和TK-細胞。不 含有HGPRT酶和TK酶，失去 了通過應急途徑合成DNA的能 力。 HAT選擇培養(yǎng)液對淋巴細胞無

7、 影響，但淋巴細胞在培養(yǎng)條件 下不能無限增殖。 骨髓瘤細胞和脾細胞融合成的 雜交瘤細胞，繼承了脾細胞合 成HGPRT酶和TK酶的能力。,被淘汰,生長存活,此時篩選出的雜交瘤細胞有多種類型，包括抗體分泌細胞和抗體非分泌細胞，抗體分泌細胞數(shù)量非常少，大約只有1%左右，其中還包括所需要的抗體（特異性抗體）分泌細胞和其它無關(guān)抗體的分泌細胞。 因此，接下來要對抗體（特異性抗體）分泌細胞進行篩選。,經(jīng)過單一抗體篩選出的陽性雜交瘤細胞即可進行克隆化培養(yǎng)，因為如果不進行克隆化，當陽性孔有非抗體分泌型的雜交瘤時，非抗體分泌型的雜交瘤由于生長速度更快，將會占主導生長，最終很難分離出目標雜交瘤以至丟失。另外雜交瘤細胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細胞丟失部分染色體，可能喪失產(chǎn)生抗體