生物化學-有動畫PPT課件

.,1,教師：李偉國資料收集：楊延璽易勝王濤則巴古力董興馮瑩賴照明劉亞京資料整合：楊林芳吳菲菲余星星PPT制作：劉亮講課：曾棟梁,生物化學實驗設計報告蛋白質(zhì)的提取、純化以及檢測,.,2,已知某蛋白的分子量約為17kDa，等電點3.94.1，它能耐一定的高溫，在90C加熱34min后仍然能夠保持80%的活性。該蛋白含有較多的疏水性殘基，與Ca2+結(jié)合后可以暴露它的疏水基團。該蛋白的作用是作為生物體內(nèi)酶的激活劑。,題目解析,在鈣離子的作用下才能起到暴露疏水集團發(fā)揮性能，結(jié)合蛋白質(zhì)基礎知識從而可以判斷其為鈣調(diào)蛋白。,鈣調(diào)蛋白的簡單介紹,鈣調(diào)蛋白（英語：Calmodulin，又稱鈣調(diào)素、攜鈣素，簡稱CaM），是一種能與鈣離子結(jié)合的蛋白質(zhì)，普遍存在真核生物細胞中。鈣調(diào)素由148個氨基酸組成（分子量為16700）；含有大量酸性氨基酸（有1/3是谷氨酸和天冬氨酸），為酸性蛋白質(zhì)（等電點為4.3）。鈣調(diào)素含有4個EF手結(jié)構(gòu)片斷，其中每一個都可以結(jié)合一個鈣離子。鈣調(diào)蛋白是一種鈣結(jié)合蛋白，存在于幾乎所有的真核細胞中。它的作用是對任何微量的鈣都能敏感地捕獲。鈣調(diào)蛋白只有在與Ca2+結(jié)合后才有活性。與鈣結(jié)合后，CaM發(fā)生構(gòu)型上的變化，成為一些酶的激活物。因不含有易氧化的絡氨酸、半胱氨酸，因此十分的穩(wěn)定,實驗設計框架,實驗方法：熱變性吸附層析法，基因重組大腸桿菌法（論文無法下載）,蛋白檢測：分為定性檢測和活性檢測,實驗總結(jié)：總結(jié)當前實驗,第18卷第4期JournalofShanxiTeachersUniversityVol.18No.42004年12月NaturalScienceEdition動物腦組織中鈣調(diào)蛋白的分離純化袁麗環(huán),段江燕,實驗方法,試劑準備：新鮮鼠腦；標準鈣調(diào)蛋白；PDE；Pipes；BufferA：10mmol/LPipes,1mmol/LEDTA,pH=7.0;BufferB：10mmol/LPipes,1mmol/LCaCl2,pH=7.0;BufferC：50mmol/LTris-HCl,0.5mmol/LNaCl,10mmol/LEDTA,pH=8.0;測定Buffer：360mmol/LTris-HCl，360mmol/L咪唑，4.5mmol/LMgAc2。,實驗方法,儀器準備：TGL-16L-A高速冷凍離心機；2001-B-C七件套豪華層析系統(tǒng)；UV-2201紫外分光光度計。,鈣調(diào)蛋白的粗提取,取新鮮的鼠腦共20g，切碎并于100mLBufferA中勻漿將勻漿液置100水浴中煮沸3min，冷卻后離心10000rpm，60min.取上清液調(diào)成2mmol/LCaCl2溶液。,取樣，采用離心法：,鈣調(diào)蛋白提取,粗樣品的純化：（吸附層析法）,裝柱：采用葡聚糖G-50(分離蛋白質(zhì)的范圍在1.5103-3104)用蒸餾水浸充分膨脹(3h-4h)后再裝柱；平衡：用提取鈣調(diào)蛋白的緩沖溶液BufferA平衡；上樣：經(jīng)過平衡的凝膠過濾柱。當平衡液流動到與固定相表面一致時，用滴管輕輕地把分離樣品的溶液加到固定相表面，要盡量避免沖毀基質(zhì)加入樣品液的體積一般應少于床體積的1/2;洗脫：待樣品液的液面流到固定相表面時，用50mLBufferB淋洗之后用200mL0.5mol/LNaCl的BufferB淋洗，最后用BufferC洗脫；收集：在進行洗脫的同時柱的下端與部分收集器接通。按時間分管收集，每管滴2min，流速控制在大約1.5mL/min。,.,9,鈣調(diào)蛋白的定性檢測,如圖，倘若兩者最大吸收峰以及峰形基本重合，那么可以判斷該物質(zhì)即為鈣調(diào)蛋白,采用紫外光譜法：,.,10,鈣調(diào)蛋白的活性檢測,根據(jù)磷酸二酯酶(PDE)可特異地把環(huán)核苷酸水解為5-核苷酸,并在蛇毒中的核苷酸作用下,進一步水解成腺苷和磷酸.而鈣調(diào)蛋白可以激活PDE,從而使最終的產(chǎn)物無機磷的量增加,因此可依據(jù)磷的含量判斷鈣調(diào)蛋白的生物學活性.,機理圖如下,對活性的計算存在以下定量關(guān)系：,采用PDE法：,.,11,實驗總結(jié),.,12,本文通過動物腦組織為材料經(jīng)熱變性、離心、葡聚糖SephadexG-50分離純化，通過紫外吸收圖譜、二步酶解法檢