MICM檢測在惡性血液病中運用.ppt

MICM檢測在惡性血液病中的運用,曾雁玲,背景介紹,血液病是原發(fā)于造血系統(tǒng)的疾病，或影響造血系統(tǒng)伴發(fā)血液異常改變，以貧血、出血、發(fā)熱為特征的疾病。,出血性疾病,貧血癥,白細胞疾病,常見血液病,造血系統(tǒng)惡性腫瘤,惡性血液病類型,MICMFAB形態(tài)學診斷(Morphology)：包括血液和骨髓形態(tài)學及組織化學染色。免疫學檢查(Immunology)遺傳學檢查(Cytogenetics)分子生物學檢查(Molecular),檢測方法,一、形態(tài)學,是診斷的基礎，任何淋巴造血系統(tǒng)增生性疾病的診斷都離不開形態(tài)學診斷。形態(tài)學診斷技術包括細胞學：外周血、骨髓涂片組織學：骨髓活檢、血凝塊,外周血涂片檢測（血液病血常規(guī)）：用來觀察外周血細胞形態(tài)、數(shù)量。是對血液分析儀檢測的血常規(guī)的鏡下檢測補充。檢測內容包括：白細胞如粒細胞、單核細胞、淋巴細胞；紅細胞；血小板。,骨髓涂片檢測：1、骨髓增生程度，G:E，骨髓小粒及脂肪油滴有無及分度。2、粒細胞系統(tǒng)、紅細胞系統(tǒng)、淋巴細胞系統(tǒng)、單核細胞系統(tǒng)、巨核細胞系統(tǒng)、漿細胞系統(tǒng)以及其他細胞（網狀細胞、內皮細胞、纖維細胞、成骨細胞、破骨細胞、組織嗜堿細胞、退化細胞等）的形態(tài)及比例。血小板的情況。3、骨髓小粒4、有無轉移瘤和寄生蟲。,骨髓病理檢測：在高倍鏡下觀察骨髓的組織結構和各成分的分布及相互關系。,骨髓活檢和骨髓/血涂片,骨髓/血涂片,骨髓涂片細胞細微結構清楚評估紅系、粒系增生情況及幼稚細胞比例具有優(yōu)勢骨髓纖維化、細胞致密可干抽可做組織化學染色（如鐵染）對缺鐵性貧血、慢性疾病引起的貧血、巨幼細胞性貧血、和急性白血病的診斷尤其有幫助。,骨髓活檢,骨髓活檢顯示骨髓的組織結構和各成分的分布及相互關系，對巨核細胞的評估具有優(yōu)勢不存在干抽和骨髓稀釋可做免疫組織化學染色對再生障礙性貧血、低增生性白血病、淋巴瘤、轉移癌、骨髓增生性腫瘤的診斷具有重要價值,骨髓涂片看細胞、骨髓活檢看結構，相互補充相互驗證不能相互替代,血凝塊：廢物利用、骨髓活檢的補充,骨髓活檢常見問題,標本取材條件：要求穿刺1cm以上骨髓組織診斷不明確：取材部位是否有病灶保存液：10%福爾馬林固定,二、細胞組織化學染色,以形態(tài)學為基礎，運用化學或生物化學技術研究細胞內化學成分的分布及變化的檢測方法。對某些血液病的診斷、鑒別診斷、療效、判斷預后有一定的意義。,常用的細胞化學染色有：1、過氧化酶又稱髓過氧化酶(Myeloperoxidase，MPO或POX)：陽性為棕黑色。用于急性白血病的鑒別：急性粒細胞白血病為陽性，其中M3為強陽性，急性單核細胞白血病為弱陽性，急性淋巴細胞白血病為陰性。,2、非特異性酯酶（NSE）：包括中性非特異性酯酶（-NAE，棕黑色）、酸性非特異性酯酶（A-NAE，棕紅色），堿性非特異性酯酶（-NBE，棕紅色）。意義：急性單核細胞白血病強陽性，且能被氟化鈉抑制。急性粒細胞白血病弱陽性或陰性，不被氟化鈉抑制。,3、特異性酯酶（SE）：陽性紅寶石色顆粒。意義：急性粒細胞白血病陽性或強陽性。急性單核細胞白血病陰性。慢粒急粒變陽性增強。,4、蘇丹黑B染色（SBB）：陽性為黑色。意義：和POX基本一樣。,5、中性粒細胞堿性磷酸酶（NAP）：陽性為灰黑色或黑色。計算陽性率和積分值：陽性率：計數(shù)100個中性桿狀核和分葉核粒細胞，觀察其陽性細胞的個數(shù)，即為陽性率。(正常值40%)陽性指數(shù)：（+）1+（+）2+（+）3+（+）4的總和。（正常值40-80分）意義：升高見于嚴重感染，類白，急淋，骨纖，真紅，再障，ITP,淋巴瘤等。降低見于慢粒，急性粒細胞白血病，PNH。故可用于慢粒和類白、骨纖；再障和PNH；急粒和急淋的鑒別。,6、糖原染色（PAS）：陽性為紅色。可以計算陽性率和陽性指數(shù)。意義：（1）正常情況下，紅細胞系統(tǒng)的原、幼紅細胞和成熟紅細胞；粒細胞系統(tǒng)的原粒細胞、原單核細胞和大多數(shù)淋巴細胞為陰性反應。自早幼粒階段以后的粒細胞和幼單核細胞可呈弱陽性反應。（2）急淋、紅白血病、戈謝病的原始細胞呈強陽性反應或陽性反應；缺鐵性貧血、珠蛋白生成障礙、MDS亦可呈陽性反應；急性粒細胞白血病、急性單核細胞白血病、良性淋巴細胞增多癥、尼曼-皮克細胞呈陰性反應或弱陽性反應。巨幼細胞性貧血、溶血性貧血、再生障礙性貧血等幼紅細胞為陰性反應。偶有個別幼紅細胞呈陽性反應。（3）幫助鑒別不典型巨核細胞和霍奇金細胞，巨核細胞呈強陽性反應；霍奇金細胞呈弱陽性或陰性反應。（4）幫助鑒別白血病細胞和腺癌骨髓轉移的腺癌細胞，腺癌細胞呈陽性反應。,7、酸性磷酸酶染色（ACP）：陽性酶活性部位出現(xiàn)紅色沉淀，胞核為藍色。意義：1、鑒別戈謝細胞和尼曼-匹克細胞，前者陽性，后者為陰性。2、多毛細胞白血病為陽性反應，且耐L-酒石酸的抑制作用。淋巴肉瘤細胞和慢性淋巴細胞白血病的淋巴細胞，酸性磷酸酶染色也呈陽性反應，但此酸可被L-酒石酸抑制。3、T淋巴細胞呈陽性反應，而B淋巴細胞為陰性反應。,8、鐵染色（Fe染色）：陽性為淡綠色。細胞內鐵觀察有核紅細胞；細胞外鐵觀察骨髓小粒及網狀細胞。意義：（1）鐵低見于缺鐵性貧血；（2）鐵高見于再生障礙性貧血、巨幼紅細胞性貧血、白血病、感染和多次輸血病人；（3）環(huán)形鐵粒幼細胞（RS），環(huán)鐵大于15%，見于RAS。,鐵粒幼紅細胞定義,三、免疫分型,應用：1、確定系來源：利用不同系有特定的抗原表達可以確定髓系/B系/T/NK系/組織細胞和樹突狀細胞。2、確定細胞分化階段：不同發(fā)育階段細胞，其抗原表達不同。3、預后判斷：有些抗原表達和淋巴瘤/白血病預后相關，如白血病患者有CD7+與CD34+共表達，示預后不好。4、治療方法選擇-治療靶向5、療效判斷、復發(fā)監(jiān)測所以我們可以用于血液疾病的診斷如白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、MDS等；以及一些疾病的鑒別診斷如再障、ITP、MPD。運用于微小殘留病灶的監(jiān)測等。,常用的方法：流式細胞術和細胞免疫組織化學染色法。,白血病分類中免疫分型的應用與意義,常用的抗原：1、白血病系列分化抗原T淋巴細胞白血?。篊D3、CD5、CD7。B淋巴細胞白血?。篊D10、CD19、CD22。NK淋巴細胞白血?。篊D16、CD56、CD57。髓系白血?。篊D13、CD14、CD33、MPO（髓過氧化物酶）。紅白血?。篏lyA（血型糖蛋白A）。巨核細胞白血?。篊D41、CD42、CD61。,2.白血病系列非特異性抗原CD34、HLADR為早期細胞抗原，無系列特異性，可與CD38聯(lián)合運用于免疫分型。一般而言，干/祖細胞CD34、HLADR、CD38，原始細胞CD34、HLADR、CD38，而幼稚細胞（如早幼粒細胞）CD34、HLADR、CD38。,3、白細胞共同抗原CD45為白細胞共同抗原，其表達量在淋巴細胞最高，單核細胞，成熟粒細胞，早期造血細胞（blasts）依次減弱。紅細胞（中，晚幼紅細胞，成熟紅細胞）不表達CD45。用SSC/CD45PerCP雙參數(shù)分析可十分容易鑒別骨髓和血液中的原始或成熟細胞。,AML：,1、M0：其特征為T、B細胞標記的陰性（即CD19、CD20、CD22與CD3、CD5、CD7、CD10）。作為干、祖細胞標記的CD34、CD38和HLA-DR均為陽性，具有特征性的TdT標記應有至少30%的原始細胞會呈陽性表達。而髓系特征不能過多，通常是CD13、CD33、CD117中的任何一項呈陽性表達；CD68、MPO大多陰性。若髓系有兩個以上標記呈陽性，應考慮未成熟的急性髓細胞白血病。,2、M1：M1與M0相似不易區(qū)分，M1一般CD13、CD33、HLA-DR，但CD34表達少于M0，可能表達部分CD15。3、M2：M0與M1的主要區(qū)別是成熟度增加，CD15較M1較顯著，CD34弱于M1，CD13有時表達強于CD33，多數(shù)病例HLADR（-）。4、M3：高顆粒性，多數(shù)情況HLADR（-）或表達減少，CD34少于M2、一般CD13弱（），可有CD2表達。,5、M4與M5：兩型表型相似，但M4較M5表達更多的CD34（），重要的表型為CD13、CD33、HLADR、CD14和CD15，CD33可表達強于CD13；CD33（）、CD13（）、CD34（）很可能為M5，但只出現(xiàn)在少數(shù)病人中，部分M5可見CD56（）。,6、M6：M6較少見且特征不明顯，一般HLADR，CD34、CD13、CD33陽性。7、M7：巨核細胞白血病，在AML中少于1。一般CD61（Gpa）和/或CD41（Gpb-a）陽性，而注意由于血小板粘附造成的假陽性以及一些不明原因出現(xiàn)的假陰性。這時候可以借助于小巨核酶標（CD41免疫組織化學染色）,ALL：,WHO分型分為B祖細胞型，CD10或CD10，前B細胞型，B細胞型，T細胞型。,1、B祖細胞型ALL：FAB標準的L1或L2，一般TdT(+)HLA-DR(+)，CD19(+)，此型又分為2個亞型，CD10和CD10，前者預后好，多數(shù)病例CD24，CD34，CD20表達隨成熟度增加而增加。,2、前B細胞型ALL：一般為CD19，CD24，HLADR，胞漿CD22，CD10，TdT隨CD20變化，CD34多為陰性。,3、B細胞型ALL：即成熟B細胞型ALL；即FAB標準的L3，表型為CD19、CD20、CD22、CD24且sIg（多數(shù)為IGM）陽性，多數(shù)病例CD10。,4、TALL：表達CD1、CD2、CD5、CD7、CD4/CD8雙陽與極少膜表面CD3、TdT多為陽性。另一常見亞型為皮質早期表達CD2、CD5、CD7、TdT強表達。髓質期亞型表達CD2、CD5、CD7、與CD3CD4/CD3+CD8+,很少見TdT表達。,雜合型白血?。?隨著流式技術的廣泛應用，我們發(fā)現(xiàn)許多病例并不能嚴格劃分為淋系或髓系，真正的雙表型病人多為t(9；22)或（11q23），現(xiàn)在雜合型的誤診率很高。最重要的系特異性抗原在B系、T系、髓系分別為CD22、CD3和MPO。,即染色體異常包括染色體的結構和數(shù)量異常根據(jù)這些特征性的異常，對惡性血液病進行診斷和分類、預后分層及指導治療。,四、細胞遺傳學,核型描述,首先列出染色體總數(shù)，然后是性染色體組成，接著列出異常的染色體數(shù)目或形態(tài)。下列統(tǒng)一的命名符號：A-G染色體組的名稱1-22染色體編號X,Y性染色體del缺失der結構重排的染色體dup重復inv倒位t易位+/-在染色體符號前表示染色體增加或減少，在染色體符號后表示染色體多出或缺少一部分,人類23對染色體,上面的核型描述就是46，XY。例如46，XY，t(8;21)(q22;q22),（一）、染色體檢測在白血病中的意義,1950,1960,1970,1980,1990,2000,2010,確定染,色體數(shù)目=46,發(fā)現(xiàn)Ph；,發(fā)現(xiàn)+21,各種顯帶技術,出現(xiàn)；發(fā)現(xiàn)多數(shù)AL患者伴有染色體異常,FISH出現(xiàn)；闡明某些染色體異常的分子學改變,SKY,CGHPCR技術FLT3-ITD(1996)c-KIT突變（1993）.,芯片技術：cDNAarrayArray-CGH、SNP-array、測序技術的發(fā)展大量基因突變的發(fā)現(xiàn)：JAK2、NPM、CEBPA、PAX5、IKZF1、FLT3、RUNX1、WT1、RAS、NOTCH1.,新一代高,通量測序技術；各種遺傳學改變間的相互作用,血液腫瘤遺傳學研究的歷史,多數(shù)AML患者有非隨機性染色體改變，包括易位、,倒位、插入、缺失、擴增、等臂染色體等,染色體異常在AML診斷、分型、預后評價、發(fā)病機,制研究及靶向治療藥物研發(fā)方面有重要價值,一些特殊的細胞遺傳學異常在WHO分型建議中已被,列為特殊亞型,對不同細胞遺傳學類型的血液腫瘤患者進行個體化治,療可以獲得更好的療效,AML常見染色體異常,t(8;21)t(15;17),10%8%,inv(16)/t(16;16)11q23異常,5-10%3-5%,30,2045,單一異常：45%2種異常：55%,-5/5q-；-7/7q-；8；-Y；+11；+13；+21;+223q26；del(9q)t(6;9)；t(9;22)等,AML的WHO分型,伴再現(xiàn)性遺傳學異常的AML伴多系發(fā)育異常的AML繼發(fā)于MDS；無MDS病史,治療相關性AML,烷化劑相關；拓撲異構酶抑制劑相關；其它,無法分類的AML髓細胞肉瘤,Downs綜合征相關AML,伴再現(xiàn)性遺傳學異常的AML,AMLwitht(8;21)(q22;q22)AMLwithinv(16)(p13.1q22)ort(16;16)APLwitht(15;17)(q22;q12)AMLwitht(9;11)(p22;q23)AMLwitht(6;9)(p23;q34)AMLwithinv(3)(q21q26.2)ort(3;3)AML-M7witht(1;22)(p13;q13),RUNX1-RUNX1T1CBFB-MYH11PML-RARAMLLT3-MLLDEK-NUP214RPN1-EVI1RBM15-MKL1,?AMLwithmutatedNPM1?AMLwithmutatedCEBPA通常AML的診斷標準，原始細胞比例為20%，但如果t(8;21)、t(15;17)或inv(16)陽性，則不論原始細胞比例為多少，白血病診斷成立,AML染色體異常的預后分級,預后等級好中差,核型類型t(8;21)、t(15;17)、inv(16)正常、+8、+21、+22、del(9q)、del(7q)、t(9;11)(p13;q23)-5、del(5q)、-7、inv(3)、復雜異常、t(8;16)(p11;p13)、inv(3)(q21q26)、11q23異常（t(9;11)除外）、t(6;9)(p23;q34)等,（二）、染色體在MDS中的意義。已報道的MDS患者骨髓細胞染色體核型異常較多,其中以5、7、+8、5q、7q、11q、12q、20q較為多見。經過很多作者反復證實，MDS患者有無染色體異常以及異常的類型對于診斷分型、評估預后和治療決策都具有極為重要的意義,因此，細胞遺傳學檢查必須列為MDS常規(guī)檢測項目之一。,MDS的重現(xiàn)染色體異常,非平衡異常：+8，-7或del(7q),-5或del(5q),del(20q),-Y,i(17q)或t(17p),-13或del(13q),del(11q),del(12p)或t(12p),del(9q),idic(X)(q13)其中+8，del(20q),和-Y，在不符合形態(tài)學標準的情況下不能作為MDS的確診依據(jù)平衡異常：t(11;16)(q23;p13.3),t(3;21)(q26.2;q22.1),t(1;3)(p36.3;q21.1),t(2;11)(p21;q23),inv(3)(q21q26.2),t(6;9)(p23;q34),MDS預后判斷,MDS的國際預后積分系統(tǒng)（IPSS）,五、分子生物學檢測,分子診斷常用技術,核酸分子雜交技術熒光原位雜交（FISH）聚合酶鏈反應（PCR）技術實時熒光定量PCR、多重PCR技術基因測序Sanger測序法、二代測序技術,熒光原位雜交(FISH),生命科學中的“釣魚”技術原理：通過熒光標記的DNA探針與細胞核內的DNA靶序列雜交目的：獲得細胞內多條染色體或多種基因狀態(tài)的信息,熒光原位雜交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH）,FISH檢測BCR/ABL融合基因,BCR/ABL基因正常,BCR/ABL基因融合,9號,22號,雙色單融合探針，檢測染色體易位,abl,bcr,聚合酶鏈反應PCR,按照上述步驟重復操作，PCR產物呈指數(shù)擴增模板DNA擴增倍數(shù)T=2n(n:循環(huán)次數(shù)),Sanger測序法,DNA雙脫氧鏈終止法測序,各個平臺的特點,血液病分子診斷的意義,CBFB/MYH11AML1/ETOPML/RARaE2A/PBX1MLL/AF4BCR/ABLTEL/AML1SIL/TAL1EVI1HOX11MLL/AF10MLL-AF9MLL/ENLNPM1/ALKNPM/MLF1,MLL/ELLMLL/AFXMLL/AF1qMLL/AF1pPLZF/RARaMLL/AF6MLL/MLL（dupMLL）TLS/ERGTEL/PDGFRTEL/ABLSET/CANDEK/CANMLL/AF17E2A/HLFNPM/RARaAML1/MDS1,CBFB/MYH11：Inv(16)(p13q22)是急性髓系白血病(AML)特征性染色體異常，通常見于AML-M4Eo亞型，占總AML患者的10%，其中50發(fā)生在AML-M4Eo中。帶有Inv(16)(p13q22)的病人通常有較好的預后。該基因陽性的病人，可用于療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。,AML1/ETO：出現(xiàn)在所有的t(8,21)陽性的AML中，同時也出現(xiàn)在具有復雜移位的t(8,21)陰性的AML病例中。其主要出現(xiàn)在AML-M2這一亞型中，大約有20-40%病例具有t(8,21)。在非常少見的AML-M1，AML-M4和t-AML中也有報道。t(8,21)異位是一個較好的標志，它的存在使這類病例對一些藥物有較好的反應。因此基于細胞遺傳學和分子遺傳學的檢測結果，可以為病人選擇風險低的較好的治療方案。該基因陽性的病人，可用于療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。,PML/RARa：t(15,17)易位是APL的一個典型標志，其易位造成了15號染色體上的PML基因和17號染色體上的RARa基因的融合，產生了一個融合基因PML/RARa。檢測PML/RARa融合基因的存在與否，對APL的診斷，判斷ATRA的療效和預后復發(fā)都非常重要。PML/RARa陽性強烈預示著復發(fā)的可能，而其持續(xù)性陰性則預示病人有更長的生存期。該基因陽性的病人，可用于療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。,PLZF/RARa：t(11;17)(q23;q21)易位，特定的在急性早幼粒白血病或急性非淋巴細胞白血病M3型中發(fā)現(xiàn)。功能尚不明確。預后明顯差與有t(15;17)易位的ANLLM3型，其對ATRA的化療無反應。NPM/RARa:t(5;17)(q35;q22)易位發(fā)生于急性非淋巴細胞白血病，見于M3，即急性早幼粒細胞白血病。病例少，有記載的只有2例兒童病例，2例的復發(fā)時間都短，預后可能不樂觀。,BCR/ABL：在超過95%的CML病人的白血病細胞中，30%（20-50%）的成人ALL和2-10%的兒童ALL中，以及小于2%的淋巴瘤和骨髓瘤的病例中有BCR/ABL融合基因。在CML中BCR/ABL大部分是p210型的，少許p190，極少數(shù)p230。ALL患者的BCR/ABL融合基因是p190型（60%）。在ALL中，Ph陽性和隨之出現(xiàn)的BCR/ABL融合基因是一個非常不好的標志，它影響著病人血相的完全緩解率和可能的生成率。該基因陽性的病人，可用格列衛(wèi)進行治療，并可進行療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。,E2A/PBX1：t(1:19)的ALL中檢測到，尤其是前B-ALL病例中。臨床癥狀都比較兇險。該基因陽性的病人，可用于療效監(jiān)測和微小殘留的檢測。MLL/AF4：見于與t(4;11)相關的前BALL。預后不良但該融合基因的存在似乎能增強高劑量的Ara-C的療效?？捎糜诏熜ПO(jiān)測和微小殘留的檢測。TEL/AML1：見于t(12;21)(p13;q22)兒童ALL。都是前B細胞ALL。其白細胞比較低。預后較好，復發(fā)較遲?？捎糜诏熜ПO(jiān)測和微小殘留的檢測。EVI1：定位于染色體3q26。見于MDS和CML。預后不良，,MLL/ELL:t(11;19)(q23;p13.1)占11q23異常的3.8%，為AML特征性異常，年齡以成人為主。白細胞20109/L，F(xiàn)AB分型M4或M5，預后不良，2年無病生存率50%。NPM/MLF1：t(3;5)(q25.1;q34)易位，在MPS,MDS,ANLL（M2,M4,M6）中有發(fā)現(xiàn)。預后非常差1，中位生存期少于1年。,FLT3-ITD，F(xiàn)ms樣酪氨酸激酶3-內服串聯(lián)重復序列，13q13.1NPM1，核仁磷酸蛋白1，5q35,急性髓系白血病,急髓相關突變檢測,FLT3-TKD，F(xiàn)ms樣酪氨酸激酶3-TK區(qū)域點突變，13q12，預后不良,CEBPA基因位于19q13.11，CCAAT盒/增強子結合蛋白，粒細胞分化過程中起