石蠟切片和冷凍切片

1、石蠟切片和冷凍切片傻傻分不清楚系列在組織實(shí)驗(yàn)中，組織切片和冷凍切片是最常見(jiàn)的兩種切片方法，兩種優(yōu)缺點(diǎn)明顯，在實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用上也大有不同。而兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的相同點(diǎn)都是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量的研究。一、 石蠟切片組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中最為廣泛應(yīng)用的方法。石蠟切片不僅用于觀(guān)察正常細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也是病理學(xué)和法醫(yī)學(xué)等學(xué)科用以研究、觀(guān)察及判斷細(xì)胞組織的形態(tài)變化的主要方法，而且也已相當(dāng)廣泛地用于其他許多學(xué)科領(lǐng)域的研究中。1、 固定：將新鮮組織切成小塊，固定于4%多聚甲醛過(guò)夜。凝固組織中的物質(zhì)成分，盡可能

2、保持其活體時(shí)的結(jié)構(gòu)。同時(shí)能使組織硬化，有利于切片的進(jìn)行。2、脫水：為了減少組織材料的急劇收縮，應(yīng)使用從低濃度到高濃度遞增的順序進(jìn)行經(jīng)70%、85%、95%直至純酒精（無(wú)水乙醇），每次時(shí)間為1小時(shí)。固定后的組織材料需除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀，否則會(huì)影響后期的染色效果。3、透明：常用的透明劑有二甲苯，二甲苯是石蠟的溶劑。純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的溶劑，替換出組織內(nèi)的酒精。材料塊在透明劑浸漬過(guò)程稱(chēng)透明。4、浸蠟：先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1小時(shí)。先后移入2個(gè)熔化的石蠟液中浸漬1小時(shí)左右。5、包埋：以少許熱蠟液將其底部迅速貼附于包埋盒內(nèi)上，然后

3、置于速凍臺(tái)，讓石蠟固定。6、切片：切片刀的銳利與否、蠟塊硬度是否適當(dāng)都直接影響切片質(zhì)量，可將蠟塊至于冷水中改變蠟塊硬度。通常切片厚度為5微米，用毛筆輕托輕放在37度水浴中展片。7、貼片與烤片：將水浴中展片撈至玻片上鋪正，然后將載玻片放入37溫箱中干燥。8、切片脫蠟及水化：干燥后的切片置于二甲苯中進(jìn)行脫蠟，然后依次使用從高濃度到低濃度遞減的順序進(jìn)行經(jīng)純酒精、95%、85%、70%進(jìn)行水化。9、染色：經(jīng)典的蘇木精和伊紅：細(xì)胞核被蘇木精染成紫藍(lán)色，多數(shù)細(xì)胞質(zhì)及非細(xì)胞成分被伊紅染成粉紅色。實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單。免疫組化：指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)。二、 冰凍切

4、片：冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷凍到一定的硬度，然后進(jìn)行切片的一種方法。制作過(guò)程較石蠟切片快捷、簡(jiǎn)便，因多應(yīng)用于手術(shù)中的快速病理診斷。一、取材：應(yīng)盡可能快地采取新鮮的材料，防止組織發(fā)生死后變化。二、速凍：1、將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm）。2、如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒(méi)組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)。3、當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開(kāi)始?xì)饣序v，此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。4、在制成凍塊后，即可置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。5、若需要保存，應(yīng)快速以鋁箔或塑料薄膜封包，立即置入-80冰箱貯存?zhèn)溆?。三、固定?、樣品

5、托上涂一層OCT包埋膠，將速凍組織置于其上，4冰箱預(yù)冷5-10min讓OCT膠浸透組織。2、取下組織置于錫箔或者玻片上，樣品托速凍。3、組織置于樣品托上，其上再添一層OCT膠，以完全覆蓋為宜，速凍架（PE）上30min。四，切片：1、恒溫冰凍切片機(jī)為較理想的冰凍切片機(jī)，其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī)置于低溫密閉室內(nèi)，故切片時(shí)不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至5-10m。2、切片時(shí)，低溫室內(nèi)溫度以-15 -20為宜，溫度過(guò)低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動(dòng)。3、切好室溫放置30min后，入4丙酮固定5-10min，烘箱干燥20min。PBS洗5min3。4、進(jìn)行抗

6、原熱修復(fù)，微波熱修復(fù)也可，室溫自然冷卻?？捎?%H2O2孵育5-10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。五、免疫熒光染色：1、冰凍切片室溫晾干15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1小時(shí)（此步可不洗）。2、滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液（抗體的量視組織大小而定，原則是可以均勻覆蓋組織面，且保證整個(gè)過(guò)程中不會(huì)使組織干涸）。3、將切片放在加了PBS的免疫組化濕盒，室溫孵育2小時(shí)或4過(guò)夜。4、第二天先將濕盒放到37回溫1h，然后吸取片上的一抗進(jìn)行回收，將切片插入到小染缸PBS沖洗。5、滴加用PBS稀釋好的二抗（避光）置于分子雜交箱中37孵育1小時(shí)?；厥斩梗衅糜谌靖變?nèi)，PBS洗5min3次。6、滴加DAPI工作液染核，室溫10-20min（工作濃度0.1%染色15min）。7、回收DAPI，滴加5-10l抗熒光衰減封片劑或中性樹(shù)膠，用處理干凈的蓋玻片封片，即可到熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀(guān)察拍照。8、做好的切片放在切片盒內(nèi)，置于4冰箱，可保存一周左右。對(duì)比：石蠟切片冷凍切片應(yīng)用對(duì)象廣泛應(yīng)用常規(guī)制片手術(shù)中的快速病理診斷保持時(shí)間持久保存保存時(shí)間較短優(yōu)點(diǎn)1、 細(xì)胞定位準(zhǔn)確2、 組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)保存完好，3、 保存時(shí)可放在室溫下保存1、