基因操作技術(shù)重點考綱.doc

學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò)，僅供參考1. 載體的定義？ 載體：指攜帶外源基因進入受體細(xì)胞的運載工具，它的本質(zhì)是DNA復(fù)制子。2. 載體必須具備的3個基本條件?載體的堿基對越多越好？（1） 基本條件：1具有復(fù)制子，能在宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制，并攜帶重組DNA分子一同擴增；（2） 2具有單一限制性內(nèi)切酶的酶切位點或多克隆位點；（3） 3有合適的選擇標(biāo)記基因，用來篩選重 組DNA。3. 載體的堿基對越少越好，否則容易錯配.4. 目前研究最深，使用最多的載體有？ 目前研究最深、使用最多的載體是經(jīng)過改造的質(zhì)粒載體和噬菌體載體。5. 按功能分，有哪些載體？克隆載體的概念？表達(dá)載體的概念？ （1）按功能分，可分為克隆載體、表達(dá)載體、測序載體、轉(zhuǎn)化載體、穿梭載體、多功能載體等。（2）克隆載體：攜帶插入外源片段的質(zhì)?；蚴删w，從而產(chǎn)生更多物質(zhì)或蛋白質(zhì)的產(chǎn)物。（3）表達(dá)載體：在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件（如啟動子、PBS、終止子），使目的基因能夠表達(dá)的載體。6. 選擇標(biāo)記有哪些？插入失活、a-互補是什么意思？ （1）選擇標(biāo)記有插入失活和a-互補（2）插入失活:若把外源DNA片段插入到載體的選擇標(biāo)記基因中而使基因失活，喪失其原有的表性特征。（3）a-互補：單獨存在的a及w片段均無半乳糖苷酶活性，只有宿主細(xì)胞與克隆載體同時共表達(dá)兩片段時，宿主細(xì)胞內(nèi)才有半乳糖苷酶活性，使特異性作用物變?yōu)樗{(lán)色化合物。7. 列舉常用的質(zhì)粒載體名稱？ PBR322質(zhì)粒、PUC載體、TA克隆載體8. 噬菌體的溶原狀態(tài)是指？ 噬菌體感染大腸桿菌時，可能進入一個溶菌循環(huán)，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞的裂解，釋放出噬菌體顆 粒；或者進入與宿主不同程度的穩(wěn)定狀態(tài)。9. 噬菌體DNA由哪三個部分組成？目的基因插入哪個部分？ （1）噬菌體DNA由左臂、中臂、右臂三部分組成。（2）目的基因插入中臂（非必須區(qū)）部分。10. 超級載體的特點？有哪些超級載體？ 1）超級載體的特點：運載量大（2)超級載體：YACs、BACs11. 表達(dá)載體與克隆載體有什么最大的區(qū)別？ 表達(dá)載體有強大的啟動子和SD序列，而克隆載體沒有12. 限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶：能識別DNA分子上的特定位點并將雙鏈DNA切斷的酶13. DNA連接酶，T4連接酶 DNA連接酶：一種能夠在兩條DNA鏈之間催化5-P和3-OH形成磷酸二酯鍵的酶 T 4連接酶：連接黏性末端或平末端的酶14. DNA聚合酶，Taq聚合酶 DNA聚合酶：催化脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）聚合成DNA的酶 Taq聚合酶：從嗜熱水生菌中分離純化出來的 15. 逆轉(zhuǎn)錄酶 逆轉(zhuǎn)錄酶：又稱依賴于RNA的DNA聚合酶，是分子生物學(xué)中最重要的核酸酶之一。16. 核酸酶，DNase,Rnase 核酸酶：通過切割相鄰兩個核糖酸殘基之間的磷酸二酯鍵，從而導(dǎo)致核酸分子發(fā)生水解斷裂的蛋白酶 DNase:即脫氧核糖核酸酶，特異水解斷裂DNA分子的酶 RNase:即核糖核酸酶，專門水解斷裂RNA分子的酶17. 堿性磷酸酶，細(xì)菌性/小牛腸堿性磷酸酶 堿性磷酸酶：有兩種不同來源的堿性磷酸酶：一種是從大腸桿菌中純化出來的，叫做細(xì)菌堿性磷酸酶；一種是從小牛腸中純化出來的，叫做小牛腸堿性磷酸酶。它們能催化核酸分子脫掉5磷酸基團，從而使DNA或RNA片段的5-P末端轉(zhuǎn)換成5-OH末端。 細(xì)菌堿性磷酸酶：一種是從大腸桿菌中純化出來的，叫做細(xì)菌堿性磷酸酶 小牛腸堿性磷酸酶：一種是從小牛腸中純化出來的，叫做小牛腸堿性磷酸酶18. DNA與基因的區(qū)別？ 基因是有遺傳功能的DNA片段19. DNA的鏈?zhǔn)峭ㄟ^什么方式連接的？兩條DNA單鏈?zhǔn)峭ㄟ^什么鍵連接在一起的？ （1）磷酸二酯鍵；（2）氫鍵20. DNA中四種堿基對的名稱？ A（腺嘌呤）、G（鳥嘌呤）、C（胞嘧啶）、T(胸腺嘧啶）21. DNA和RNA的區(qū)別？ （1）DNA是脫氧核糖核酸；RNA是核糖核酸；（2）這兩種核糖的區(qū)別在于脫氧核糖2-碳原子上的羥基被脫了氧，只剩下H，這個區(qū)別使得DNA比RNA更具有化學(xué)穩(wěn)定性22. 遺傳信息是如何表達(dá)（翻譯、傳遞）的？ P1823. mRNA,tRNA,rRNA的功能分別是什么？ mRNA功能：信使 tRNA功能：轉(zhuǎn)運 rRNA功能：核糖體RNA存儲24. 基因突變有哪幾種類型？ 染色體畸變(1.染色體結(jié)構(gòu)變異2.染色體數(shù)目變異)，點突變-基因突變(錯義突變、同義突變、無義突變)25. 操縱子的概念？ 概念：在細(xì)菌中，一組基因受一個啟動子控制，被轉(zhuǎn)錄成一個長的RNA分子，這樣的一組基因成為操縱子。26. 簡述乳糖操縱子的作用機理？P471、無乳糖時，調(diào)節(jié)基因lacI編碼阻遏蛋白，與操縱基因O結(jié)合后抑制結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄,不產(chǎn)生代謝乳糖的酶，使結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)。2、只有乳糖存在時,乳糖可與lac阻遏蛋白結(jié)合，而使阻遏蛋白不與操縱基因結(jié)合，誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，代謝乳糖的酶產(chǎn)生以代謝乳糖，使結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)。3、葡萄糖和乳糖同時存在時，葡萄糖與啟動子結(jié)合，不予理睬乳糖，不會使蛋白四聚體失活，結(jié)構(gòu)基因無法表達(dá)。4、有葡萄糖沒乳糖存在時，葡萄糖與啟動子結(jié)合，抑制結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，不產(chǎn)生代謝乳糖的酶，使結(jié)構(gòu)基因不發(fā)生表達(dá)。27.增強子的概念？沉默子的概念？ 增強子的概念：能強化轉(zhuǎn)錄起始的一段DNA序列為增強子或強化子 沉默子的概念：也稱為沉默子元件，能夠同反式因子結(jié)合從而阻斷增強子及反式激活因子的作用，并最終抑制該基因的轉(zhuǎn)錄活性。27. 真核生物，原核生物，病毒的基因組特點？ 真核生物基因組的特點：1基因組通常比較大2）含有內(nèi)含子序列3）有大量重復(fù)序列4）表達(dá)調(diào)控較復(fù)雜(有細(xì)胞核、堿基對最多） 原核生物基因組的特定：1)染色體不與組蛋白結(jié)合2)不同生活習(xí)性下原核生物基因組大小與GC含量有關(guān)(有擬核，堿基對第二多) 病毒基因組的特點：1）種類單一2）單倍數(shù)基因組，每個基因在病毒中只出現(xiàn)一次3）形式多樣4）大小不一5）基因重疊6）動物、細(xì)菌病毒與真核、原核基因相似，內(nèi)含子7）具有不規(guī)則的結(jié)構(gòu)基因8）基因編碼區(qū)無間隔，通過宿主及病毒本身酶切9）無帽狀結(jié)構(gòu)10）結(jié)構(gòu)基因沒有翻譯起始序列(DNA、RNA 堿基對最少）28. 基因操作基本步驟？ 1.用PCR或人工合成的方法擴增目的基因。擴 2.用限制性內(nèi)切酶將目的基因與載體切開。切 3.將目的基因與運載體結(jié)合。接 4.將重組DNA引入受體細(xì)胞。轉(zhuǎn) 5.培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使其大量擴增。增 6.篩選含有重組DNA分子的受體細(xì)胞。檢29. 目的 基因分離有哪些方法？分別有什么樣的特點？ 分離方法：1）鳥槍法2）反轉(zhuǎn)錄法3）人工合成法特點1）鳥槍法：操作簡單，廣泛使用，工作量大，盲目有時并非一個基因 2）反轉(zhuǎn)錄法：專一性強，操作過程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定要求的技術(shù)條件高 3）人工合成法：專一性強，僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因30. PCR技術(shù)的目的是什么？操作的步驟和各步驟中發(fā)生的反應(yīng)分別是什么？ PCR技術(shù)的目的是：通過重復(fù)循環(huán)變性、退火、延伸三個基本反應(yīng)將所需目的基因在體外成千上百萬倍的擴增。 操作步驟：循環(huán)變性退火延伸 反應(yīng)：循環(huán)變形：通過加熱使模版DNA完全變性成為單鏈同時引物自身和引物之間存在 的局部雙鏈也得以消除 退火：將溫度下降至適宜溫度，使引物與模版DNA退火結(jié)合 延伸：將溫度升高，熱穩(wěn)定后DNA聚合酶以dNTP為底物催化合成新的DNA鏈31. 基因操作的理想載體是什么？ 理想載體：質(zhì)粒、噬菌體、柯斯質(zhì)粒32. DNA/RNA提取過程中有哪些注意事項? DNA提取注意事項：1)DNA樣品不純2)DNA降解3)DNA提取量RNA 提取注意事項：1）RNA樣品不純2）RNA得率低3）RNA容易降解P80/P8433. 什么原因?qū)е缕洳患?？對策?4. 什么原因?qū)е碌寐实停繉Σ撸?P80 8435. 什么原因?qū)е陆到?？對策?6. 簡述常見的核酸檢測方法？ 1）紫外光譜分析法2）熒光分光光度法3）凝膠電泳法P8537. 純DNA的00260/280？純RNA的00260/280？ 純DNA的OD260/OD280應(yīng)大于1.8 純RNA的OD260/OD280應(yīng)達(dá)到2.038. 熒光分光光度法的特點？ 靈敏度高2）信息多3）專一性強4.工作曲線的線性范圍寬39. 凝膠電泳法的大致機理？ 機理：通過流通電流使物質(zhì)在電泳板正負(fù)極中游動而形成的譜帶位置與標(biāo)準(zhǔn)品相比較從而判斷檢測的物質(zhì)。40. 影響核酸保存的關(guān)鍵因素？ 1、保存液的酸堿度 2、保存濕度P8841. 提純的核酸如何保存？ 固態(tài)核酸通常在0以上低溫干燥保存即可。小分子核酸保存溫度還可以更低一些。 液態(tài)核酸室溫容易變性，短期最好低溫（4攝氏度）保存。42. 遺傳物質(zhì)提取過程中有哪些常見的緩沖溶液？ EDTA Tris-Hcl TAE TBE TE43. 核酸提取的兩個原則？ 1.應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性 2.排除其他分子的污染44. 核酸提取應(yīng)注意哪些問題？ 1.操作簡單2.不要降解(物理、化學(xué)、生物)45. 核酸提取的基本步驟？ 破碎、提取、純化46. 常見細(xì)胞的裂解方式？ 1、物理法 超聲波、研磨法或勻漿法 2、化學(xué)法 EDTA或SDS 3、酶解法47. 常見樣本的提取方法？ 1.濃鹽法 2.有機溶劑抽提法 3.密度梯度離心法48. 吸附材料結(jié)合有哪些常用的介質(zhì)？ 硅質(zhì)材料，陰離子交換樹脂，磁珠49. 去除DNA中的RNA用什么酶？去除RNA中的DNA用什么酶？去除蛋白質(zhì)用什么酶？RNase DNase 蛋白酶K50. 核酸提取過程中有一步叫酚-氯仿處理的過程，酚、氯仿、異戊醇的作用分別是什么？酚：蛋白質(zhì)變性劑氯仿：分離更徹底，除去氯仿異戊醇：消泡劑51. 為什么堿變性是可以從細(xì)菌中提取質(zhì)粒？ 細(xì)胞基因DNA是線性的，把ph升至12，氫鍵會斷裂，基因組會變成線性從而可以分開，質(zhì)粒相對基因組DNA要牢固，不容易破裂，仍然保持超螺旋，盡管高ph打斷氫鍵，兩個環(huán)形鏈也不能分開。52. 電泳的定義/概念/ 帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電荷相反的電極移動，稱為電泳53. 電泳的基本原理（分離樣品為什么在電泳里遷移速度不一樣）？ 帶電性質(zhì)、分子大小、形狀等不同54. 影響電泳分離的主要因素（外因）有哪些？ 1、電壓2、ph緩沖液3、離子強度適量0.02-0.2 4、電滲 5、介質(zhì)篩孔大小 6、緩沖液的黏度P12355. 瓊脂糖電泳中的瓊脂糖是什么？低熔點瓊脂糖有什么用途？瓊脂糖電泳的孔徑是由什么決定的？瓊脂糖電泳尤其適用于什么？如何檢測（用什么染色，染色原理）瓊脂糖主要是從海洋植物瓊脂中提取出來的線性多糖，一般含有多糖、蛋白質(zhì)和鹽等雜質(zhì)。低熔點瓊脂糖主要應(yīng)用于染色體DNA瓊脂糖內(nèi)包埋后原位進行內(nèi)切酶酶切、DNA片段回收以及小DNA片段的分離。瓊脂糖濃度適用于分離、鑒定和純化DNA片段。用EB染色，在紫外燈下，凝膠中1ngDNA即能直接觀察到。(EB染色鍵多，易吸收紫外光顯色。）P12556. 簡述瓊脂糖電泳的操作步驟？ P12557. 分子量相當(dāng)?shù)那闆r下，線性DNA、共價閉環(huán)DNA、開環(huán)的雙鏈DNA遷移速度順序是？ 共價閉合DNA線性DNA開環(huán)的雙鏈DNA58. 聚丙烯酰胺凝膠電泳介質(zhì)孔徑由什么決定？ 通過改變丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺的濃度比例決定59. 聚丙烯酰胺凝膠電泳與瓊脂糖凝膠電泳相比哪個分辨率更高？為什么? 聚丙烯酰胺凝膠電泳。 聚丙烯酰胺凝膠電泳具有分子篩效應(yīng)，又具備靜電效應(yīng)。P12760. 聚丙烯酰胺凝膠電泳為什么要用雙層玻璃板灌膠？ 封閉的雙層玻璃平板的夾層中灌膠，僅有頂層的部分凝膠與空氣中的氧氣接觸，從而大大的降低了氧對聚合的抑制作用。61. PCR技術(shù)的中文名？目的？原理？請簡述 答:PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。目的:通過重復(fù)循環(huán)變性、退火、延伸三個基本反應(yīng)將所需目的基因在體外成千上百萬倍的擴增。原理:模板DNA通過加熱至95使DNA雙鏈解離，使之形成單鏈，退火至溫度為55-60引物與單鏈結(jié)合，最后升溫至72DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下進行延伸,重復(fù)上述步驟,25-35個循環(huán)就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。62. PCR過程中需要哪些試劑？分別的作用是什么？ 答:TaqDNA聚合酶；促進模板DNA與引物結(jié)合。引物；與模板DNA結(jié)合，是決定PCR特異性的關(guān)鍵。dNTP；在PCR反應(yīng)中起原料作用。緩沖液(Tris-HCL)；調(diào)節(jié)pH。模板DNA、Mg2+；DNA酶激活劑 。KCL；使引物與模板更易配對。液體石蠟；防止水分蒸發(fā) 63. PCR過程是否需要解旋酶？為什么？ 答:不需要。DNA雙鏈在加熱至95會自動解離為單鏈。64. PCR三個環(huán)節(jié)的溫度分別是多少？每個環(huán)節(jié)的目的是什么？ 答:變性:95，是模板DNA變性解鏈；退火:45-65，引物與模板DNA單鏈互補序列配對結(jié)合；延伸:72，結(jié)合物在taqDNA聚合酶的作用下合成新的模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈。65. PCR是否可以無限多次循環(huán)？若不能，一般是幾個循環(huán)?為什么？ 答:不可以。一般為25-35次，因為次數(shù)過多taqDNA聚合酶活性下降、引物及dNTP濃度下降、容易發(fā)生錯配，導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物增加。且產(chǎn)物濃度會隨著循環(huán)的增加而升高，導(dǎo)致自身相結(jié)合而不與引物結(jié)合，或產(chǎn)物鏈纏結(jié)在一起，導(dǎo)致擴增效果降低。66. 引物的設(shè)計需要哪些注意事項？. 答:1.引物不能過長，一般為18-30BP。2.引物不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。3.G/C或A/T堿基應(yīng)均勻分布。4.不能形成引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。5.引物的堿基順序不能與非擴增區(qū)有同源性。6.引物需與模板DNA匹配。67. 請舉例兩種PCR技術(shù)的名稱，并簡述大致機理 答:1.反轉(zhuǎn)錄PCR:mRNA在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄為CDNA,以cDNA為模板進行PCR擴增,引物與cDNA第一鏈退火,在taqDNA聚合酶作用下合成cDNA第二鏈.再以cDNA第一鏈和第二鏈為模板,反復(fù)循環(huán)獲得大量的cDNA。2.巢式PCR:由兩對引物所組成，外引物擴增產(chǎn)物較長，含有內(nèi)引物的靶序列，經(jīng)過兩次PCR放大，獲得目的DNA 片段。即先用外引物與目的DNA進行擴增，然后取少量的第一次擴增產(chǎn)物為模板與內(nèi)引物進行第二次擴增，第二次PCR引物與第一次反應(yīng)產(chǎn)物的序列互補，第二次PCR擴增的產(chǎn)物就是目的產(chǎn)物。68. PCR技術(shù)有什么應(yīng)用？請舉例答:遺傳病診斷、性別鑒定、轉(zhuǎn)基因檢測、疾病診斷。69. 基因操作的基本步驟是？ 答:1.用PCR或人工合成的方法擴增目的基因。擴 2.用限制性內(nèi)切酶將目的基因與載體切開。切 3.將目的基因與運載體結(jié)合。接 4.將重組DNA引入受體細(xì)胞。轉(zhuǎn) 5.培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使其大量擴增。增 6.篩選含有重組DNA分子的受體細(xì)胞。檢70. ECORL限制酶能識別的切點堿基序列是？這樣的末端叫？ 答:。GAATTC/CTTAAG粘性末端71. 粘性末端和平末端的區(qū)別？末端連接用什么酶？ 答:用限制性內(nèi)切酶切割后得到末端齊平的為平末端(TGG/CCA)末端不齊平的為粘性末端(GAATTC/