PCR擴增目的基因ppt課件

.,任務(wù)二：PCR擴增目的基因,.,一、實驗?zāi)康?1、掌握PCR擴增DNA的技術(shù)與原理2、學(xué)習(xí)PCR擴增儀的使用,.,二、實驗原理,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外DNA擴增技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強、操作簡便和應(yīng)用廣泛等特點。PCR工作原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制過程，是將待擴增的DNA片段和與其兩側(cè)的已知序列合成兩個與模板DNA互補的寡核苷酸作為引物，引物序列將決定擴增序列片段的特異性和片段長度。,.,標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：1.模板變性（92-96）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA2.低溫退火（37-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。3.延伸（72）：在Taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5端3端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。,.,.,三、實驗儀器,PCR擴增儀臺式高速離心機移液器高壓滅菌后的Eppendorf管（0.5mL）電泳儀,.,四、材料與試劑,1、模板DNA（0.1g/L）：用牙簽挑取單菌落懸浮到50L的裂解液中（1%TritonX-100，20mmol/LTris-HCLpH8.2，2mmol/LEDTA），95溫浴10min，10000r/min離心5min，取2L上清液用于總體積50L的PCR反應(yīng)。,.,2、TaqDNA聚合酶（5U/L），10擴增緩沖液，dNTP（1mmol/L）：購買。3、引物（100pmol/L）：設(shè)計并合成與目的DNA兩側(cè)互補的引物。,.,五、實驗操作,1.準(zhǔn)備PCR反應(yīng)溶液,（1）按序?qū)⑷缦鲁煞只旌现糜贓ppendorf管內(nèi)a.10擴增緩沖液10Lb.4dNTPs8Lc.引物11Ld.引物2Le.模板DNA1L（10ng）f.TaqDNA聚合酶L（2.5U）加水至終100L,.,（2）手指輕彈Eppendorf管底部離心2s,（3）加石蠟油50L封住溶液表面,.,2.PCR擴增反應(yīng),加好樣的Eppendorf管置于PCR擴增儀內(nèi)變性：955min951min退火：5545s延伸：721min重復(fù)循環(huán)30次循環(huán)結(jié)束后72延伸8min反應(yīng)完畢，取樣置-4待用,.,3.結(jié)果觀察,取樣進行瓊脂糖凝膠電泳溴化乙錠（EB）染色觀察DNA條帶,高度靈敏的熒光染色劑染色效果好操作方便穩(wěn)定性差強致癌劑中度毒性,.,六、注意事項,1、PCR結(jié)果若出現(xiàn)非特異性的擴增條帶，有必要進一步優(yōu)化反應(yīng)條件，包括改變退火溫度和時間，調(diào)整Mg2+濃度等。2、PCR反應(yīng)特異性