實(shí)驗(yàn)3植物葉片活細(xì)胞和葉綠體的分離提取及觀察ppt課件

實(shí)驗(yàn)四植物葉片活細(xì)胞和葉綠體的分離提取及觀察 CollegeofLifeScienceandTechnology XINJIANGUnivercity 一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?初步掌握運(yùn)用機(jī)械法分離活細(xì)胞和細(xì)胞器的方法 掌握運(yùn)用差速離心或密度梯度離心分離純化葉肉細(xì)胞 細(xì)胞核 葉綠體的方法 掌握分離的細(xì)胞的活性鑒別方法 熟悉葉肉細(xì)胞或原生質(zhì)體 細(xì)胞核 葉綠體的形態(tài)大小 二 實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞器的分離是研究細(xì)胞器的結(jié)構(gòu) 功能和化學(xué)組成的技術(shù)基礎(chǔ) 保持分離的細(xì)胞器的純度 結(jié)構(gòu)完整及其生理 生化活性是本實(shí)驗(yàn)的三大要素 細(xì)胞核是植物細(xì)胞中最大 最重要的細(xì)胞器 使細(xì)胞各種生命活動(dòng)的指揮中心 葉綠體是植物細(xì)胞進(jìn)行光合作用 將光能轉(zhuǎn)變成化學(xué)能的重要細(xì)胞器 由于它們的重要功能 所以它們一直是細(xì)胞生物學(xué) 遺傳學(xué) 和分子生物學(xué)研究的重要對(duì)象 利用離心技術(shù)可分離 純化細(xì)胞 細(xì)胞核和葉綠體 將組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進(jìn)行差速離心 是分離各種細(xì)胞器的常用方法 顆粒在離心場(chǎng)中的沉降速率取決于顆粒的大小 形狀和密度 也與離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān) 在一給定的離心場(chǎng)中 一定時(shí)間內(nèi) 密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同 依次增加離心力和離心時(shí)間 能使非均一懸浮液中的顆粒按其大小 密度先后分批沉降在離心管底部 分批收集即可獲得各種亞細(xì)胞組分 最先沉淀的是細(xì)胞 其次是細(xì)胞核 接下來是葉綠體 懸浮介質(zhì)通常用緩沖的等滲溶液 它與細(xì)胞質(zhì)的分散相接近 在一定程度上能保持細(xì)胞器的真實(shí)結(jié)構(gòu)和酶的活性 二 實(shí)驗(yàn)原理 三 實(shí)驗(yàn)用具和試劑 1 儀器 組織搗碎機(jī) 高速冷凍離心機(jī) 托盤天平 普通光學(xué)顯微鏡 剪刀 培養(yǎng)皿 250ml燒杯 量筒 玻璃漏斗 移液管 離心管 滴管 濾紙 紗布一大塊或400目尼龍網(wǎng) 載玻片 蓋玻片 2 試劑 SNT溶液 0 4M蔗糖 0 01MNaCl 0 05MTris HCL緩沖液 0 2MTris 三羥甲基氨基甲烷 50ml0 1NHCL50 55ml兩液混勻后 加蒸餾水至200ml pH7 6 1 3000中性紅染液 稱取0 5中性紅溶于50mlRinger溶液 稍加熱 30 400C 使之很快溶解 用濾紙過濾 裝入棕色瓶于暗處保存 否則易氧化沉淀 失去染色能力 臨用前 取已配制的1 中性紅溶液1ml 加入29mlRinger溶液混勻 裝入棕色瓶備用 香柏油3 材料 新鮮菠菜 三 實(shí)驗(yàn)用具和試劑 四 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1 組織勻漿液的制備 組織搗碎法 2 細(xì)胞及細(xì)胞器 細(xì)胞核 葉綠體等 的分離 純化 離心分離法 3 細(xì)胞 細(xì)胞核 葉綠體的鏡檢 根據(jù)形態(tài) 大小 分布位置 數(shù)量識(shí)別法 4 分離細(xì)胞活性的鑒別 中性紅活體染色法 五 實(shí)驗(yàn)方法和步驟 1 取材 取新鮮的嫩菠菜葉 洗凈擦干后 除葉梗及粗脈 剪成0 5x0 5cm小塊 2 勻漿 將稱取60g葉片小塊放入組織搗碎機(jī)套筒內(nèi) 加入200mlSNT溶液 勻漿20秒 最高速度 制成勻漿液 3 過濾 將勻漿液經(jīng)四層紗布過濾 或400目尼龍網(wǎng)過濾 濾液分裝離心管 平衡 4 離心 濾液 200 g 1000rpm 分 1分 沉淀1上清 平衡 離心 含葉肉細(xì)胞 500 g 1500rpm 分 1分 沉淀2 含細(xì)胞核 上清 平衡 離心 1000 g 3000rpm 分 5分 沉淀3上清 棄 含大量葉綠體 5 懸浮 分別收集沉淀 用少量的SNT溶液分別將沉淀1 2 3懸浮 6 鏡檢 取懸浮液1 2分別做滴片鏡檢 然后加幾滴中性紅染色5 10min 蓋上蓋玻片鏡檢 取懸浮液3做滴片蓋上蓋玻片 用油鏡觀察 六 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1 在普通光學(xué)顯微鏡下 在懸浮液1滴片中可以看到含細(xì)胞核和大量葉綠體的葉肉細(xì)胞 形態(tài)為球形或橢圓形的原生質(zhì)體 2 在普通光學(xué)顯微鏡下 在懸浮液2滴片中可以看到細(xì)胞核 形態(tài)為球形 3 在普通光學(xué)下 在懸浮液1 2滴片中性紅染色可以鑒別活細(xì)胞及細(xì)胞核 中性紅是液泡系特殊的活體染色劑 在細(xì)胞處于生活狀態(tài)時(shí) 中性紅只將液泡染成紅色 而細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核不著色 如果細(xì)胞死亡 紅色會(huì)彌散在整個(gè)細(xì)胞中 4 在普通光學(xué)顯微鏡下 在懸浮液3滴片中可以看到葉綠體 葉綠體為綠色橢圓形 在高倍鏡下可以看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒 即基粒 七 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 1 細(xì)胞和各種細(xì)胞器的分離應(yīng)在等滲溶液中進(jìn)行 以免滲透壓的改變使細(xì)胞和細(xì)胞器的受到損傷 2 要注意整個(gè)實(shí)驗(yàn)的分離過程必須在0 5 的條件下進(jìn)行 避免酶的失活 如果在室溫下 要迅速分離和觀察 3 離心過程中要注意離心力和離心時(shí)間 得到結(jié)構(gòu)真實(shí) 完整并具生理 生化活性的細(xì)胞器應(yīng)注意的問題 八 實(shí)驗(yàn)作業(yè) 1 繪制出一個(gè)完整的葉肉細(xì)胞圖 內(nèi)含細(xì)胞核 葉綠體 2 得到結(jié)構(gòu)真實(shí) 完整并具生理 生化活性的細(xì)胞器應(yīng)注意哪些問題 談?wù)凷NT溶液中的各種成分的作用 3 分離各種細(xì)胞器所需的相對(duì)離心