MICM檢測在惡性血液病中運用.ppt

MICM檢測在惡性血液病中的運用,曾雁玲,背景介紹,血液病是原發(fā)于造血系統(tǒng)的疾病，或影響造血系統(tǒng)伴發(fā)血液異常改變，以貧血、出血、發(fā)熱為特征的疾病。,出血性疾病,貧血癥,白細胞疾病,常見血液病,造血系統(tǒng)惡性腫瘤,惡性血液病類型,MICMFAB形態(tài)學(xué)診斷(Morphology)：包括血液和骨髓形態(tài)學(xué)及組織化學(xué)染色。免疫學(xué)檢查(Immunology)遺傳學(xué)檢查(Cytogenetics)分子生物學(xué)檢查(Molecular),檢測方法,一、形態(tài)學(xué),是診斷的基礎(chǔ)，任何淋巴造血系統(tǒng)增生性疾病的診斷都離不開形態(tài)學(xué)診斷。形態(tài)學(xué)診斷技術(shù)包括細胞學(xué)：外周血、骨髓涂片組織學(xué)：骨髓活檢、血凝塊,外周血涂片檢測（血液病血常規(guī)）：用來觀察外周血細胞形態(tài)、數(shù)量。是對血液分析儀檢測的血常規(guī)的鏡下檢測補充。檢測內(nèi)容包括：白細胞如粒細胞、單核細胞、淋巴細胞；紅細胞；血小板。,骨髓涂片檢測：1、骨髓增生程度，G:E，骨髓小粒及脂肪油滴有無及分度。2、粒細胞系統(tǒng)、紅細胞系統(tǒng)、淋巴細胞系統(tǒng)、單核細胞系統(tǒng)、巨核細胞系統(tǒng)、漿細胞系統(tǒng)以及其他細胞（網(wǎng)狀細胞、內(nèi)皮細胞、纖維細胞、成骨細胞、破骨細胞、組織嗜堿細胞、退化細胞等）的形態(tài)及比例。血小板的情況。3、骨髓小粒4、有無轉(zhuǎn)移瘤和寄生蟲。,骨髓病理檢測：在高倍鏡下觀察骨髓的組織結(jié)構(gòu)和各成分的分布及相互關(guān)系。,骨髓活檢和骨髓/血涂片,骨髓/血涂片,骨髓涂片細胞細微結(jié)構(gòu)清楚評估紅系、粒系增生情況及幼稚細胞比例具有優(yōu)勢骨髓纖維化、細胞致密可干抽可做組織化學(xué)染色（如鐵染）對缺鐵性貧血、慢性疾病引起的貧血、巨幼細胞性貧血、和急性白血病的診斷尤其有幫助。,骨髓活檢,骨髓活檢顯示骨髓的組織結(jié)構(gòu)和各成分的分布及相互關(guān)系，對巨核細胞的評估具有優(yōu)勢不存在干抽和骨髓稀釋可做免疫組織化學(xué)染色對再生障礙性貧血、低增生性白血病、淋巴瘤、轉(zhuǎn)移癌、骨髓增生性腫瘤的診斷具有重要價值,骨髓涂片看細胞、骨髓活檢看結(jié)構(gòu)，相互補充相互驗證不能相互替代,血凝塊：廢物利用、骨髓活檢的補充,骨髓活檢常見問題,標本取材條件：要求穿刺1cm以上骨髓組織診斷不明確：取材部位是否有病灶保存液：10%福爾馬林固定,二、細胞組織化學(xué)染色,以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，運用化學(xué)或生物化學(xué)技術(shù)研究細胞內(nèi)化學(xué)成分的分布及變化的檢測方法。對某些血液病的診斷、鑒別診斷、療效、判斷預(yù)后有一定的意義。,常用的細胞化學(xué)染色有：1、過氧化酶又稱髓過氧化酶(Myeloperoxidase，MPO或POX)：陽性為棕黑色。用于急性白血病的鑒別：急性粒細胞白血病為陽性，其中M3為強陽性，急性單核細胞白血病為弱陽性，急性淋巴細胞白血病為陰性。,2、非特異性酯酶（NSE）：包括中性非特異性酯酶（-NAE，棕黑色）、酸性非特異性酯酶（A-NAE，棕紅色），堿性非特異性酯酶（-NBE，棕紅色）。意義：急性單核細胞白血病強陽性，且能被氟化鈉抑制。急性粒細胞白血病弱陽性或陰性，不被氟化鈉抑制。,3、特異性酯酶（SE）：陽性紅寶石色顆粒。意義：急性粒細胞白血病陽性或強陽性。急性單核細胞白血病陰性。慢粒急粒變陽性增強。,4、蘇丹黑B染色（SBB）：陽性為黑色。意義：和POX基本一樣。,5、中性粒細胞堿性磷酸酶（NAP）：陽性為灰黑色或黑色。計算陽性率和積分值：陽性率：計數(shù)100個中性桿狀核和分葉核粒細胞，觀察其陽性細胞的個數(shù)，即為陽性率。(正常值40%)陽性指數(shù)：（+）1+（+）2+（+）3+（+）4的總和。（正常值40-80分）意義：升高見于嚴重感染，類白，急淋，骨纖，真紅，再障，ITP,淋巴瘤等。降低見于慢粒，急性粒細胞白血病，PNH。故可用于慢粒和類白、骨纖；再障和PNH；急粒和急淋的鑒別。,6、糖原染色（PAS）：陽性為紅色。可以計算陽性率和陽性指數(shù)。意義：（1）正常情況下，紅細胞系統(tǒng)的原、幼紅細胞和成熟紅細胞；粒細胞系統(tǒng)的原粒細胞、原單核細胞和大多數(shù)淋巴細胞為陰性反應(yīng)。自早幼粒階段以后的粒細胞和幼單核細胞可呈弱陽性反應(yīng)。（2）急淋、紅白血病、戈謝病的原始細胞呈強陽性反應(yīng)或陽性反應(yīng)；缺鐵性貧血、珠蛋白生成障礙、MDS亦可呈陽性反應(yīng)；急性粒細胞白血病、急性單核細胞白血病、良性淋巴細胞增多癥、尼曼-皮克細胞呈陰性反應(yīng)或弱陽性反應(yīng)。巨幼細胞性貧血、溶血性貧血、再生障礙性貧血等幼紅細胞為陰性反應(yīng)。偶有個別幼紅細胞呈陽性反應(yīng)。（3）幫助鑒別不典型巨核細胞和霍奇金細胞，巨核細胞呈強陽性反應(yīng)；霍奇金細胞呈弱陽性或陰性反應(yīng)。（4）幫助鑒別白血病細胞和腺癌骨髓轉(zhuǎn)移的腺癌細胞，腺癌細胞呈陽性反應(yīng)。,7、酸性磷酸酶染色（ACP）：陽性酶活性部位出現(xiàn)紅色沉淀，胞核為藍色。意義：1、鑒別戈謝細胞和尼曼-匹克細胞，前者陽性，后者為陰性。2、多毛細胞白血病為陽性反應(yīng)，且耐L-酒石酸的抑制作用。淋巴肉瘤細胞和慢性淋巴細胞白血病的淋巴細胞，酸性磷酸酶染色也呈陽性反應(yīng)，但此酸可被L-酒石酸抑制。3、T淋巴細胞呈陽性反應(yīng)，而B淋巴細胞為陰性反應(yīng)。,8、鐵染色（Fe染色）：陽性為淡綠色。細胞內(nèi)鐵觀察有核紅細胞；細胞外鐵觀察骨髓小粒及網(wǎng)狀細胞。意義：（1）鐵低見于缺鐵性貧血；（2）鐵高見于再生障礙性貧血、巨幼紅細胞性貧血、白血病、感染和多次輸血病人；（3）環(huán)形鐵粒幼細胞（RS），環(huán)鐵大于15%，見于RAS。,鐵粒幼紅細胞定義,三、免疫分型,應(yīng)用：1、確定系來源：利用不同系有特定的抗原表達可以確定髓系/B系/T/NK系/組織細胞和樹突狀細胞。2、確定細胞分化階段：不同發(fā)育階段細胞，其抗原表達不同。3、預(yù)后判斷：有些抗原表達和淋巴瘤/白血病預(yù)后相關(guān)，如白血病患者有CD7+與CD34+共表達，示預(yù)后不好。4、治療方法選擇-治療靶向5、療效判斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測所以我們可以用于血液疾病的診斷如白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、MDS等；以及一些疾病的鑒別診斷如再障、ITP、MPD。運用于微小殘留病灶的監(jiān)測等。,常用的方法：流式細胞術(shù)和細胞免疫組織化學(xué)染色法。,白血病分類中免疫分型的應(yīng)用與意義,常用的抗原：1、白血病系列分化抗原T淋巴細胞白血?。篊D3、CD5、CD7。B淋巴細胞白血?。篊D10、CD19、CD22。NK淋巴細胞白血病：CD16、CD56、CD57。髓系白血?。篊D13、CD14、CD33、MPO（髓過氧化物酶）。紅白血?。篏lyA（血型糖蛋白A）。巨核細胞白血?。篊D41、CD42、CD61。,2.白血病系列非特異性抗原CD34、HLADR為早期細胞抗原，無系列特異性，可與CD38聯(lián)合運用于免疫分型。一般而言，干/祖細胞CD34、HLADR、CD38，原始細胞CD34、HLADR、CD38，而幼稚細胞（如早幼粒細胞）CD34、HLADR、CD38。,3、白細胞共同抗原CD45為白細胞共同抗原，其表達量在淋巴細胞最高，單核細胞，成熟粒細胞，早期造血細胞（blasts）依次減弱。紅細胞（中，晚幼紅細胞，成熟紅細胞）不表達CD45。用SSC/CD45PerCP雙參數(shù)分析可十分容易鑒別骨髓和血液中的原始或成熟細胞。,AML：,1、M0：其特征為T、B細胞標記的陰性（即CD19、CD20、CD22與CD3、CD5、CD7、CD10）。作為干、祖細胞標記的CD34、CD38和HLA-DR均為陽性，具有特征性的TdT標記應(yīng)有至少30%的原始細胞會呈陽性表達。而髓系特征不能過多，通常是CD13、CD33、CD117中的任何一項呈陽性表達；CD68、MPO大多陰性。若髓系有兩個以上標記呈陽性，應(yīng)考慮未成熟的急性髓細胞白血病。,2、M1：M1與M0相似不易區(qū)分，M1一般CD13、CD33、HLA-DR，但CD34表達少于M0，可能表達部分CD15。3、M2：M0與M1的主要區(qū)別是成熟度增加，CD15較M1較顯著，CD34弱于M1，CD13有時表達強于CD33，多數(shù)病例HLADR（-）。4、M3：高顆粒性，多數(shù)情況HLADR（-）或表達減少，CD34少于M2、一般CD13弱（），可有CD2表達。,5、M4與M5：兩型表型相似，但M4較M5表達更多的CD34（），重要的表型為CD13、CD33、HLADR、CD14和CD15，CD33可表達強于CD13；CD33（）、CD13（）、CD34（）很可能為M5，但只出現(xiàn)在少數(shù)病人中，部分M5可見CD56（）。,6、M6：M6較少見且特征不明顯，一般HLADR，CD34、CD13、CD33陽性。7、M7：巨核細胞白血病，在AML中少于1。一般CD61（Gpa）和/或CD41（Gpb-a）陽性，而注意由于血小板粘附造成的假陽性以及一些不明原因出現(xiàn)的假陰性。這時候可以借助于小巨核酶標（CD41免疫組織化學(xué)染色）,ALL：,WHO分型分為B祖細胞型，CD10或CD10，前B細胞型，B細胞型，T細胞型。,1、B祖細胞型ALL：FAB標準的L1或L2，一般TdT(+)HLA-DR(+)，CD19(+)，此型又分為2個亞型，CD10和CD10，前者預(yù)后好，多數(shù)病例CD24，CD34，CD20表達隨成熟度增加而增加。,2、前B細胞型ALL：一般為CD19，CD24，HLADR，胞漿CD22，CD10，TdT隨CD20變化，CD34多為陰性。,3、B細胞型ALL：即成熟B細胞型ALL；即FAB標準的L3，表型為CD19、CD20、CD22、CD24且sIg（多數(shù)為IGM）陽性，多數(shù)病例CD10。,4、TALL：表達CD1、CD2、CD5、CD7、CD4/CD8雙陽與極少膜表面CD3、TdT多為陽性。另一常見亞型為皮質(zhì)早期表達CD2、CD5、CD7、TdT強表達。髓質(zhì)期亞型表達CD2、CD5、CD7、與CD3CD4/CD3+CD8+,很少見TdT表達。,雜合型白血?。?隨著流式技術(shù)的廣泛應(yīng)用，我們發(fā)現(xiàn)許多病例并不能嚴格劃分為淋系或髓系，真正的雙表型病人多為t(9；22)或（11q23），現(xiàn)在雜合型的誤診率很高。最重要的系特異性抗原在B系、T系、髓系分別為CD22、CD3和MPO。,即染色體異常包括染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量異常根據(jù)這些特征性的異常，對惡性血液病進行診斷和分類、預(yù)后分層及指導(dǎo)治療。,四、細胞遺傳學(xué),核型描述,首先列出染色體總數(shù)，然后是性染色體組成，接著列出異常的染色體數(shù)目或形態(tài)。下列統(tǒng)一的命名符號：A-G染色體組的名稱1-22染色體編號X,Y性染色體del缺失der結(jié)構(gòu)重排的染色體dup重復(fù)inv倒位t易位+/-在染色體符號前表示染色體增加或減少，在染色體符號后表示染色體多出或缺少一部分,人類23對染色體,上面的核型描述就是46，XY。例如46，XY，t(8;21)(q22;q22),（一）、染色體檢測在白血病中的意義,1950,1960,1970,1980,1990,2000,2010,確定染,色體數(shù)目=46,發(fā)現(xiàn)Ph；,發(fā)現(xiàn)+21,各種顯帶技術(shù),出現(xiàn)；發(fā)現(xiàn)多數(shù)AL患者伴有染色體異常,FISH出現(xiàn)；闡明某些染色體異常的分子學(xué)改變,SKY,CGHPCR技術(shù)FLT3-ITD(1996)c-KIT突變（1993）.,芯片技術(shù)：cDNAarrayArray-CGH、SNP-array、測序技術(shù)的發(fā)展大量基因突變的發(fā)現(xiàn)：JAK2、NPM、CEBPA、PAX5、IKZF1、FLT3、RUNX1、WT1、RAS、NOTCH1.,新一代高,通量測序技術(shù)；各種遺傳學(xué)改變間的相互作用,血液腫瘤遺傳學(xué)研究的歷史,多數(shù)AML患者有非隨機性染色體改變，包括易位、,倒位、插入、缺失、擴增、等臂染色體等,染色體異常在AML診斷、分型、預(yù)后評價、發(fā)病機,制研究及靶向治療藥物研發(fā)方面有重要價值,一些特殊的細胞遺傳學(xué)異常在WHO分型建議中已被,列為特殊亞型,對不同細胞遺傳學(xué)類型的血液腫瘤患者進行個體化治,療可以獲得更好的療效,AML常見染色體異常,t(8;21)t(15;17),10%8%,inv(16)/t(16;16)11q23異常,5-10%3-5%,30,2045,單一異常：45%2種異常：55%,-5/5q-；-7/7q-；8；-Y；+11；+13；+21;+223q26；del(9q)t(6;9)；t(9;22)等,AML的WHO分型,伴再現(xiàn)性遺傳學(xué)異常的AML伴多系發(fā)育異常的AML繼發(fā)于MDS；無MDS病史,治療相關(guān)性AML,烷化劑相關(guān)；拓撲異構(gòu)酶抑制劑相關(guān)；其它,無法分類的AML髓細胞肉瘤,Downs綜合征相關(guān)AML,伴再現(xiàn)性遺傳學(xué)異常的AML,AMLwitht(8;21)(q22;q22)AMLwithinv(16)(p13.1q22)ort(16;16)APLwitht(15;17)(q22;q12)AMLwitht(9;11)(p22;q23)AMLwitht(6;9)(p23;q34)AMLwithinv(3)(q21q26.2)ort(3;3)AML-M7witht(1;22)(p13;q13),RUNX1-RUNX1T1CBFB-MYH11PML-RARAMLLT3-MLLDEK-NUP214RPN1-EVI1RBM15-MKL1,?AMLwithmutatedNPM1?AMLwithmutatedCEBPA通常AML的診斷標準，原始細胞比例為20%，但如果t(8;21)、t(15;17)或inv(16)陽性，則不論原始細胞比例為多少，白血病診斷成立,AML染色體異常的預(yù)后分級,預(yù)后等級好中差,核型類型t(8;21)、t(15;17)、inv(16)正常、+8、+21、+22、del(9q)、del(7q)、t(9;11)(p13;q23)-5、del(5q)、-7、inv(3)、復(fù)雜異常、t(8;16)(p11;p13)、inv(3)(q21q26)、11q23異常（t(9;11)除外）、t(6;9)(p23;q34)等,（二）、染色體在MDS中的意義。已報道的MDS患者骨髓細胞染色體核型異常較多,其中以5、7、+8、5q、7q、11q、12q、20q較為多見。經(jīng)過很多作者反復(fù)證實，MDS患者有無染色體異常以及異常的類型對于診斷分型、評估預(yù)后和治療決策都具有極為重要的意義,因此，細胞遺傳學(xué)檢查必須列為MDS常規(guī)檢測項目之一。,MDS的重現(xiàn)染色體異常,非平衡異常：+8，-7或del(7q),-5或del(5q),del(20q),-Y,i(17q)或t(17p),-13或del(13q),del(11q),del(12p)或t(12p),del(9q),idic(X)(q13)其中+8，del(20q),和-Y，在不符合形態(tài)學(xué)標準的情況下不能作為MDS的確診依據(jù)平衡異常：t(11;16)(q23;p13.3),t(3;21)(q26.2;q22.1),t(1;3)(p36.3;q21.1),t(2;11)(p21;q23),inv(3)(q21q26.2),t(6;9)(p23;q34),MDS預(yù)后判斷,MDS的國際預(yù)后積分系統(tǒng)（IPSS）,五、分子生物學(xué)檢測,分子診斷常用技術(shù),核酸分子雜交技術(shù)熒光原位雜交（FISH）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)實時熒光定量PCR、多重PCR技術(shù)基因測序Sanger測序法、二代測序技術(shù),熒光原位雜交(FISH),生命科學(xué)中的“釣魚”技術(shù)原理：通過熒光標記的DNA探針與細胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交目的：獲得細胞內(nèi)多條染色體或多種基因狀態(tài)的信息,熒光原位雜交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH）,FISH檢測BCR/ABL融合基因,BCR/ABL基因正常,BCR/ABL基因融合,9號,22號,雙色單融合探針，檢測染色體易位,abl,bcr,聚合酶鏈反應(yīng)PCR,按照上述步驟重復(fù)操作，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)擴增模板DNA擴增倍數(shù)T=2n(n:循環(huán)次數(shù)),Sanger測序法,DNA雙脫氧鏈終止法測序,各個平臺的特點,血液病分子診斷的意義,CBFB/MYH11AML1/ETOPML/RARaE2A/PBX1MLL/AF4BCR/ABLTEL/AML1SIL/TAL1EVI1HOX11MLL/AF10MLL-AF9MLL/ENLNPM1/ALKNPM/MLF1,MLL/ELLMLL/AFXMLL/AF1qMLL/AF1pPLZF/RARaMLL/AF6MLL/MLL（dupMLL）TLS/ERGTEL/PDGFRTEL/ABLSET/CANDEK/CANMLL/AF17E2A/HLFNPM/RARaAML1/MDS1,CBFB/MYH11：Inv(16)(p13q22)是急性髓系白血病(AML)特征性染色體異常，通常見于AML-M4Eo亞型，占總AML患者的10%，其中50發(fā)生在AML-M4Eo中。帶有Inv(16)(p13q22)的病人通常有較好的預(yù)后。該基因陽性的病人，可用于療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。,AML1/ETO：出現(xiàn)在所有的t(8,21)陽性的AML中，同時也出現(xiàn)在具有復(fù)雜移位的t(8,21)陰性的AML病例中。其主要出現(xiàn)在AML-M2這一亞型中，大約有20-40%病例具有t(8,21)。在非常少見的AML-M1，AML-M4和t-AML中也有報道。t(8,21)異位是一個較好的標志，它的存在使這類病例對一些藥物有較好的反應(yīng)。因此基于細胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)的檢測結(jié)果，可以為病人選擇風(fēng)險低的較好的治療方案。該基因陽性的病人，可用于療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。,PML/RARa：t(15,17)易位是APL的一個典型標志，其易位造成了15號染色體上的PML基因和17號染色體上的RARa基因的融合，產(chǎn)生了一個融合基因PML/RARa。檢測PML/RARa融合基因的存在與否，對APL的診斷，判斷ATRA的療效和預(yù)后復(fù)發(fā)都非常重要。PML/RARa陽性強烈預(yù)示著復(fù)發(fā)的可能，而其持續(xù)性陰性則預(yù)示病人有更長的生存期。該基因陽性的病人，可用于療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。,PLZF/RARa：t(11;17)(q23;q21)易位，特定的在急性早幼粒白血病或急性非淋巴細胞白血病M3型中發(fā)現(xiàn)。功能尚不明確。預(yù)后明顯差與有t(15;17)易位的ANLLM3型，其對ATRA的化療無反應(yīng)。NPM/RARa:t(5;17)(q35;q22)易位發(fā)生于急性非淋巴細胞白血病，見于M3，即急性早幼粒細胞白血病。病例少，有記載的只有2例兒童病例，2例的復(fù)發(fā)時間都短，預(yù)后可能不樂觀。,BCR/ABL：在超過95%的CML病人的白血病細胞中，30%（20-50%）的成人ALL和2-10%的兒童ALL中，以及小于2%的淋巴瘤和骨髓瘤的病例中有BCR/ABL融合基因。在CML中BCR/ABL大部分是p210型的，少許p190，極少數(shù)p230。ALL患者的BCR/ABL融合基因是p190型（60%）。在ALL中，Ph陽性和隨之出現(xiàn)的BCR/ABL融合基因是一個非常不好的標志，它影響著病人血相的完全緩解率和可能的生成率。該基因陽性的病人，可用格列衛(wèi)進行治療，并可進行療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。,E2A/PBX1：t(1:19)的ALL中檢測到，尤其是前B-ALL病例中。臨床癥狀都比較兇險。該基因陽性的病人，可用于療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。MLL/AF4：見于與t(4;11)相關(guān)的前BALL。預(yù)后不良但該融合基因的存在似乎能增強高劑量的Ara-C的療效?？捎糜诏熜ПO(jiān)測和微小殘留的檢測。TEL/AML1：見于t(12;21)(p13;q22)兒童ALL。都是前B細胞ALL。其白細胞比較低。預(yù)后較好，復(fù)發(fā)較遲?？捎糜诏熜ПO(jiān)測和微小殘留的檢測。EVI1：定位于染色體3q26。見于MDS和CML。預(yù)后不良，,MLL/ELL:t(11;19)(q23;p13.1)占11q23異常的3.8%，為AML特征性異常，年齡以成人為主。白細胞20109/L，F(xiàn)AB分型M4或M5，預(yù)后不良，2年無病生存率50%。NPM/MLF1：t(3;5)(q25.1;q34)易位，在MPS,MDS,ANLL（M2,M4,M6）中有發(fā)現(xiàn)。預(yù)后非常差1，中位生存期少于1年。,FLT3-ITD，F(xiàn)ms樣酪氨酸激酶3-內(nèi)服串聯(lián)重復(fù)序列，13q13.1NPM1，核仁磷酸蛋白1，5q35,急性髓系白血病,急髓相關(guān)突變檢測,FLT3-TKD，F(xiàn)ms樣酪氨酸激酶3-TK區(qū)域點突變，13q12，預(yù)后不良,CEBPA基因位于19q13.11，CCAAT盒/增強子結(jié)合蛋白，粒細胞分化過程中起