獸醫(yī)分子生物學(xué)復(fù)習(xí)大綱

1、獸醫(yī)分子生物學(xué)復(fù)習(xí)大綱名詞解釋：選10個(gè)，每個(gè)2分反義療法：引入與目的mRNA相補(bǔ)的RNA（反義RNA ），用于阻遏或降低某個(gè)基因的表達(dá)，達(dá)到治療目的。元基因組（Metagenome)：指的是自然環(huán)境中全部微生物的基因組，包含了可培養(yǎng)和未培養(yǎng)的微生物基因組。生物信息學(xué)：對(duì)DNA和蛋白質(zhì)序列資料中各種類型信息進(jìn)行識(shí)別、存儲(chǔ)、分析、模擬和傳輸?shù)目茖W(xué)。PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。Tm：熱變性使DNA分子雙鏈

2、解開所需溫度稱為熔解溫度( melting temperature，簡(jiǎn)寫Tm)。DNA的變性：在理化因素作用下，DNA雙螺旋的兩條互補(bǔ)鏈松散而分開成為單鏈（雙鏈單鏈），從而導(dǎo)致DNA的理化性質(zhì)及生物學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變的現(xiàn)象。退火：熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性,此過程稱之為“ 退火”(annealing)。復(fù)性：指變性DNA 在適當(dāng)條件下，二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象（單鏈雙鏈），它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。分子雜交(簡(jiǎn)稱雜交，hybridization)：是核酸研究中一項(xiàng)最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。其基本原理就是應(yīng)用核酸分子的變性和復(fù)性的性質(zhì)，使來源不同的DNA或RNA片段（標(biāo)記的DN

3、A或RNA分子與待檢測(cè)的靶DNA或RNA 分子），按堿基互補(bǔ)關(guān)系形成雜交雙鏈分子。通過檢測(cè)標(biāo)記分子的標(biāo)記信號(hào)，即可檢測(cè)靶分子的存在。核酸探針（prob）：是指帶有某些標(biāo)記物(如放射性同位素32P，熒光物質(zhì)異硫氰酸熒光素等)的特異性核酸序列片段。在分子雜交中，通過標(biāo)記后與靶分子結(jié)合，并檢測(cè)靶分子的存在?；颍篋NA分子中含有特定遺傳信息的核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位?；蛑负铣捎泄δ艿亩嚯逆溁騌NA所必需的全部核酸序列（通常是DNA序列）。重疊基因：核苷酸序列彼此重疊的2個(gè)基因?yàn)橹丿B基因，或稱嵌套基因。衛(wèi)星DNA(satelliteDNA)：是一類高度重復(fù)序列，這類重復(fù)順序的重復(fù)單位一般由

4、2-10bp組成，成串排列。由于這類序列的堿基組成不同于其他部份（一般富含A/T片斷，浮密度較?。?，可用等密度梯度離心法將其與主體DNA分開，因而稱為衛(wèi)星DNA或隨體DNA?；蚣易?gene family：在真核生物基因組中來源相同、結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)的一組成串排列在一起的基因，稱為基因家族（gene family）。一些基因彼此靠近，成串地排列在一起，這種基因排列結(jié)構(gòu)叫基因簇（gene cluster）。在基因家族結(jié)構(gòu)中經(jīng)常會(huì)看到基因簇結(jié)構(gòu)。管家基因（housekeeping gene）-在一個(gè)生物個(gè)體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的基因。奢侈基因（luxury gene）只在特定的細(xì)胞類型中表

5、達(dá)的基因。組成性基因表達(dá)：無論表達(dá)水平高低，管家基因較少受環(huán)境因素影響，而是在個(gè)體各個(gè)生長階段的大多數(shù)或幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)，或變化很小。區(qū)別于其他基因，這類基因表達(dá)被視為組成性基因表達(dá)(constitutive gene expression)。可誘導(dǎo)基因：在特定環(huán)境信號(hào)刺激下，相應(yīng)的基因被激活，基因表達(dá)產(chǎn)物增加，這種基因稱為可誘導(dǎo)基因?？勺瓒艋颍喝绻?qū)Νh(huán)境信號(hào)應(yīng)答是被抑制，這種基因是可阻遏基因。協(xié)調(diào)表達(dá)：在一定機(jī)制控制下，功能上相關(guān)的一組基因，無論其為何種表達(dá)方式，均需協(xié)調(diào)一致、共同表達(dá)，即為協(xié)調(diào)表達(dá)(coordinate expression)，這種調(diào)節(jié)稱為協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)(coordi

6、nate regulation)。弱化子：在操縱區(qū)與結(jié)構(gòu)基因之間的一段可以終止轉(zhuǎn)錄作用的核苷酸序列，稱為弱化子。增色效應(yīng)或高色效應(yīng)(hyperchromic effect)：指變性后DNA 溶液的紫外吸收作用增強(qiáng)的效應(yīng)。外顯子extron：成熟的mRNA或蛋白質(zhì)中存在的序列。（在DNA或mRNA中都存在的序列）內(nèi)含子intron：在DNA上存在，而在mRNA（或cDNA）中不存在的序列，初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加工成成熟mRNA時(shí)被切除的間隔序列。轉(zhuǎn)位因子：能夠進(jìn)行復(fù)制并將一個(gè)拷貝插入新位點(diǎn)的DNA序列。（能在基因組中移動(dòng)的DNA序列叫轉(zhuǎn)位因子），由于它可以從染色體基因組上的一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置,甚至

7、在不同的染色體之間躍遷所以又稱跳躍基因（jump-gene）。操縱子（operon）：原核生物中幾個(gè)功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因成簇串聯(lián)排列組成的一個(gè)基因表達(dá)的協(xié)同單位（DNA序列）。操縱子是一種完整的具有特定功能的細(xì)菌基因表達(dá)和調(diào)節(jié)的單位，包括結(jié)構(gòu)基因，啟動(dòng)序列，操縱序列，調(diào)節(jié)基因，組成一個(gè)控制單元。感受態(tài)細(xì)胞：指容易接受外源DNA進(jìn)入，從而獲的特異生物學(xué)性狀的細(xì)胞。融合基因：通常是指通過自發(fā)突變事件形成的、或是應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建的、一類具有來自兩個(gè)或兩個(gè)以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。融合蛋白質(zhì)：由克隆在一起的兩個(gè)或數(shù)個(gè)不同基因的編碼序列組成的融合基因，轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生的單一的多肽序列。它們的功能往

8、往是異常的，或者是已經(jīng)發(fā)生了變化。單順反子（monocistron）：即一個(gè)基因編碼一條多肽鏈或RNA鏈，每個(gè)基因轉(zhuǎn)錄有各自的調(diào)節(jié)元件，一個(gè)啟動(dòng)子后僅具有一個(gè)編碼序列。 多順反子mRNA:在原核細(xì)胞中，通常是幾種不同的mRNA連在一起，相互之問由一段短的不編碼蛋白質(zhì)的間隔序列所隔開，這種mRNA叫做多順反子mRNA?？删幋a兩條或兩條以上蛋白質(zhì)分子的mRNA的分子。轉(zhuǎn)化：質(zhì)?；蚱渌蚬こ梯d體進(jìn)入原核宿主細(xì)胞的過程。單位限制性內(nèi)切酶：在最佳緩沖系統(tǒng)和20l體積中反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1gDNA所需的限制性內(nèi)切酶量。 質(zhì)粒(Plasmids)：是存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制的共價(jià)、封閉、

9、環(huán)狀雙鏈DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA），并不是細(xì)菌生長所必需的，但可以賦予細(xì)菌某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力。載體：外源DNA片段要進(jìn)入細(xì)胞(受體細(xì)胞)，并在其中進(jìn)行復(fù)制與表達(dá)，必須有一個(gè)適當(dāng)?shù)倪\(yùn)載工具將其帶入細(xì)胞內(nèi)并載著外源DNA一起進(jìn)行復(fù)制與表達(dá)。這種運(yùn)載工具稱為載體(vector)。肽核酸(PNA, peptide nucleic acid)：90年代丹麥科學(xué)家發(fā)明的一種全新的DNA類似物，以N-(2-氨基乙基)甘氨酸肽鍵取代了DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，能特異性地識(shí)別與DNA、RNA所形成的雜交體。限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分

10、析（RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms）：每一限制性核酸內(nèi)切酶在切割DNA分子時(shí)都有固定的切點(diǎn)序列，DNA分子中核苷酸排列順序的變化有可能使該切點(diǎn)丟失或增加。由于不同生物群體的DNA序列千差萬別，因而用同一限制性內(nèi)切酶消化后，所得DNA片段的長度分布也是千變?nèi)f化的。因此，其可用于臨床遺傳性疾病的基因診斷、生物群體的遺傳分析。單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCPSingle strand conformation polymorphism）：?jiǎn)捂淒NA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對(duì)等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當(dāng)有一個(gè)

11、堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或多或 少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中遷移率不同。問答題（選8個(gè)題，取其中的6個(gè)回答，共50-60分）1、分子生物學(xué)的基本含義與基本原理是什么？（一）分子生物學(xué)是研究生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的一門學(xué)科，即從分子水平闡明生命現(xiàn)象和生物學(xué)規(guī)律的科學(xué)。廣義的講，一切從分子水平研究生命奧秘的研究工作都是分子生物學(xué)。（二）分子生物學(xué)的基本原理分子生物學(xué)的三大原則：第一：構(gòu)成生物體的有機(jī)大分子的單體在不同生物體內(nèi)都是相同的：共同的核酸語言，共同的蛋白質(zhì)語言。第二：生物體內(nèi)一切有機(jī)大分子的構(gòu)建都遵循共同的規(guī)律；或者說：生物遺傳信息表達(dá)的中心

12、法則相同。第三：某一特定生物體所擁有的核酸及蛋白質(zhì)決定了生物的屬性。生物大分子單體的排列（核苷酸、氨基酸）是不同的。2、DNA的變性的含義是什么，變性會(huì)引起DNA哪些理化性質(zhì)的變化？（一）概念：在理化因素作用下，DNA雙螺旋的兩條互補(bǔ)鏈松散而分開成為單鏈（雙鏈單鏈），從而導(dǎo)致DNA的理化性質(zhì)及生物學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變的現(xiàn)象。（二）理化性質(zhì)的變化（1）溶液粘度降低 n DNA雙螺旋是緊密的“剛性”結(jié)構(gòu)，變性后代之以“柔軟”而松散的無規(guī)則單股線性結(jié)構(gòu)，DNA粘度因此而明顯下降。（2）沉降速度變慢；由于變?yōu)閱捂満?，密度下降，?dǎo)致沉降速度變慢。（3）溶液旋光性發(fā)生改變 變性后整個(gè)DNA分子的對(duì)稱性及分子局部

13、的構(gòu)性改變，使DNA溶液的旋光性發(fā)生變化。 （4）增色效應(yīng)或高色效應(yīng) 原因：DNA分子具有吸收250280nm波長的紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。DNA分子中堿基間電子的相互作用是紫外吸收的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，但雙螺旋結(jié)構(gòu)有序堆積的堿基又“束縛”了這種作用。變性DNA 的雙鏈解開，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產(chǎn)生增色效應(yīng)。 3、影響DNA變性的因素有哪些？ （1） 溫度：溫度越高，越有利于核酸變性。（2）堿基組成G/C含量越高，變性溫度越高。均質(zhì)DNA變性溫度范圍小，異質(zhì)DNA變性溫度范圍大 。 （3）離子強(qiáng)度：高鹽利于穩(wěn)定，低鹽利于變性。離子強(qiáng)度高，Tm值高，變性溫度范圍較窄；離

14、子強(qiáng)度低，Tm值低，變性溫度范圍較寬。（4）強(qiáng)酸強(qiáng)堿：極端的pH有利于核酸變性。（5）變性劑：變性劑如甲醇、乙醇、甲酰胺、尿素、甲醛等破壞氫鍵，妨礙堿基堆積，破壞雙螺旋結(jié)構(gòu)引起核酸分子變性，使Tm下降。（6）DNA的長度DNA長度越大，變性時(shí)需要持續(xù)的時(shí)間越長。4、簡(jiǎn)述病毒基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。1.基因組較小，大小差異較大；2.化學(xué)組成多樣DNA病毒、RNA病毒；單鏈、雙鏈；線狀、環(huán)狀；分節(jié)段、不分節(jié)段。3.基因重疊現(xiàn)象普遍存在實(shí)質(zhì)：兩個(gè)基因雖共用一段核苷酸序列，但其讀碼結(jié)構(gòu)互不相同，編碼不同的蛋白質(zhì)。意義：使DNA的利用率提高，是基因表達(dá)調(diào)控的方式之一。4.結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)練大部分可編碼蛋白質(zhì),只有非常小

15、的一部份不編碼蛋白質(zhì)(通常是基因表達(dá)的控制序列）（非編碼序列較少）；5. 基因組中功能基因叢集成一個(gè)或幾個(gè)特定區(qū)域，形成一個(gè)功能單位或轉(zhuǎn)錄單元，即形成多順反子結(jié)構(gòu)。6. 除反轉(zhuǎn)錄病毒外，病毒基因組只有一個(gè)拷貝；7.有的病毒基因組中具有宿主細(xì)胞基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。5、細(xì)菌基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有哪些？1. 擬核（類核）結(jié)構(gòu)；2. 存在多順反子結(jié)構(gòu)；3. 除RNA基因外，基本是單拷貝的：利于核糖體的快速組裝，短時(shí)間內(nèi)合成大量核糖體。4. 非編碼序列相對(duì)較少；（相對(duì)于真核生物）5. 基因多是連續(xù)的；6. 存在不同的功能識(shí)別區(qū)：復(fù)制起始區(qū)、復(fù)制終止區(qū)等。6、真核生物核基因組特點(diǎn)有哪些？1. 基因組較大；低等真

16、核生物：107-108 bp，較原核生物大10倍；高等真核生物：5X108-1010 bp，某些植物和兩棲生物可達(dá)1011 bp；哺乳類生物大于2X109它們可編碼100萬個(gè)基因。2. 真核生物核DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成核小體，再纏繞成染色質(zhì)（染色體）；3. 基因組一般為雙倍體（diploid）；4. 基因?yàn)閱雾樂醋印?單順反子：一個(gè)基因單獨(dú)轉(zhuǎn)錄，一個(gè)基因一條mRNA，翻譯成一條多肽鏈；5. 存在大量重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)可高達(dá)百萬倍；6. 基因組中非編碼序列多于編碼序列，有大量的冗余DNA；7. 大部分基因有內(nèi)含子，因此基因不連續(xù)；8. 具有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，而每個(gè)復(fù)制子的長度較小。7、基因內(nèi)含子的

17、特點(diǎn)有哪些？1. 內(nèi)含子是真核生物獨(dú)有的，但并不是所有真核基因一定有內(nèi)含子；（組蛋白基因家族）2. 內(nèi)含子的數(shù)量和長度對(duì)不同的基因不同，一般基因越長，內(nèi)含子越多；3. 在同一基因家族中，編碼序列在進(jìn)化過程中一直比較保守，而內(nèi)含子變化迅速，差異較大；（內(nèi)含子變異較外顯子大） 4. 內(nèi)含子與外顯子間的連接處有特殊的序列（序列GTAG）。5. 一個(gè)基因的內(nèi)含子可以是另一個(gè)基因的外顯子。 （閱讀框和剪切方式不同）8、DNA克隆用載體必須具備哪些條件？ 在受體細(xì)胞中，載體可以獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制。（拷貝數(shù)越高越好）所以，載體本身必須是一個(gè)復(fù)制單位，稱復(fù)制子(replicon)，具有復(fù)制起點(diǎn)。而且插入外源DNA

18、后不會(huì)影響載體本身復(fù)制的能力。 具有合適的選擇性標(biāo)記，易于鑒定、篩選。也就是說，容易將帶有外源DNA的重組體與不帶外源DNA的載體區(qū)別開來。 易于引入受體細(xì)胞，具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性 。在原核生物的DNA重組中常用的載體是質(zhì)粒和噬菌體。酵母和動(dòng)物病毒等常用作真核生物克隆的載體。從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。具有多種單一的酶切位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)，MCS），便于基因工程操作。長度盡可能小，載裝能力強(qiáng)，便于運(yùn)載大的外源基因。9、質(zhì)粒的基本特性有哪些？ （一）自主復(fù)制性 質(zhì)粒DNA攜帶有自己的復(fù)制起始區(qū)（ori）以及一個(gè)控制質(zhì)?？截悢?shù)的基因，因此它能

19、獨(dú)立于宿主細(xì)胞的染色體DNA而自主復(fù)制。不同的質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)也不同，少則幾個(gè)多則幾百個(gè)不等，當(dāng)然由于質(zhì)粒上并沒有復(fù)制酶的基因，所以其復(fù)制需要使用宿主細(xì)胞復(fù)制染色體DNA的多種酶群。 （二）不相容性 利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被導(dǎo)入同一細(xì)胞中，它們?cè)趶?fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過程中，就會(huì)彼此競(jìng)爭(zhēng)，它們?cè)趩渭?xì)胞中的拷貝數(shù)也會(huì)有差異，拷貝多的復(fù)制更快，結(jié)果在細(xì)菌繁殖幾代之后，細(xì)菌的子細(xì)胞中絕大多數(shù)都含有占優(yōu)勢(shì)的質(zhì)粒，因而這兩種質(zhì)粒中只能有一種長期穩(wěn)定地留在細(xì)胞中，這就是所謂的質(zhì)粒不相容性。 （三）可擴(kuò)增性 質(zhì)粒能自主地進(jìn)行復(fù)制，這樣它才能隨著細(xì)菌細(xì)胞的

20、分裂而穩(wěn)定地遺傳。 質(zhì)粒就其復(fù)制方式而言分為兩類：松弛型復(fù)制及嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制。松弛型復(fù)制：拷貝數(shù)高，一個(gè)細(xì)胞中可達(dá)上千個(gè)拷貝；嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制：拷貝數(shù)低，一個(gè)細(xì)胞中一般低于5個(gè)拷貝（1個(gè)幾個(gè)）。（四）可轉(zhuǎn)移性 在天然條件下，很多天然質(zhì)粒都可以通過細(xì)菌接合作用從一種宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種宿主內(nèi)，這種轉(zhuǎn)移依賴于質(zhì)粒上的tra基因產(chǎn)物。10、轉(zhuǎn)化的基本原理是什么？為了提高轉(zhuǎn)化效率，實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素？（一）轉(zhuǎn)化原理：細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。其原理是細(xì)菌處于0，CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成

21、抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時(shí)間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。（二）為了提高轉(zhuǎn)化效率，實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素：1. 細(xì)胞生長狀態(tài)和密度 ：不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于的培養(yǎng)菌，最好從-70或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期時(shí)為好，可通過監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5菌株的OD600 為0.5時(shí)，細(xì)胞密度在5107 個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。 2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度:用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源D

22、NA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1ng的cccDNA即可使50l 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5。 3. 試劑的質(zhì)量:所用的試劑，如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。 4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。

23、11、大腸桿菌表達(dá)體系的優(yōu)越性：1. 對(duì)大腸桿菌的背景知識(shí)，特別是基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理有深刻的了解；2. 是一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體；3. 許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效、高水平的表達(dá)；4. 大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，易用于批量生產(chǎn)。12、大腸桿菌中表達(dá)真核生物的蛋白質(zhì)時(shí)存在哪些不足？1、真核基因在大腸桿菌中很難表達(dá)出天然蛋白質(zhì)。1） E. coli不能加工成正確的重組蛋白。細(xì)菌和高等生物的加工過程是不同的。特別是一些動(dòng)物的蛋白要進(jìn)行糖基化。糖基化在E. coli中是非常罕見的，在E. coli中合成的蛋白不能正確的糖基

24、化。2） E. coli不能正確的折疊蛋白，形成無活性蛋白。如果蛋白不能進(jìn)行正確的折疊，其三級(jí)結(jié)構(gòu)往往是不溶的，在細(xì)菌中形成包涵體。這樣在細(xì)菌中提取蛋白不存在問題，但將蛋白轉(zhuǎn)化為正確的折疊方式是比較困難的甚至是不可能的。 2、 E. coli可能降解重組蛋白。細(xì)菌的蛋白酶，能夠識(shí)別外來的真核基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，并把它們降解掉。重組蛋白降解的問題可以使用一個(gè)或多個(gè)蛋白酶突變E. coli來解決。 3、真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)受限1）真核基因可能含有內(nèi)元，E. coli缺乏切除內(nèi)元的機(jī)制。2）真核基因的轉(zhuǎn)錄信號(hào)同原核的不同。 細(xì)菌的RNA聚合酶不能識(shí)別真核的啟動(dòng)子；外源基因可能含有具大腸桿菌

25、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)功能的核苷酸序列。3）基因的密碼子可能不適合于E. coli中翻譯?？傮w上講，所有的生物都共用相同的密碼子，但每一種生物都有偏愛的密碼子，表現(xiàn)在tRNA識(shí)別不同密碼子的效率不同。 4）真核基因mRNA的分子結(jié)構(gòu)同細(xì)菌的有所差異，影響真核基因mRNA穩(wěn)定性。13、外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)部位有哪些？表達(dá)蛋白形成包涵體后有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？表達(dá)部位有： 細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)；周質(zhì)中表達(dá)；胞外表達(dá)。形成包涵體的優(yōu)點(diǎn)： a. 蛋白質(zhì)易于以高純度和高濃度方式分離； b. 蛋白質(zhì)受保護(hù)而免受胞內(nèi)酶的降解作用； c. 蛋白質(zhì)沒有活性，因此不會(huì)使寄主細(xì)胞受傷害。形成包涵體的缺點(diǎn)：a. 蛋白質(zhì)折疊了，再折

26、疊的蛋白質(zhì)可能無法恢復(fù)其生物學(xué)活性； b. 蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量偏低； c. 蛋白質(zhì)的生產(chǎn)成本比較昂貴。14、影響克隆基因在大腸桿菌中的表達(dá)效率因素有哪些？1. 5-UTR對(duì)克隆基因表達(dá)效率的影響a. 啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響 大腸桿菌啟動(dòng)子的保守序35區(qū)（5TTGACA）和10(5TATAAT)區(qū);它們之間的距離(17bp)。b. 啟動(dòng)子與克隆基因的間隔距離對(duì)表達(dá)效率的影響 當(dāng)mRNA分子5末端與SD序列之間的長度小于15bp時(shí)，轉(zhuǎn)譯效率下降。2. 質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性對(duì)基因表達(dá)效率的影響 a. 質(zhì)粒載體點(diǎn)的拷貝數(shù)對(duì)表達(dá)效率的影響； b. 質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響；3.mRNA轉(zhuǎn)錄本的

27、分子特性對(duì)基因表達(dá)效率的影響 a. 轉(zhuǎn)譯起始序列對(duì)表達(dá)效率的影響 b. mRNA的穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響4.遺傳密碼子的使用對(duì)基因表達(dá)效率的影響a. 密碼子使用的偏愛性現(xiàn)象的規(guī)律性幾乎在所有的簡(jiǎn)并密碼子家族中，都有一個(gè)或兩個(gè)是優(yōu)先使用的偏愛性密碼子；高表達(dá)活性的基因比低表達(dá)活性的基因，呈現(xiàn)出較高程度的密碼子偏愛性。b.密碼子使用偏愛性對(duì)基因表達(dá)效率的影響 富含大腸桿菌罕用密碼子的外源真核基因，很難在大腸桿菌轉(zhuǎn)化子細(xì)胞中得到有效的表達(dá)。5. 寄主細(xì)胞的生理狀態(tài)對(duì)基因表達(dá)效率的影響培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的選擇、細(xì)胞培養(yǎng)方式、培養(yǎng)溫度等環(huán)境因素能影響大腸桿菌生理狀態(tài)。15、人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能及用途分為

28、哪幾類？1.多拷貝質(zhì)粒 復(fù)制子經(jīng)過人工突變，除去控制拷貝數(shù)負(fù)調(diào)節(jié)基因，使質(zhì)粒拷貝數(shù)達(dá)到每個(gè)細(xì)胞數(shù)千，用于擴(kuò)增外源基因。實(shí)驗(yàn)室常用質(zhì)粒均屬于此。 2.測(cè)序質(zhì)粒PCR產(chǎn)物直接用于克隆測(cè)序的載體，稱為T載體。3.整合質(zhì)粒 裝有整合促進(jìn)基因及整合特異序列，便于外源基因準(zhǔn)確重組整合入受體細(xì)胞的染色體上 。4.穿梭質(zhì)粒含有原核和真核兩個(gè)不同的復(fù)制子，能在原核和真核兩種不同的受體細(xì)胞中復(fù)制。 5.表達(dá)質(zhì)粒裝有強(qiáng)的啟動(dòng)基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)。6.探針質(zhì)粒篩選克隆或?qū)ふ一蛟?，通常裝有一個(gè)可以定量測(cè)定其表達(dá)的標(biāo)記基因，如抗性基因。篩選啟動(dòng)基因、終止子等。 7、

29、細(xì)菌人工染色體質(zhì)粒細(xì)菌人工染色體質(zhì)粒是一個(gè)能插入更長的DNA片段的質(zhì)粒，簡(jiǎn)稱BACs(bacterial artificial chromosomes)。16、基因表達(dá)調(diào)控的四個(gè)基本的調(diào)控點(diǎn)是什么？（1）基因結(jié)構(gòu)的活化。DNA暴露堿基后RNA聚合酶才能有效結(jié)合。（2）轉(zhuǎn)錄起始。最有效的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)，通過DNA元件與調(diào)控蛋白相互作用來調(diào)控基因表達(dá)。（3）轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運(yùn)。RNA編輯、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)。（4）翻譯及翻譯后加工。翻譯水平可通過特異的蛋白因子阻斷mRNA翻譯翻譯后對(duì)蛋白的加工、修飾也是基本調(diào)控環(huán)節(jié)。17、常見的幾種核酸雜交方法有哪幾種，分別有哪些應(yīng)用？1. Southern 雜交：DNADNA

30、檢測(cè)信息：用于檢測(cè)基因組DNA。（DNA水平）例如：轉(zhuǎn)基因后目的基因是否轉(zhuǎn)入；是否存在靶分子；是否有突變。2. Northern 雜交：DNA/RNARNA 檢測(cè)信息：基因在mRNA水平上有無表達(dá)；表達(dá)強(qiáng)弱；分子大小。3.Western 雜交 （ProteinProtein）檢測(cè)信息：基因在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)（有無、強(qiáng)弱）；蛋白質(zhì)的分子量（大小）。4.斑點(diǎn)雜交 Dot-blodingDNA：不同物種、不同個(gè)體間的比較；RNA：表達(dá)的強(qiáng)弱。5. 原位菌落雜交主要用于文庫篩選，尋找目的基因。6.原位組織雜交檢測(cè)樣本中有無某種病原微生物；可檢測(cè)基因在不同時(shí)期、不同組織、不同部位的表達(dá)情況基因表達(dá)的組

31、織、細(xì)胞特異性。7.基因芯片技術(shù) 是指將大量探針分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過雜交信號(hào)的強(qiáng)弱判斷靶分子的數(shù)量。用該技術(shù)可將大量的探針同時(shí)固定于支持物上，所以一次可對(duì)大量核酸分子進(jìn)行檢測(cè)分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、檢測(cè)目的分子數(shù)量少、效率低等不足。它能在同一時(shí)間內(nèi)分析大量的基因，使人們準(zhǔn)確高效地破譯遺傳密碼。18、PCR反應(yīng)的基本步驟：第一步變性(denaturation) ：通過加熱使模板DNA的雙鏈之間的氫鍵斷裂，雙鏈分開而成單鏈的過程。第二步 退火(annealling)：當(dāng)溫度降低時(shí)，引物與模板DNA中互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合成雜交分子，引物附著到模板DNA兩側(cè)；第三步 延伸(extension)：在dNTPs、 Mg2+存在下， DNA聚合酶在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溫度下催化引物按53方向延伸，促使核苷酸依次按與模板堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在引物3端一個(gè)個(gè)地連接上去，合成出與模板DNA鏈互補(bǔ)的DNA子鏈。 以上述三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物均可作為下一個(gè)循環(huán)的模板，經(jīng)過n次循環(huán)后，目的DNA以2n的形式增加。19、簡(jiǎn)述PCR技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用1.遺傳性疾病的基因診斷2.傳染病的診斷(肝炎病毒)3.癌基因檢測(cè)4.法醫(yī)學(xué)(親子鑒定)上的應(yīng)用5.DNA測(cè)序6.基因克隆7.引