課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片斷.ppt

專題5DNA和蛋白質技術課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片斷,分子生物學研究中最強大的實驗技術之一其本質是在體外模擬胞內DNA分子復制的過程,美國科學家穆利斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術1993年諾貝爾獎,.DNA分子的結構,C、H、O、N、P,1.元素組成：,脫氧核苷酸(dNMP),2.基本單位:,一.基礎知識,脫氧核苷酸,脫氧核苷,磷酸,脫氧核糖,含氮堿基,嘌呤,嘧啶,腺嘌呤（A）,鳥嘌呤（G）,胞嘧啶（C）,胸腺嘧啶（T）,一個核苷酸上的磷酸基團上的“OH”和另一個核苷酸分子的第3位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二酯鍵，即在相鄰的兩個脫氧核苷酸的3和5碳原子之間形成磷酸二酯鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3、5、磷酸二酯鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“OH”末端稱為3端，而磷酸基團的末端稱為5端,3.脫氧核苷酸鏈的形成,脫氧核苷酸鏈結構簡圖,4.DNA分子的雙螺旋結構,.DNA分子是由的（即一條鏈為35，另一條鏈為53）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則結構。,.與交替連結，排列在外側，構成基本骨架；排列在鏈的內側。,.兩條鏈上的堿基通過連結起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與配對，一定同胞嘧啶配對。,雙螺旋,兩條反向平行,脫氧核糖,磷酸,堿基,氫鍵,胸腺嘧啶,鳥嘌呤,2、時期,有絲分裂間期或減數(shù)第一次分裂前的間期,3、場所,細胞核（主）（線粒體、葉綠體）,4、模板,DNA母鏈,1、概念,由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程,.DNA的復制,5、原材料,脫氧核苷酸,6、基本條件,酶、ATP、原料、模板,7、復制過程,DNA的解旋,親代DNA分子利用細胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈,RNA引物的合成,以單股DNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物。,DNA的生成,以單股的DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5端3端合成DNA。,邊解旋邊復制(過程）,8、復制特點,半保留復制（結果）,9、遵循原則,堿基互補配對原則,10、精確復制的原因,11、復制的意義,DNA分子通過復制使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性。,規(guī)則的雙螺旋結構為復制提供了精確的模板,堿基互補配對能力保證了復制準確無誤的進行,總結：胞內DNA復制的基本體系,打開DNA雙鏈提供DNA復制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3端開始連接脫氧核苷酸,.PCR(多聚酶鏈式反應）,2.DNA聚合酶特性,不能從頭合成DNA，只能從DNA的3端開始延伸DNA鏈，因此，DNA復制需要引物。,3.DNA聚合酶作用過程,當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，DNA聚合酶就能從引物的3端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸。,1.定義：是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。能以極少量的DNA為模板，在幾小時內復制出上百萬份的DNA拷貝。,時間（min）,溫度,（）,適溫延伸,高溫變性,低溫復性,重復13步30輪,DNA雙鏈,單鏈,變性（加熱80-100）,復性（緩慢冷卻）,4.PCR原理,.在80100C的溫度范圍內，DNA的雙螺旋結構將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性。,.當溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結合成雙鏈。,.PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合，現(xiàn)在使用的PCR儀實質上也是一臺能夠自動調控溫度的儀器。,高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術的自動化。,5.TaqDNA聚合酶的應用,6.需要為PCR反應提供的物質,緩沖液、DNA模板，分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行。,PCR技術是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出。,7.PCR技術的特點：,8.細胞內和細胞外DNA復制環(huán)境的區(qū)別,細胞內源,引物合成酶,細胞內的環(huán)境,細胞內源,細胞內源,外源加入,緩沖液,外源加入,外源加入,外源加入,.PCR過程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長度通常為2030個脫氧核苷酸,9.細胞內復制和PCR不同點,.PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的,10.PCR的重要應用：廣泛應用于遺傳病的診斷、刑偵破案、古生物學、基因克隆和DNA序列測定等。,1、PCR儀,.設備及用具,實質上一臺能夠自動調控溫度的儀器。,二.PCR的實驗操作,2、微量離心管,一種薄壁塑料管，總容積為0.5ml,3、微量移液器,用于定量轉移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。,1.準備,2.移液,.實驗操作步驟,按照PCR反應體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上。,用微量移液器按照PCR反應體系配方往微量離心管里面加入各種試劑。,混合后蓋嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。,3.混合,過程：將微量離心管放在離心機上,離心約10s。,4.離心,離心目的：使反應液體集中在離心管底部，提高反應效果。,將離心管放入PCR儀上，設置好PCR儀的循環(huán)程序。,5.反應,PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟變性、復性和延伸.,.變性（模板DNA解旋）,模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結合，為下輪反應作準備。,.復性（退火）,模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。,.延伸,DNA模板引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補配對的原則與半保留復制的原理，合成一條新的DNA鏈。,PCR循環(huán)第一步：高溫變性,PCR技術高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：,6.注意事項,隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；,分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭,.理論上DNA擴增數(shù)目的計算,三.課題成果評價,1.一條DNA，復制n次，DNA為2n,2.a條DNA，復制n次，DNA為a2n,.實驗中DNA含量的測定,1.原理,可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關。,2.過程,.稀釋,2uLPCR反應液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋.,.對照調零,以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調節(jié)至零。,取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值,.計算,.計算,DNA含量(g)50(260nm的讀數(shù))稀釋倍數(shù),50：1g/ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02,光吸收,波長nm,260,240,220,280,0.1,0.2,比色杯,四.課題延伸,例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）,PCR技術是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出特點,五.實驗小結,PCR儀加熱使（）變性,復性使引物與模板DNA（）,延伸需將反應溫度升至中溫(),在（）的作用下,以（）為原料,以（）為復制的起點,合成新鏈。如此重復改變反應溫度,經(jīng)（）三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴增產(chǎn)物進行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。,模板,互補,Taq聚合酶,四種脫氧核苷酸,引物,變性、復性和延伸,72,練習(課堂檢測),1、DNA單鏈的_末端為3端,_末端為5端,在DNA復制時,引物從模板鏈的_端配對結合.在_酶的作用下,從引物的_端,使子鏈向下延伸.2每次循環(huán)可以分為_這三個過程,對應溫度分別為_.,磷酸基團,羥基,羥基,DNA聚合,3/,變性、復性、延伸,94、55、72,90以上、50左右、72左右,練習鞏固,1、關于PCR技術的應用，錯誤的一項是A古生物學、刑偵破案、DNA序列測定B診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學CDN