分子克隆常用的DNA聚合酶.ppt

分子克隆 安普利試劑研發(fā)部胡師凱 主要內(nèi)容 一 基本概念 二 分子克隆技術(shù)的基本過(guò)程1 概述2 分子克隆中常用工具酶3 基因克隆常用載體4 目的基因的分離與制備5 目的基因的體外重組6 重組子導(dǎo)人宿主細(xì)胞7 陽(yáng)性重組子的篩選和鑒定 一 基本概念 1 分子克隆 是在體外對(duì)DNA分子按照既定的目的和方案進(jìn)行人工重組 將重組分子導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中 使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖 以獲得DNA分子大量復(fù)制 并使受體細(xì)胞獲得新得遺傳特征的過(guò)程 2 Dalton bp nt道爾頓 Dalton Dal Da D 分子量的單位 蛋白質(zhì)是大分子 所以常用kDa 千道爾頓 來(lái)表示 堿基對(duì) bp basepair 1kb就是1000個(gè)堿基對(duì) nt 核苷酸nucleotide 一 基本概念 3 保護(hù)堿基在分子克隆實(shí)驗(yàn)中 有時(shí)我們會(huì)在待擴(kuò)增的目的基因片段兩端加上特定的酶切位點(diǎn) 用于后續(xù)的酶切和連接反應(yīng) 由于直接暴露在末端的酶切位點(diǎn)不容易直接被限制性內(nèi)切酶切開(kāi) 因此在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí) 人為的在酶切位點(diǎn)序列的5 端外側(cè)添加額外的堿基序列 即保護(hù)堿基 用來(lái)提高將來(lái)酶切時(shí)的活性 一 基本概念 4 T A克隆 利用Taq酶在PCR產(chǎn)物3 末端有加上一個(gè)A的特性 使得Taq酶的PCR產(chǎn)物或經(jīng)過(guò)Taq酶加A的PCR產(chǎn)物 和一個(gè)人工加上一個(gè)3 末端具有1個(gè)T的載體進(jìn)行連接 由于突出末端可以互補(bǔ) 這樣可以大大提高目的基因和載體的連接效率 一 基本概念 5 RNA酶H活性 降解雜合在DNA鏈上的RNA的磷酸二酯鍵 可消化mRNA 6 載體 是指能在連接酶作用下和外源DNA片段或基因連接 并運(yùn)送DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子 一 基本概念 7 質(zhì)粒 plasmid 細(xì)菌染色體外的遺傳物質(zhì) 為環(huán)形閉合的雙股DNA 存在于細(xì)胞質(zhì)中 質(zhì)粒編碼非細(xì)菌生命所必須的某些生物學(xué)性狀 如性菌毛 細(xì)菌素 毒素和耐藥性等 質(zhì)粒具有可自主復(fù)制 傳給子代 也可丟失及在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移等特性 與細(xì)菌的遺傳變異有關(guān) 一 基本概念 8 F因子又稱(chēng)致育因子或性因子 是E coli等細(xì)菌中決定性別的質(zhì)粒 約等于2 核染色體DNA的小型共價(jià)閉合環(huán)狀DNA cccDNA通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合形成的封閉環(huán)狀DNA分子 分子量為6 2 107Da 94 5Kb 其中有1 3的基因 tra區(qū) 與接合作用有關(guān) 二 分子克隆的基本過(guò)程1 概述 1 分 得到目的基因 2 切 將目的基因和載體用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割 3 接 將目的基因和載體連接 形成重組子 4 轉(zhuǎn) 將重組子轉(zhuǎn)到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中 5 篩 篩選出含有正確重組子的宿主細(xì)胞 擴(kuò)增 二 分子克隆的基本過(guò)程 2 分子克隆中常用工具酶分子克隆中對(duì)DNA RNA分子的操作常涉及到一系列酶促反應(yīng) 這些酶是進(jìn)行基因克隆時(shí)必備的基本工具 分類(lèi) 1 使核酸降解的核酸酶類(lèi) 核酸內(nèi)切酶 核酸外切酶 2 催化核酸合成的酶類(lèi) DNA聚合酶 RNA聚合酶 連接酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 3 核酸修飾酶類(lèi) 甲基化酶 激酶 基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶 磷酸酶等 1 使核酸降解的核酸酶類(lèi) 限制性核酸內(nèi)切酶概念的提出及背景 20世紀(jì)30年代初 微生物學(xué)家發(fā)現(xiàn) 微生物的噬菌體不能交叉感染 如E coliK株的噬菌體只能感染E coliK株 不能感染其他株 反之亦然 這種現(xiàn)象成為 限制現(xiàn)象 但某些被菌體限制的噬菌體群中 有少數(shù)能幸存下來(lái) 并在菌體中繁殖 這種現(xiàn)象稱(chēng)為 修飾現(xiàn)象 是由細(xì)菌自己產(chǎn)生的一種能識(shí)別雙鏈DNA中的特定序列 并以內(nèi)切方式水解核酸中磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶 在細(xì)菌體內(nèi) 這種內(nèi)切酶可以分解外源性的DNA物質(zhì) 例如病毒等 而細(xì)菌本身的DNA同一識(shí)別序列中的某些堿基被甲基化所保護(hù) 限制性核酸內(nèi)切酶 restrictionendonuclease RE 的定義 限制性核酸內(nèi)切酶的分類(lèi) 按照限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)輔助因子的需求與否 以及切割DNA鏈的特點(diǎn) 將已發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶分為3種類(lèi)型 I 型 型限制性內(nèi)切酶實(shí)際應(yīng)用價(jià)值最大 這是因?yàn)?型酶只具有限制性活性 無(wú)甲基化修飾活性 對(duì)DNA的切割要求嚴(yán)格的序列作為靶位點(diǎn) 切割精確 此類(lèi)酶作用時(shí)只需要Mg2 參與 無(wú)需ATP 因此 型限制性核酸內(nèi)切酶是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶 被譽(yù)為分子生物學(xué)家的手術(shù)刀 限制性內(nèi)切酶的命名目前已廣泛采用H O Smith和D Nathams于1973年提出的命名系統(tǒng) 限制性內(nèi)切酶第一個(gè)大寫(xiě)字母 來(lái)自細(xì)菌的屬名 genus 第二 三個(gè)小寫(xiě)字母 來(lái)自種名 species 第四個(gè)字母代表菌株 strain 如果從一種菌株中發(fā)現(xiàn)了多種限制酶 則根據(jù)發(fā)現(xiàn)和分離的順序用羅馬字母表示 例如從流感嗜血桿菌D株中分離到的限制酶分別表示為HindI EcoRI 限制性內(nèi)切酶的作用特點(diǎn) 有嚴(yán)格的識(shí)別 切割的DNA序列 并以內(nèi)切的方式水解雙鏈DNA分子中的磷酸二酯鍵 產(chǎn)生的DNA片段5 端為P 3 端為OH 識(shí)別序列一般為4 6個(gè)堿基對(duì) 并以切割序列的正中作為軸心 成180 反向重復(fù) invertedrepeat 這種結(jié)構(gòu)也稱(chēng)為回文結(jié)構(gòu) palindrom 切割后產(chǎn)生平頭或粘性末端 型RE酶只需Mg2 不需ATP 限制性內(nèi)切酶 RestrictionEndonuclease 限制性內(nèi)切酶使用時(shí)的注意事項(xiàng) 要求較純的底物DNA Mg2 和Tris HCl緩沖體系 并且大多數(shù)內(nèi)切酶活性pH范圍在7 2 7 6之間 同時(shí)反應(yīng)體系中不能含有酚 氯仿 乙醚 SDS以及大于10mmol L的EDTA 對(duì)離子強(qiáng)度的要求分為3個(gè)級(jí)別 高鹽 100mmol LNaCl 中鹽 50mmol LNaCl 低鹽 0 10mmol LNaCl 在酶反應(yīng)緩沖體系中均添加有二硫蘇糖醇或 巰基乙醇 以穩(wěn)定酶活性防止氧化 在具體試驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)在低溫或冰浴條件下完成 2 分子克隆中常用工具酶 2 催化核酸合成的酶類(lèi) 分子克隆常用的DNA聚合酶 依賴(lài)DNA的大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段 T4噬菌體DNA聚合酶 T7噬菌體DNA聚合酶 經(jīng)修飾的T7噬菌體DNA聚合酶 測(cè)序酶 耐熱DNA聚合酶 依賴(lài)RNA的DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 DNA聚合酶I DNA聚合酶I是Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)DNA聚合酶 商品名稱(chēng)為kornberg酶 分子量109KD 此酶是一個(gè)多功能酶 包括3種酶活性 5 3 聚合酶活性 催化單核苷酸聚合到DNA的3 OH末端 使DNA鏈從5 3 延伸 5 3 外切酶活性 即從游離的5 末端降解雙鏈DNA或單鏈DNA成為單核苷酸 3 5 外切酶活性 另外該酶還具有RNA酶H活性 DNA聚合酶I作用條件 4種dNTP dATP dTTP dCTP dGTP Mg2 DNA作為模板 單鏈DNA或有缺口的雙鏈DNA均可 需要具有游離3 OH的引物或缺口的3 末端 TaqDNA聚合酶 TaqDNA聚合酶是一種依賴(lài)DNA的單亞基耐熱DNA聚合酶 分子量約為94KD 該酶最初由極端嗜熱水生菌Thermusaquaticus中提取并純化 目前已能通過(guò)基因工程方式大量生產(chǎn) TaqDNA聚合酶的應(yīng)用 TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) polymerasechainreaction PCR 中 能以DNA為模板 從結(jié)合在模板上的引物出發(fā) 以dNTP為原料 按堿基配對(duì)方式 從5 3 方向合成新的DNA鏈 TaqDNA聚合酶在70 75 時(shí)具有最佳的生物活性 隨著溫度的降低 酶活性明顯下降 同時(shí)此酶缺乏3 5 外切酶活性 因而無(wú)校正功能 DNA連接酶 催化雙鏈DNA中相鄰堿基的5 磷酸和3 羥基間磷酸二酯鍵形成的酶 稱(chēng)為DNA連接酶 DNAligase DNA連接酶主要有兩種 T4噬菌體DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶 大腸桿菌的DNA連接酶 T4噬菌體DNA連接酶 T4DNA連接酶最早是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)并分離的 分子量68kDa 特點(diǎn) A 催化雙鏈DNA平頭末端或黏性末端相鄰核酸的5 P和3 OH連接反應(yīng) B 催化雙鏈RNA和雜交雙鏈RNA DNA連接 但不能催化單鏈核酸的連接 C 可修補(bǔ)在雙鏈DNA RNA或DNA RNA雜種分子中的單鏈切口 大腸桿菌DNA連接酶 特點(diǎn) A 連接雙鏈DNA中一條鏈上的缺口催化B 存在的互補(bǔ)粘性末端的DNA片段需NAD 上述情況下可代替T4DNA連接酶 它產(chǎn)生的背景低 準(zhǔn)確性高 C 連接平頭末端DNA分子需聚乙二醇或Ficoll 反轉(zhuǎn)錄酶 能以RNA為模板合成DNA的DNA聚合酶稱(chēng)為反轉(zhuǎn)錄酶 reversetranscriptase RT 合成的DNA產(chǎn)物稱(chēng)為互補(bǔ)DNA complementaryDNA cDNA 反轉(zhuǎn)錄酶的作用特點(diǎn) 反轉(zhuǎn)錄酶以單鏈RNA或單鏈DNA為模板 以4種dNTP及游離3 OH為引物 按5 3 方向合成DNA 可用于cDNA第一鏈和第二鏈的合成 同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶有5 3 和3 5 RNA外切酶活性 3 5 切活性又稱(chēng)RNA酶H活性 3 5 RNA外切酶活性可用于特異降解RNA DNA雜交分子中RNA部分 此酶缺乏起校正作用的3 5 DNA核酸外切酶活性 催化的聚合DNA反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生一定的錯(cuò)配率 常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有禽類(lèi)成骨細(xì)胞性白血病病毒 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶和Moloney小鼠白血病病毒 M MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 反轉(zhuǎn)錄酶的作用特點(diǎn) 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 末端轉(zhuǎn)移酶 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 terminaldeosynucleotidyltransferase 多從小牛胸腺中分離出 催化多個(gè)脫氧核苷酸依次加到DNA3 末端 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的作用 末端轉(zhuǎn)移酶常用于給載體或cDNA加上互補(bǔ)的多聚尾巴 構(gòu)建人工粘性末端 也用于DNA分子3 端標(biāo)記 堿性磷酸酶 堿性磷酸酶 alkalinephosphatase 來(lái)源于大腸桿菌和牛小腸 能水解DNA RNA以及脫氧核糖三磷酸 dNTP 上的5 磷酸根 堿性磷酸酶應(yīng)用 在分子克隆的連接反應(yīng)中預(yù)先處理載體DNA片段 以去除5 P 防止載體重新自體連接 以提高重組效率 用32P標(biāo)記5 末端時(shí) 用此酶去除5 P 再用激酶對(duì)5 末端進(jìn)行同位素標(biāo)記 作為化學(xué)發(fā)光物測(cè)定或其他檢測(cè)系統(tǒng)的指示酶 二 分子克隆的基本過(guò)程 3 基因克隆常用載體目前用于基因克隆的載體種類(lèi)繁多 包括在大腸桿菌中使用的質(zhì)粒 噬菌體載體 酵母菌質(zhì)粒載體以及動(dòng) 植物病毒載體等 載體必須具備以下基本條件 載體必須有自我的復(fù)制子 能借助宿主細(xì)胞的復(fù)制和調(diào)控系統(tǒng)對(duì)攜帶的目的基因進(jìn)行復(fù)制和增殖 載體分子必須具備多種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn) 多克隆位點(diǎn) 易于外源DNA分子與載體連接及重組 載體及宿主細(xì)胞應(yīng)具有多個(gè)利于選擇和篩選的遺傳表型或標(biāo)志 包括抗藥性 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 噬菌斑形成及顯色反應(yīng)等 載體必須具備以下基本條件 載體必須有足夠的容量以容納外源DNA片段 同時(shí)載體分子應(yīng)具有拷貝數(shù)高 易與宿主細(xì)胞的DNA分子分離并易提取 抗剪切力強(qiáng)等特點(diǎn) 表達(dá)型載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子 前導(dǎo)序列 增強(qiáng)子等調(diào)控元件 質(zhì)粒載體 質(zhì)粒載體 質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外的遺傳單位 是一種雙鏈環(huán)狀的DNA分子 大小在1 200kb之間 質(zhì)粒自身含有復(fù)制起始點(diǎn) 與相應(yīng)的順式調(diào)控元件組成一個(gè)復(fù)制子 replicon 能利用細(xì)菌的酶系統(tǒng)進(jìn)行獨(dú)立的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄 質(zhì)粒的特點(diǎn) 分子較小 一般約數(shù)kb左右 比較穩(wěn)定 具有較高的拷貝數(shù) 含有高效的復(fù)制子 能在細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成受阻 染色質(zhì)DNA合成停止時(shí) 利用細(xì)菌的酶系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)粒自身的復(fù)制 因此在實(shí)驗(yàn)中常利用氯霉素以阻止細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成 而使質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加至數(shù)千 質(zhì)粒具有多種遺傳選擇標(biāo)記 包括各種抗藥基因或營(yíng)養(yǎng)代謝基因等 遺傳選擇標(biāo)記 氨芐青霉素抗性 ampicillinresistance ampr 基因 此基因編碼 內(nèi)酰胺酶 該酶能水解氨芐青霉素 內(nèi)酰胺環(huán) 使之失效而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥 四環(huán)素抗性 tetracyclineresistance tetr 基因 該基因編碼一種膜相關(guān)蛋白以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞 不同的質(zhì)粒具有不同的抗藥基因 質(zhì)粒的ampr tetr基因若被外源基因插入而失活 就失去了耐藥性 因此抗藥基因常作為基因工程的篩選標(biāo)志 遺傳選擇標(biāo)記 大腸桿菌LacZ基因 LacZ基因編碼半乳糖苷酶 能分解一種有色基團(tuán)X與半乳糖以糖苷鍵結(jié)合成的無(wú)色化合物X gal 用含有X gal的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌時(shí) 在細(xì)菌的乳糖操縱子 Lacoperon 誘導(dǎo)物異丙基硫代半乳糖苷 isopropylthiogalactoside IPTG 的作用下 細(xì)菌合成半乳糖苷酶 分解X gal 菌落變?yōu)樗{(lán)色 如果LacZ基因被外源DNA分子插入而遭到破壞 則不能生成相應(yīng)的半乳糖苷酶 菌落為白色 通過(guò)觀察菌落的顏色 能方便地進(jìn)行基因克隆的篩選工作 遺傳選擇標(biāo)記 藍(lán)白斑試驗(yàn) IPTG Xgal試驗(yàn) 乳糖 乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)物 IPTG 乳糖類(lèi)似物異丙基 D 硫代半乳糖苷 有更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用 誘導(dǎo)劑 LacZ基因 編碼半乳糖苷酶 表達(dá)檢測(cè)劑 X gal藍(lán)色吲哚產(chǎn)物 幾種常見(jiàn)的質(zhì)粒載體 pBR322pBR322是研究得最清楚應(yīng)用也最廣泛的質(zhì)粒 全長(zhǎng)4363bp 由3種野生質(zhì)粒成分構(gòu)建而成 含有Ampr和Tetr兩個(gè)抗藥基因標(biāo)記 一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn) ori 復(fù)制子為ColEI 其中ori來(lái)自pM9 Ampr來(lái)自pRSF2124 Tetr來(lái)自pSCl01 在Ampr和Tetr基因中共含有8個(gè)限制性酶切位點(diǎn) 以供外源DNA片段的插入 其中在Ampr基因中的單一酶切位點(diǎn)有PstI Pvu 等 在Tetr基因中的位點(diǎn)有BamHI Hind SalI等 幾種常見(jiàn)的質(zhì)粒載體 pUC18 pUC19pUC系列質(zhì)粒是由大腸桿菌pBR質(zhì)粒和M13噬菌體改建而成的質(zhì)粒載體 全長(zhǎng)2674bp 具有氨芐青霉素抗性基因 一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn) 復(fù)制子為ColEI pUC系列質(zhì)粒帶有一段大腸桿菌Lac操縱子DNA片段 能編碼 半乳糖苷酶氨基端的一部分 同時(shí)與大腸桿菌的gal 基因互補(bǔ) 當(dāng)pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到gal 的宿主菌后 在含有誘導(dǎo)物IPTG和生色底物X gal的培養(yǎng)基上形成藍(lán)色菌落 如果外源DNA片段克隆到pUC的Lac基因區(qū)域時(shí) 造成Lac基因失活 在含有IPTG X gal的培養(yǎng)基上將生成白色菌落 其他載體 M13噬菌株載體 M13噬菌體是一種絲狀噬菌體 全長(zhǎng)為6407bp 呈閉合環(huán)狀并以正鏈單鏈DNA single strandedDNA ssDNA 形式存在于噬菌體顆粒內(nèi) M13只感染具有F因子的雄性大腸桿菌 M13感染大腸桿菌 ssDNA 酶RFDNA 雙鏈復(fù)制型 可用作基因克隆的載體 RFDNA拷貝數(shù)達(dá)到100 200個(gè)后只合成單鏈正鏈DNA包裝成為成熟的噬菌體顆粒并從細(xì)菌體內(nèi)溢出 M13噬菌株載體 特點(diǎn) 對(duì)外源DNA的插入無(wú)長(zhǎng)度的限制RFDNA作克隆 常用載體M13mp18 M13mp19 藍(lán)白斑鑒定 二 分子克隆的基本過(guò)程 4 目的基因的分離與制備 人工合成基因 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)獲取目的基因 人工合成基因 知道目的基因的結(jié)構(gòu)與核苷酸序列及其他相關(guān)的基因信息 對(duì)于短片段 20 30bp 的合成效率較高 對(duì)于較長(zhǎng)的基因片段的合成 必須先按照已知的DNA序列將其劃分為較短的片段 由合成儀逐一合成再拼接成大片段 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)獲取目的基因 選擇不同的DNA分子為模板 通過(guò)PCR擴(kuò)增以獲取包括外顯子 內(nèi)含子以及相應(yīng)調(diào)控元件的完整基因片段 還可以用RNA分子為模板 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增生成cDNA以獲得大量的不含內(nèi)含子及調(diào)控序列 只含有結(jié)構(gòu)基因的DNA片段 通過(guò)PCR技術(shù)獲取的DNA片段可直接用于后續(xù)的基因克隆 探針制備 cDNA文庫(kù)的建立等眾多的分子生物學(xué)研究中 二 分子克隆的基本過(guò)程 5 目的基因的體外重組DNA分子的體外重組 是DNA分子之間的連接過(guò)程 這是一個(gè)DNA連接酶催化的生物化學(xué)反應(yīng) 幾種常用的DNA分子連接方法 粘性末端連接法 cohesiveendligation 平頭末端連接法 bluntendligation 人工接頭法 artificallinker 同源多聚尾序 homopolymerictails 連接法 粘性末端連接法 cohesiveendligation 這種方法適用于插入片段和載體分子具有相同的粘性末端 cohesiveend 相同的粘性末端在DNA連接酶的作用下很容易重新連接在一起 II類(lèi)限制酶一般識(shí)別長(zhǎng)度為4個(gè)或6個(gè)呈二重對(duì)稱(chēng)的核苷酸特異序列 粘性末端連接法存在以下幾點(diǎn)缺陷 高背景 即存在一定數(shù)量的載體自身環(huán)化分子 雙向插入 可采用定向克隆方式 即對(duì)載體和插入片段均使用兩種內(nèi)切酶進(jìn)行處理 多拷貝插入 將造成表達(dá)困難 適當(dāng)調(diào)整插入片段與載體分子的比例能減少多拷貝插入的產(chǎn)生 一般采用2 1 插入片段摩爾數(shù) 載體摩爾數(shù) 粘性末端連接法注意事項(xiàng) 去除5 端磷酸基團(tuán)以防止載體自身環(huán)化連接 對(duì)于雙向插入應(yīng)采用內(nèi)切酶圖譜對(duì)陽(yáng)性重組子進(jìn)行篩選 對(duì)于多拷貝插入問(wèn)題應(yīng)加T4DNA連接酶濃度 降低ATP濃度 載體去磷酸化等措施以盡量減少其可能性 平頭末端連接法 bluntendligation 平頭結(jié)構(gòu) 在T4DNA連接酶的作用下同樣能進(jìn)行連接 但是這種連接方式的效率較低 這時(shí)應(yīng)適當(dāng)增加酶量 提高反應(yīng)中底物的濃度并延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 人工接頭法 artificallinker 人工接頭主要用于在DNA分子的平頭末端上添加新的內(nèi)切酶位點(diǎn)以產(chǎn)生粘性末端 以提高連接效率 人工接頭大小一般為8 12個(gè)堿基對(duì) 同源多聚尾序 homopolymerictails 連接法 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 TdT 能催化脫氧核苷酸逐個(gè)添加到單 雙鏈DNA分子的3 OH末端上 目的DNA分子與載體分子可通過(guò)多聚尾巴的同源互補(bǔ)連接在一起 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 TdT 的最適底物是具有3 端突出的雙鏈DNA 定向克隆 定向克隆是指將外源DNA片段定向插入到載體中的方法 要做到定向插入則要求載體DNA分子的兩端不能互補(bǔ) 同時(shí)外源DNA分子的末端是不相互補(bǔ)的粘性末端 或者一端為粘性末端 另一端為平頭末端 二 分子克隆的基本過(guò)程 6 重組子導(dǎo)入宿主細(xì)胞體外重組生成的重組子必須導(dǎo)入到合適的宿主細(xì)胞中才能進(jìn)行復(fù)制