課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片斷.ppt

專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片斷,分子生物學(xué)研究中最強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一其本質(zhì)是在體外模擬胞內(nèi)DNA分子復(fù)制的過程,美國(guó)科學(xué)家穆利斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術(shù)1993年諾貝爾獎(jiǎng),.DNA分子的結(jié)構(gòu),C、H、O、N、P,1.元素組成：,脫氧核苷酸(dNMP),2.基本單位:,一.基礎(chǔ)知識(shí),脫氧核苷酸,脫氧核苷,磷酸,脫氧核糖,含氮堿基,嘌呤,嘧啶,腺嘌呤（A）,鳥嘌呤（G）,胞嘧啶（C）,胸腺嘧啶（T）,一個(gè)核苷酸上的磷酸基團(tuán)上的“OH”和另一個(gè)核苷酸分子的第3位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二酯鍵，即在相鄰的兩個(gè)脫氧核苷酸的3和5碳原子之間形成磷酸二酯鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3、5、磷酸二酯鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“OH”末端稱為3端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5端,3.脫氧核苷酸鏈的形成,脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖,4.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu),.DNA分子是由的（即一條鏈為35，另一條鏈為53）脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤旋而成的規(guī)則結(jié)構(gòu)。,.與交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；排列在鏈的內(nèi)側(cè)。,.兩條鏈上的堿基通過連結(jié)起來，形成堿基對(duì)。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與配對(duì)，一定同胞嘧啶配對(duì)。,雙螺旋,兩條反向平行,脫氧核糖,磷酸,堿基,氫鍵,胸腺嘧啶,鳥嘌呤,2、時(shí)期,有絲分裂間期或減數(shù)第一次分裂前的間期,3、場(chǎng)所,細(xì)胞核（主）（線粒體、葉綠體）,4、模板,DNA母鏈,1、概念,由一個(gè)DNA形成兩個(gè)完全相同的DNA的過程,.DNA的復(fù)制,5、原材料,脫氧核苷酸,6、基本條件,酶、ATP、原料、模板,7、復(fù)制過程,DNA的解旋,親代DNA分子利用細(xì)胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈,RNA引物的合成,以單股DNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物。,DNA的生成,以單股的DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5端3端合成DNA。,邊解旋邊復(fù)制(過程）,8、復(fù)制特點(diǎn),半保留復(fù)制（結(jié)果）,9、遵循原則,堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,10、精確復(fù)制的原因,11、復(fù)制的意義,DNA分子通過復(fù)制使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性。,規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板,堿基互補(bǔ)配對(duì)能力保證了復(fù)制準(zhǔn)確無誤的進(jìn)行,總結(jié)：胞內(nèi)DNA復(fù)制的基本體系,打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3端開始連接脫氧核苷酸,.PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）,2.DNA聚合酶特性,不能從頭合成DNA，只能從DNA的3端開始延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物。,3.DNA聚合酶作用過程,當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸。,1.定義：是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。,時(shí)間（min）,溫度,（）,適溫延伸,高溫變性,低溫復(fù)性,重復(fù)13步30輪,DNA雙鏈,單鏈,變性（加熱80-100）,復(fù)性（緩慢冷卻）,4.PCR原理,.在80100C的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為變性。,.當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈。,.PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實(shí)質(zhì)上也是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。,高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動(dòng)化。,5.TaqDNA聚合酶的應(yīng)用,6.需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì),緩沖液、DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時(shí)通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。,PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出。,7.PCR技術(shù)的特點(diǎn)：,8.細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外DNA復(fù)制環(huán)境的區(qū)別,細(xì)胞內(nèi)源,引物合成酶,細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境,細(xì)胞內(nèi)源,細(xì)胞內(nèi)源,外源加入,緩沖液,外源加入,外源加入,外源加入,.PCR過程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長(zhǎng)度通常為2030個(gè)脫氧核苷酸,9.細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和PCR不同點(diǎn),.PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對(duì)反應(yīng)溫度的控制來實(shí)現(xiàn)的,10.PCR的重要應(yīng)用：廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測(cè)定等。,1、PCR儀,.設(shè)備及用具,實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。,二.PCR的實(shí)驗(yàn)操作,2、微量離心管,一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml,3、微量移液器,用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。,1.準(zhǔn)備,2.移液,.實(shí)驗(yàn)操作步驟,按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上。,用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑。,混合后蓋嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。,3.混合,過程：將微量離心管放在離心機(jī)上,離心約10s。,4.離心,離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果。,將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。,5.反應(yīng),PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個(gè)基本步驟變性、復(fù)性和延伸.,.變性（模板DNA解旋）,模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。,.復(fù)性（退火）,模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。,.延伸,DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈。,PCR循環(huán)第一步：高溫變性,PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)，PCR操作時(shí)要注意做到：,6.注意事項(xiàng),隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；,分裝試劑，簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性槍頭,.理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算,三.課題成果評(píng)價(jià),1.一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n,2.a條DNA，復(fù)制n次，DNA為a2n,.實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定,1.原理,可以通過計(jì)算DNA含量來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)。,2.過程,.稀釋,2uLPCR反應(yīng)液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋.,.對(duì)照調(diào)零,以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。,取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值,.計(jì)算,.計(jì)算,DNA含量(g)50(260nm的讀數(shù))稀釋倍數(shù),50：1g/ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02,光吸收,波長(zhǎng)nm,260,240,220,280,0.1,0.2,比色杯,四.課題延伸,例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個(gè)拷貝（109拷貝）,PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出特點(diǎn),五.實(shí)驗(yàn)小結(jié),PCR儀加熱使（）變性,復(fù)性使引物與模板DNA（）,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(),在（）的作用下,以（）為原料,以（）為復(fù)制的起點(diǎn),合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,經(jīng)（）三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶。,模板,互補(bǔ),Taq聚合酶,四種脫氧核苷酸,引物,變性、復(fù)性和延伸,72,練習(xí)(課堂檢測(cè)),1、DNA單鏈的_末端為3端,_末端為5端,在DNA復(fù)制時(shí),引物從模板鏈的_端配對(duì)結(jié)合.在_酶的作用下,從引物的_端,使子鏈向下延伸.2每次循環(huán)可以分為_這三個(gè)過程,對(duì)應(yīng)溫度分別為_.,磷酸基團(tuán),羥基,羥基,DNA聚合,3/,變性、復(fù)性、延伸,94、55、72,90以上、50左右、72左右,練習(xí)鞏固,1、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是A古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測(cè)定B診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)CDN