PCR擴增目的基因ppt課件_第1頁
PCR擴增目的基因ppt課件_第2頁
PCR擴增目的基因ppt課件_第3頁
PCR擴增目的基因ppt課件_第4頁
PCR擴增目的基因ppt課件_第5頁
已閱讀5頁，還剩9頁未讀， 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明：本文檔由用戶提供并上傳，收益歸屬內(nèi)容提供方，若內(nèi)容存在侵權(quán)，請進行舉報或認領

文檔簡介

.,任務二：PCR擴增目的基因,.,一、實驗目的,1、掌握PCR擴增DNA的技術與原理2、學習PCR擴增儀的使用,.,二、實驗原理,聚合酶鏈式反應是一種體外DNA擴增技術，具有靈敏度高、特異性強、操作簡便和應用廣泛等特點。PCR工作原理類似于DNA的體內(nèi)復制過程，是將待擴增的DNA片段和與其兩側(cè)的已知序列合成兩個與模板DNA互補的寡核苷酸作為引物，引物序列將決定擴增序列片段的特異性和片段長度。,.,標準的PCR過程分為三步：1.模板變性（92-96）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA2.低溫退火（37-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。3.延伸（72）：在Taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5端3端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。,.,.,三、實驗儀器,PCR擴增儀臺式高速離心機移液器高壓滅菌后的Eppendorf管（0.5mL）電泳儀,.,四、材料與試劑,1、模板DNA（0.1g/L）：用牙簽挑取單菌落懸浮到50L的裂解液中（1%TritonX-100，20mmol/LTris-HCLpH8.2，2mmol/LEDTA），95溫浴10min，10000r/min離心5min，取2L上清液用于總體積50L的PCR反應。,.,2、TaqDNA聚合酶（5U/L），10擴增緩沖液，dNTP（1mmol/L）：購買。3、引物（100pmol/L）：設計并合成與目的DNA兩側(cè)互補的引物。,.,五、實驗操作,1.準備PCR反應溶液,（1）按序?qū)⑷缦鲁煞只旌现糜贓ppendorf管內(nèi)a.10擴增緩沖液10Lb.4dNTPs8Lc.引物11Ld.引物2Le.模板DNA1L（10ng）f.TaqDNA聚合酶L（2.5U）加水至終100L,.,（2）手指輕彈Eppendorf管底部離心2s,（3）加石蠟油50L封住溶液表面,.,2.PCR擴增反應,加好樣的Eppendorf管置于PCR擴增儀內(nèi)變性：955min951min退火：5545s延伸：721min重復循環(huán)30次循環(huán)結(jié)束后72延伸8min反應完畢，取樣置-4待用,.,3.結(jié)果觀察,取樣進行瓊脂糖凝膠電泳溴化乙錠（EB）染色觀察DNA條帶,高度靈敏的熒光染色劑染色效果好操作方便穩(wěn)定性差強致癌劑中度毒性,.,六、注意事項,1、PCR結(jié)果若出現(xiàn)非特異性的擴增條帶，有必要進一步優(yōu)化反應條件，包括改變退火溫度和時間，調(diào)整Mg2+濃度等。2、PCR反應特異性

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明，都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等，如果需要附件，請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙，網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽，若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間，僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理，對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯，并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容，請與我們聯(lián)系，我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論