急性毒性及其評價方法；

1、急性毒性及其評價方法,acute toxicity testing,一、急性毒性的概念,急性毒性：是指機體(人或?qū)嶒瀯游?一次或24小時內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物后在短期內(nèi)所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。 包括外觀改變、大體形態(tài)變化、行為方式及死亡效應(yīng)，最主要觀察指標是ld50,實驗動物接觸化學(xué)物的方式或途徑不同， “一次”的含義也有所不同 經(jīng)口和注射接觸，“一次”是指在瞬間將受試化學(xué)物輸入實驗動物體內(nèi) 經(jīng)呼吸道吸入與經(jīng)皮膚接觸，“一次” 是指在一個特定的期間內(nèi)實驗動物持續(xù)地接觸受試化學(xué)物的過程,二 、急性毒性試驗的目的,1. 測試和求出受試化學(xué)物的致死劑量 (通常以ld 50 為主要參數(shù))，并對該外源化學(xué)物進行

2、急性毒性分級 2. 通過觀察動物中毒作用表現(xiàn)、毒作用強 度和死亡情況，初步評價毒物對機體的毒效應(yīng)特征、靶器官、劑量反應(yīng)關(guān)系和對人體產(chǎn)生損害的危險性,3. 為亞慢性及慢性毒性試驗研究以及其他 毒理試驗提供接觸劑量和觀察指標選擇的依據(jù) 4. 為毒作用機理研究提供線索，了解中毒 效應(yīng)的特征（包括癥狀，生理、生化與組織病理損傷） 5. 研究化學(xué)物急性中毒診斷、預(yù)防和急救 治療措施,三、急性毒性試驗方法的要點,(一) 實驗動物選擇 選擇實驗動物的原則： 盡量選擇急性毒性反應(yīng)與人近似的動物 易于飼養(yǎng)，試驗動物操作方便 繁殖生育力較強，數(shù)量較大能夠保障供應(yīng) 價格較低，易于獲得動物 常用實驗動物為大白鼠和小白

3、鼠,性別, 急性毒性試驗所用的動物應(yīng)當(dāng)是雌、雄各半 如果在研究中發(fā)現(xiàn)待測化學(xué)物對雌、雄動物的毒性大小有明顯差異時，應(yīng)分別求出雌性與雄性動物各自的ld 50 值 如果試驗是為致畸試驗作劑量準備，也可僅做雌性動物的ld 50 試驗,實驗動物分組和數(shù)量,在利用不同的方法測定化學(xué)物ld 50 時，實驗設(shè)計中對動物數(shù)的要求不同 霍恩氏法測 ld 50 時要求有 4個劑量組， 每組4或 5只動物 改進寇氏法、概率單位法、bliss法測定則要求57個 劑量組，每組10只動物或10只以上 對于不同的化學(xué)物測定應(yīng)根據(jù)其相應(yīng)的試驗規(guī)程確定實驗動物數(shù)量,動物分組的原則：均衡性和隨機性,均衡性：要求各組動物的平均體重

4、及體重的離散度盡可能一致。具體來說是： （1）實驗動物的體重不應(yīng)超過全體實驗動物平均體重的10-控制離散度 （2）每組之間的平均體重相差不應(yīng)超過 5 -控制均衡性 隨機性：每只動物分散到各組去的機會是均等的，以避免成見或系統(tǒng)誤差,實驗動物的預(yù)處理,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，選擇生理健康的動物 凡經(jīng)口染毒時，要求試驗前要對動物禁食，以保證胃內(nèi)無食物，減少食物對化學(xué)物毒性的干擾 大鼠、小鼠隔夜進食；染毒后禁食4h 大動物每日上午喂食前染毒 染毒后繼續(xù)禁食24h，但在禁食時要保障飲水,(二) 受試物及處理,受試物的接受、分樣、保管、稱重、配制 以及在此過程中嚴格的質(zhì)量保證影響急性 毒性試驗 受試物劑型：水溶液

5、、混懸液、油溶液,(三) 染毒方法,1. 經(jīng)口(胃腸道)染毒： （1）灌胃： 空腹 灌胃后2-3 h復(fù)食 灌胃的體積不超過體重的1-2： 小鼠為 0.21.0ml/只或0.10.5ml/10g較合適 大鼠為5ml/只(通常用0.51.0ml/100g） 家兔為10ml/2kg體重，狗不超過50ml/10kg,灌胃器具制作,取l2號普通注射針頭，首先將針頭尖部去掉，然后用細銼刀把去掉部分銼平、銼光，再用沙紙磨光滑，有條件時可在針尖處點焊成球型。加工成有20度弧度的灌胃針，連接1ml或5ml的注射器，即成為大小鼠的灌胃器。,灌胃操作方法,先固定動物,即用右手將小鼠尾巴提起，置于鼠籠或粗糙的平面上，

6、當(dāng)小鼠向前掙扎時，用左手的拇指和食指捏住小鼠兩耳后頸背皮膚，翻轉(zhuǎn)小鼠置于掌心，拉直后肢，以小指壓住小鼠尾巴即可。在固定小鼠過程中，不要用力過大，勿握其頸部，以免窒息死亡。 以灌胃器輕輕壓其頭部，使口腔與食道成一條直線，再將灌胃針沿上腭壁輕輕進入食道，當(dāng)灌胃針進入約3cm左右時即達胃內(nèi)。,2. 經(jīng)呼吸道接觸,在常溫、常壓下為氣態(tài)，或在生產(chǎn)過程中 和生活過程中以蒸氣、氣溶膠、煙、粉塵 狀態(tài)污染生產(chǎn)與生活環(huán)境空氣，此時就有 可能經(jīng)呼吸道吸入。 吸入接觸分為兩種方式 ： 靜式吸入 動式吸入,3. 經(jīng)皮膚染毒, 研究外源化學(xué)物經(jīng)皮膚吸收應(yīng)當(dāng)盡量選擇皮膚解剖、生理與人類較近似的動物為對象，目前多選用家兔和

7、豚鼠 但由于研究化學(xué)物經(jīng)皮膚吸收的毒性 (求經(jīng)皮ld 50 )所需的實驗動物較多，使用家兔、豚鼠不夠經(jīng)濟，也常用大鼠代替,4. 經(jīng)注射染毒,(四) 試驗程序,1、查閱文獻 首先了解分析受試化學(xué)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和其理化性質(zhì)，依此查閱文獻， 找出與受試化學(xué)物化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似的化學(xué)物的毒性資料，并以文獻資料中相同的動物種系和相同接觸途徑所測得的ld50(lc50)值作為受試化學(xué)物的預(yù)期毒性中值。,2、預(yù)試驗, 以此預(yù)期毒性中值為待測化學(xué)物的中間劑量組，再上下各推12個劑量組做預(yù)試驗（每個劑量組間的組距可以大些，有利于找出受試化學(xué)物的致死劑量范圍） 根據(jù)確定的劑量組進行染毒 根據(jù)預(yù)試驗的死亡資料確定

8、組距 可根據(jù)以下公式計算出劑量分組： i=(lgld90-lgld10)(n-1) 或：i=(lgld100-lgld0)(n-1) 式中i為組距(相鄰的兩個劑量組對數(shù)劑量之差)； n為設(shè)計的劑量組數(shù)。,3、正式試驗,一般來說，根據(jù)試驗設(shè)計所選用的ld50計算方法來確定組數(shù)。例如改良寇氏法一般設(shè)57個劑量組；霍恩法固定設(shè)4個劑量組。求得i后，以最低劑量組(ld0或ld10)的對數(shù)劑量加上一個i值，即是第二個劑量組的對數(shù)劑量，依此類推直至最高劑量組，查各自的反對數(shù)即得出各組劑量的真實值。 1 2 3 4 5 6 lgld0 lgld0+i lgld0+2i lgld0+3i lgld0+4i ,

9、4. 癥狀觀察,(1) 觀察時間和周期 測定外源化學(xué)物的ld 50 (lc 50 )，一般要 求計算實驗動物接觸化學(xué)物之后兩周 （14天）內(nèi)的總死亡數(shù) 對于一些速死性化學(xué)物求其ld 50 (lc 50 ) 也可僅計算24小時的死亡率（有些速殺性化學(xué)物的24小時ld 50 與兩周 ld 50 值往往沒有差別 ） 應(yīng)注明是多少時間的ld 50 值，以便于在進行毒性比較時有共同的基礎(chǔ),（2） 中毒體癥和發(fā)生過程觀察,很多化學(xué)物在實驗動物接觸的初期往往先出現(xiàn)興奮現(xiàn)象，有的化學(xué)物在動物接觸的初期首先表現(xiàn)為抑制現(xiàn)象,（3）死亡情況和時間分布：計算ld 50,重點觀察和記錄每只動物死亡的時間，特別是最早出現(xiàn)

10、死亡的時間以及各個劑量組動物的死亡數(shù)。分析中毒死亡時間的規(guī)律具有一定意義，可為深人研究化學(xué)物的毒作用機制提供參考。,（4）體重：,體重可以反映動物中毒后的整體變化。體重改變的原因很多，若化學(xué)毒物刺激或損傷消化道可出現(xiàn)試驗動物飲食減少甚至拒食，表現(xiàn)為體重減輕；若化學(xué)毒物引起腹瀉，將影響食物吸收和利用，體重也會減輕。如果化學(xué)毒物影響水的攝取或腎功能急性損傷，也可能在體重上反映出來。所以，對存活動物尤其是對低于ld50劑量組的存活動物，應(yīng)在觀察期14天內(nèi)稱量其體重的變化，以便了解受試物引起毒效應(yīng)的持續(xù)時間。,（5）病理檢查和其它指標觀察,凡中毒死亡動物應(yīng)及時解剖做病理學(xué)檢查，檢查器官有無充血、出血、水腫或其它改變，并對有變化的臟器作病理組織學(xué)檢查 對存活動物于觀察期結(jié)束后應(yīng)做病理學(xué)檢