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ZnSe納米晶體陽離子交換反應(yīng)用于生物檢測中的信號放大-讀后感作者：彭昆 學號：2009111075 班級：化學班所有科學研究最終的目的就只有一個促進社會進步！所以此處我會首先著手于此篇文獻中涉及到的科學應(yīng)用，然后再從其原理和相關(guān)優(yōu)勢方面一一展開闡述。應(yīng)用：ZnSe納米晶體陽離子交換反應(yīng)，在諸如系統(tǒng)生物學、醫(yī)療保健、產(chǎn)品質(zhì)量控制、環(huán)境檢測和生物防衛(wèi)等很多領(lǐng)域中分子測量都很重要。人一天攝入Zn2+超過10mg的水平對健康的威脅很低，環(huán)境保護局（EPA）也沒有規(guī)定Zn2+的攝入上限。而在人血清蛋白中，能使用此方法檢測到大量的基底蛋白，不過亦得益于基底蛋白具有低干擾和準確量化的特性。原理: 密封分子實現(xiàn)體外檢測信號放大的簡便方法.充分利用了每個離子納米晶體（NC）里數(shù)以千計的離子外殼的自身優(yōu)勢和高表面活性。所附的陽離子能夠通過陽離子交換反應(yīng)（CX）快速釋放出來，然后會依次跟金屬相應(yīng)染料發(fā)生反應(yīng)。所得到的標記率的值大于1000:1。每一個目標-報道結(jié)合過程能夠放大一千多倍。實例：通過使用CdSe的陽離子交換信號放大方法成功檢測到了提取的人類RNA中全部的microRNA，其檢出限為35 fM。較為溫和的CX反應(yīng)不包括強酸和腐蝕性氧化物，這使以金屬響應(yīng)染料作為信號產(chǎn)物成為可能。這種方法快速，能夠進行原位檢測。優(yōu)勢:ZnSe納米結(jié)晶的陽離子交換反應(yīng)具有較高的信號放大率和很好的生物相容性;陽離子交換信號放大能直接用于生物檢測格式和光學檢測平臺，對儀器不需要特殊要求，不必進行實驗設(shè)計;跟其他納米基底敏感技術(shù)相比，陽離子交換信號放大最卓越的特性在于納米晶體獨特的光學性質(zhì)。因此，選擇和修飾納米晶體時，以及在實現(xiàn)檢測性能的高靈敏性、高穩(wěn)定性和極好的生物相容性等多種金屬響應(yīng)熒光染料的性能時將會有很大的選擇空間;ZnSe 納米晶體的陽離子交換信號放大的檢測性能優(yōu)于熒光染料、量子點和HRP的檢測性能，能用于人血清免疫球蛋白E（IgE）的定量分析；優(yōu)化FluoZin-3的熒光條件，在Zn2+的影響下FluoZin-3的量子產(chǎn)率能從小于0.005增加到0.43，它也有個比較低的解離常數(shù)15nM，每一納秒范圍內(nèi)的結(jié)合速率常數(shù)。所有這些性質(zhì)決定了在陽離子交換后能有強的熒光產(chǎn)生。綜述個人觀點：此篇文章主要闡述了光化學方面的靈敏度、選擇性被提高后所帶來的收益，同時在實驗中發(fā)現(xiàn)相關(guān)的不足從而去改善和優(yōu)化。比如此文中說：具有高量子產(chǎn)率的熒光染料是最普通的光學標記物，但其每一個報道分子僅僅能結(jié)合5個染料分子。當示蹤目標物在陣列表面捕獲非常少的報道分子的時候，常常因為標簽率低而使產(chǎn)生的熒光信號很難從背景噪音中分辨出來。雖然量子點（QDs）的效率比有機染料會高出5-20倍但具有生產(chǎn)成本高、淬火后表面發(fā)光功能化、生物耦合以及有毒元素鎘會對環(huán)境危害等缺點。由無毒材料制成的量子點跟那些含有Cd的物質(zhì)相比還沒有表現(xiàn)出比較敏感的性能。而ZnSe納米晶體陽離子交換反應(yīng)就克服了上述的所有缺點。所以我覺得一切事物的進展都是在發(fā)現(xiàn)它的不足時去進一步改造優(yōu)化的，沒有天生完美無缺，不過發(fā)現(xiàn)問題的眼光和以勇氣、執(zhí)著著的心去改造更重要。而作為一個與科學打交道的人更應(yīng)如此，去不斷地提高、總結(jié)、優(yōu)化！Cation Exchange in ZnSe Nanocrystals for SignalAmplication in BioassaysJingjing Yao, Samantha Schachermeyer, Yadong Yin, and Wenwan ZhongDepartment of Chemistry, University of California, Riverside, California 92521-0403, United StatesAnalytical Chemistry,Vol.83, No.1,402408. January 1, 2011ZnSe納米晶體陽離子交換反應(yīng)用于生物檢測中的信號放大Jingjing Yao, Samantha Schachermeyer, Yadong Yin, and Wenwan Zhong（加利福尼亞大學濱河分?；瘜W系, 加利福尼亞92521-0403, 美國）發(fā)表日期：2011年1月1日 來源：美國分析化學雜志83卷第1期，402-408頁ZnSe納米晶體具有較低的本底熒光和很好的生物兼容性，在生化檢測中常用作標記物。一個ZnSe納米晶體能夠釋放出3000多個Zn2+，因此它的陽離子交換反應(yīng)(CXAmp)能夠成百數(shù)千倍地放大目標識別信號。自由陽離子能夠從Zn響應(yīng)染料中依次激發(fā)強的熒光信號。據(jù)最近的研究顯示，與傳統(tǒng)的標記方法相比，ZnSe的陽離子交換具有卓越的檢測性能。5nM的ZnSe納米晶體陽離子交換的熒光強度是同樣濃度CdSe/ZnS核-殼量子點熒光強度的30倍。ZnSe納米結(jié)晶的陽離子交換反應(yīng)的檢出限（LOD）比使用辣根過氧化酶（HRP）標記法的檢出限低10倍，檢測靈敏度信號濃度曲線的斜率是后者的20倍。當使用夾心法檢測免疫球蛋白E（IgE）時檢測限可以達到1ng/mL，高靈敏的陽離子交換信號放大同樣能夠檢測人血清中免疫球蛋白E的總濃度。在人血清蛋白中，能使用此方法檢測到大量的基底蛋白，這得益于基底蛋白具有低干擾和準確量化的特性。除具有較高的信號放大率和很好的生物相容性外，ZnSe的陽離子交換信號放大能很容易適應(yīng)普通實驗設(shè)計，能夠用于普通實驗系統(tǒng)中低濃度目標物的可靠檢測。在諸如系統(tǒng)生物學、醫(yī)療保健、產(chǎn)品質(zhì)量控制、環(huán)境檢測和生物防衛(wèi)等很多領(lǐng)域中分子測量都很重要的。1-5然而，超靈敏檢測對其來說仍然是一個挑戰(zhàn)，主要是因為以前報道分子的標記效率非常低。例如，具有高量子產(chǎn)率的熒光染料是最普通的光學標記物，6-8但其每一個報道分子僅僅能結(jié)合5個染料分子。當示蹤目標物在陣列表面捕獲非常少的報道分子的時候，常常因為標簽率低而使產(chǎn)生的熒光信號很難從背景噪音中分辨出來。9,10雖然量子點（QDs）的效率比有機染料會高出5-20倍，9,11但具有生產(chǎn)成本高、淬火后表面發(fā)光功能化、生物耦合9,12,13以及有毒元素鎘會對環(huán)境危害等缺點。14-15由無毒材料制成的量子點跟那些含有Cd的物質(zhì)相比還沒有表現(xiàn)出比較敏感的性能。9,14另一方面，可以使用銀納米粒子通過表面等離子體振動方法來增強熒光。觀察顯示效率能提高3-10倍。16-18另外，其他一些技術(shù)也已經(jīng)應(yīng)用于信號放大檢測。最常見的方法是利用辣根過氧化物酶（HRP）的酶標記法。每個酶可很大程度上催化色分子或化學發(fā)光分子的產(chǎn)率，降低檢測限達10-100pM?；蛘?，核酸能夠通過檢測前的聚合酶來放大，但聚合酶反應(yīng)不能直接適用于無核酸分子中，還能受到集中背景污染物和冗長液體處理的破壞。25-28另外，摻雜了染料的二氧化硅納米顆粒的生物酶，因為在其內(nèi)部每一個顆粒物上封裝大量染料從而也增強標記率。29,30然而，實驗中仍然需要盡量避免染料滲漏和非特異性結(jié)合到二氧化硅表面，而在靶結(jié)合部位上如果結(jié)合體積較大的粒徑（30- 60nm），甚至阻止結(jié)合位點可誘導產(chǎn)生位阻現(xiàn)象。29我們團隊建立了一種使用密封分子實現(xiàn)體外檢測信號放大的簡便方法。這種方法充分利用了每個離子納米晶體（NC）里數(shù)以千計的離子外殼的自身優(yōu)勢和高表面活性。31所附的陽離子能夠通過陽離子交換反應(yīng)（CX）快速釋放出來，然后會依次跟金屬相應(yīng)染料發(fā)生反應(yīng)。所得到的標記率的值大于1000:1。每一個目標-報道結(jié)合過程能夠放大一千多倍。首次報道以納米晶體陽離子交換為基礎(chǔ)的信號發(fā)放大的方法是使用CdSe納米晶體，它的信號強度和檢測限分別比使用Alexa Fluor 488 高60倍和低100倍。通過使用CdSe的陽離子交換信號放大方法我們成功檢測到了提取的人類RNA中全部的microRNA，其檢出限為35 fM。較為溫和的CX反應(yīng)不包括強酸和腐蝕性氧化物，這使以金屬響應(yīng)染料作為信號產(chǎn)物成為可能。這種方法快速，能夠進行原位檢測。在CX緩沖溶液中混合納米晶體可使熒光信號在20s內(nèi)達到最大值的80%（沒有確切數(shù)據(jù)）。另外，陽離子交換信號放大能直接用于生物檢測格式和光學檢測平臺，對儀器不需要特殊要求，不必進行實驗設(shè)計。跟其他納米基底敏感技術(shù)相比，陽離子交換信號放大最卓越的特性在于納米晶體獨特的光學性質(zhì)。因此，當我們選擇和修飾納米晶體，以及在實現(xiàn)檢測性能的高靈敏性、高穩(wěn)定性和極好的生物相容性等多種金屬響應(yīng)熒光染料的性能時將會有很大的選擇空間。Schematic Illustration of CXAmp with ZnSe NCsaScheme 1. The secondary antibody was labeled with ZnSe NCs, which, after target binding, would undergo CX reaction with the added Ag+and released Zn2+. The freed Zn2+ would then bind to the poorly luminescent FluoZin-3, and the Zn- FluoZin-3 complex emits strong uorescence. 自CdSe的陽離子交換信號放大發(fā)展和應(yīng)用以來，我們在目前的研究中取得了很大的技術(shù)進步：使用ZnSe 納米晶體進行陽離子交換信號放大（如設(shè)計圖1所示）。使用生物兼容性好的ZnSe 納米晶體使其毒性大大降低。ZnSe 納米晶體的陽離子交換信號放大的檢測性能優(yōu)于熒光染料、量子點和HRP的檢測性能，能用于人血清免疫球蛋白E（IgE）的定量分析。此外，我們使用一項在檢測和儲存情況下陽離子交換信號放大條件和納米晶體穩(wěn)定性的細致研究來確認我們的方法的穩(wěn)定性。實驗部分化學試劑和材料。用于制備納米結(jié)晶、溶劑和配體的各種化學試劑采購自費舍爾科學公司。胺標低聚核苷酸采購自綜合DNA科技公司（Coralville, IA），沒有進一步純化。人免疫球蛋白G（IgG）、被HRP修飾或沒被其修飾的基抗體和輔抗體、Qdot525nm（QD）和FluoZin-3均購自Invitrogen（卡爾斯巴德，加利福尼亞州）。人血清免疫球蛋白E采購自雅典研究和技術(shù)公司（雅典，佐治亞州）。Lonza Biowhittaker人血清由費舍爾科學公司提供。ZnSe納米結(jié)晶的合成與特性。水溶性的ZnSe 納米晶體是是修改先前報道的CdSe 納米晶體的合成路線，在水溶液中合成的。合成的細節(jié)和納米晶體的性質(zhì)請參閱支持信息中?？贵w或氨標聚核苷酸和納米晶體的生物耦合技術(shù)。山羊抗人免疫球蛋白G (anti-IgG)或抗-人血清免疫球蛋白E通過1-乙基-3-（3-（二甲氨基）丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和磺基-N-羥基（磺酸基-NHS）耦合到ZnSe納米晶體上。在ZnSe表面的巰基丙烯酸（MAA）分子為耦合提供羧基官能團。包含了大約1014個納米晶體的ZnSe粉末，在5L的去離子水中第一次懸浮，用0.4mgEDC和1.1mg的磺酸基- NHS在1mL的鏈接緩沖溶液(0.1 M NaH2PO4-Na2HPO4 (pH 7.2)中活化15分鐘。在添加100L的抗-人血清免疫球蛋白G (1 mg/mL)或抗-IgE (1 mg/mL)防止蛋白交聯(lián)之前，剩余的EDC使用1.2L的巰基乙醇進行淬火處理。將混合物在室溫（RT）下攪拌3小時。最后，使用Amicon離心過濾器將耦合的ZnSe純化，并保存在100L 0.1mol/L的磷酸鹽緩沖溶液中（pH值7.2）。使用前將原料稀釋100倍。耦合在ZnSe納米晶體上使用3胺標的27 nt DNA 使用同樣的步驟處理。將抗體共軛到量子點上使用的是生產(chǎn)商建議的一步反應(yīng)過程。將大約1014個量子點同0.2mg的EDC和100L 1mg/mL的抗體在1mL的連接緩沖液中混合?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?h，使用YM-100過濾器純化并保存在100L 0.1 M的磷酸鹽溶液中。檢測時將共軛在量子點上的原料稀釋15倍。使用Cary紫外-可見分光光度計（瓦里安，加利福尼亞州），鍵合到ZnSe納米晶體和量子點上的抗體大概在350nm處（納米晶體的特征吸收峰）和280nm處（既包括納米晶體也包括蛋白質(zhì)的信息）有吸收峰，ZnSe 納米晶體和量子點共軛給出的結(jié)果是抗體和納米晶體的摩爾比接近45：1。因為YM-100過濾器不能夠完全地移除自由抗體分子。這個數(shù)值不能反應(yīng)每個納米晶體中人血清免疫球蛋白G的真實數(shù)目，只能用于估算納米晶體的總數(shù)和檢測中用到的抗體數(shù)。免疫分析和熒光檢測。二元檢測法和夾心檢測法都使用96孔微孔板進行檢測。在二元檢測中使用人血清免疫球蛋白G將細孔覆蓋一整夜并保持溫度在4C，然后室溫下在磷酸鹽緩沖液（PBS）中使用1%的牛血清白蛋白（BSA）將細孔阻塞30分鐘，這些操作都是在100L使用HRP、ZnSe、熒光素，或量子點標記的抗-人血清免疫球蛋白G在37C保溫1h前進行的。HRP-和熒光素-標記的抗免疫球蛋白G從1mg/mL生產(chǎn)商建議的原料中分別稀釋4000倍或40倍。夾心法檢測人血清免疫球蛋白E時，使用100L山羊抗-人血清免疫球蛋白E（10mg/mL）將平板整夜覆蓋并保持溫度在4C，并使用1%BSA阻塞平板。這樣，不同濃度的人血清免疫球蛋白E會加到平板上，并在37C下保溫1h。在PBS/BSA（1%）中將100L ZnSe-抗人血清免疫球蛋白E（將原料稀釋100倍）使用PBS洗滌若干次，再將其裝填到每一個小孔中，37C下保溫1h。再一次使用洗滌步驟洗去殘留標記抗體。將100L 2mM的H2O2和2mM ABTS 加入到細孔中會使HRP的吸收信號增強。在吸光度在平板讀出裝置中測量出前反應(yīng)在室溫下進行了20分鐘。陽離子交換信號放大的信號輸出和加入含有500M AgNO3 and 3M FluoZin-3的100 L of 10 mM HEPES步驟是同步的。一個485 nm的激發(fā)濾光器和一個530/30 nm發(fā)射濾波器用于檢測FluoZin-3。除了405nm的激發(fā)濾光器用于量子點檢測，其他情況下使用同樣的濾光器測量量子點和使用去離子水作為檢測溶液的熒光素的信號。FluoZin-3和陽離子反應(yīng)信號放大的熒光光譜使用的是Spex FluoroLog Tau-3熒光分光光度計（HORIBA Jobin Yvon的公司，新澤西州），激發(fā)波長為488nm。使用2nm寬度的狹縫收集從505nm到550nm的發(fā)射光譜，量子點的激發(fā)光譜在350 nm處，據(jù)記載在使用2nm寬度的狹縫時發(fā)射光譜是從505nm到550nm。ZnSe納米晶體的激發(fā)光譜在350 nm處，據(jù)記載在使用10nm寬度的狹縫時發(fā)射光譜是從385nm到450nm。所有記錄的數(shù)據(jù)都是三次測量結(jié)果的平均和標準偏差。結(jié)果與討論Zn2+熒光信號的最大化。人一天攝入Zn2+超過10mg的水平對健康的威脅很低，環(huán)境保護局（EPA）也沒有規(guī)定Zn2+的攝入上限。35,36因此，以鋅為基礎(chǔ)的納米結(jié)晶是提高陽離子交換信號放大生物兼容性的可選材料。因為陽離子交換信號放大是以熒光素結(jié)合釋放的自由Zn2+而產(chǎn)生的熒光為基礎(chǔ)的，所以陽離子交換信號放大的最低檢測限和線性范圍是由Zn-響應(yīng)燃料的性能決定的。過去幾十年發(fā)展了大量的熒光Zn2+傳感器，37-41本次研究我們選擇了FluoZin-3。在Zn2+的影響下FluoZin-3的量子產(chǎn)率能從小于0.005增加到0.43，它也有個比較低的解離常數(shù)15nM，每一納秒范圍內(nèi)的結(jié)合速率常數(shù)。37所有這些性質(zhì)決定了在陽離子交換后能有強的熒光產(chǎn)生。 Figure 1. (a) Detection of Zn2+ with 0.5, 3, or 5 M FluoZin-3 in 10 mM HEPES at pH 7.4 (b) Detection of Zn2+ with 0, 1, 10, 25, and 50 M EDTA in 10 mM HEPES at pH 7.4 containing 2 mM Ca(NO3)2 , 2 mM Mg(NO3)2 , and 3 M FluoZin-3.我們進行試驗的第一步是優(yōu)化FluoZin-3的熒光條件。在陽離子交換器中應(yīng)放入合適濃度的FluoZin-3以便結(jié)合所有釋放出的Zn2+并確保寬的檢測范圍，但是過高的染料濃度將不可避免地增加背景值。我們在pH為7.4的10mM HEPES的緩沖溶液中測試了FluoZin-3的三種不同濃度(500 nM and 3 and 5 M)對較大Zn2+濃度范圍的熒光響應(yīng)曲線。之所以選擇HEPES為緩沖體系是因為HEPES能提供一個合適的pH范圍使FluoZin-3放出強熒光。HEPES同樣不會和Ag+反應(yīng)也不會干擾陽離子交換反應(yīng)。如圖1a所示，在Zn2+達飽和濃度10M時，3M的FluoZin-3具有最寬的線性范圍和最大的信噪比（S/B 86）。雖然5M的FluoZin-3在高濃度的Zn2+體系中能發(fā)出更強的熒光，但由于染料的自體熒光會使背景值也隨之上升，在5 M Zn2+時信噪比會降到60（如支持信息圖S1所示）。3M和500 nM的FluoZin-3的背景信號具有可比性。因此，考慮到能提供的較大的性噪比和較寬的動力學范圍，在以下的測試中我們選擇濃度是3M的FluoZin-3。在使用陽離子交換信號放大檢測追蹤產(chǎn)物時，較低的Zn的檢測限也是要考慮的一個因素。伴隨著大量FluoZin-3分子產(chǎn)生的熒光，降低陽離子交換信號放大的檢測限的關(guān)鍵是降低背景熒光值。從實驗室一般玻璃儀器泄露出來的Zn2+，或作為制備緩沖溶液鹽類中的雜質(zhì)，在沒有納米晶體存在的情況下都能產(chǎn)生較強的背景值。有文獻報道在檢測細胞Zn2+時，使用CaEDTA可以掩蔽背景熒光信號。在沒有CaEDTA或者在不同濃度的CaEDTA的情況下我們使用CaEDTA滴定Zn2+，然后比較了它們的熒光信號。當Zn2+的濃度達到5nM時， EDTA的存在事實上既增加了背景值也增加了熒光信號，但是不管有沒有EDTA，使用了FluoZin-3的Zn2+的檢測限仍然具有可比性（如圖1b所示）。100 pM 的Zn2+也可以檢測到。然而，當Zn2+的濃度增加到50 nM以上時，由于EDTA 和FluoZin-3會競爭吸附鋅離子（如支持信息圖S2a所示），熒光信號隨著EDTA的量的增加而減小。而且，在EDTA存在的情況下信號的強度會變得不穩(wěn)定。當溶液中EDTA的濃度達10M時，在前5分鐘的滴定中，100 nM Zn2+產(chǎn)生的熒光信號降低8%，當EDTA的濃度大約在25M時會損失50%的信號（如支持信息圖S2b所示）。這個結(jié)果證明，盡管EDTA是一種比FluoZin-3更慢的Zn2+螯合劑，在開始時大多數(shù)自由的Zn2+會跟FluoZin-3結(jié)合，但由于在溶液中的高濃度，最終EDTA會結(jié)合更多的Zn陽離子。因為我們能在沒有CaEDTA存在的情況下可以獲得穩(wěn)定的熒光和較低的Zn2+檢測限，所以我們在陽離子交換信號放大的溶液中沒有選擇CaEDTA。使用ZnSe納米晶體進行信號放大。水溶性的ZnSe納米晶體據(jù)測量是立方體形的，用分子式表示是ZnSe0.64，平均尺寸是51nm（如支持信息圖S3，a、b所示）。ZnSe納米晶體在350nm激發(fā)時在400nm發(fā)射非常低的熒光（如支持信息圖S3c所示）。使用水溶性合成路線制備的納米結(jié)晶具有相對較寬的粒徑分布，仍然伴隨著低量子產(chǎn)率；但它們不在陽離子交換信號放大中考慮?？紤]到ZnSe 5.27 g/cm3的密度和立方晶體的理想結(jié)構(gòu)，每5nm的ZnSe0.64 的立方晶體包含了大約3400個Zn2+。在以上的優(yōu)化鋅檢測條件下，5 nM ZnSe納米結(jié)晶產(chǎn)生的信號是FluoZin-3自體熒光（488 nm激發(fā)）的60倍，是5nM CdSe/ZnS核/殼結(jié)構(gòu)量子點525nm熒光信號（350nm激發(fā)）的30倍（如圖2所示）。溶液中存在ZnSe納米晶體，強熒光使得其檢測限低達30 fM（如支持信息S4所示），相應(yīng)地Zn2+的檢測限低達100 pM。圖2中包含在納米晶體懸浮液中的Zn2+使用誘導耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES）證實。更進一步，由納米晶體表面修飾引起的陽離子交換效率的改變是可以忽略不計的。沒被鍵合的和鍵合了DNA或抗-免疫球蛋白E的ZnSe納米晶體在Zn(Ac) 2溶液中經(jīng)過陽離子交換信號放大后的曲線很好的重合（如圖3所示），這說明陽離子交換效率接近100%。所有的數(shù)據(jù)都是在陽離子交換溶液中2分鐘內(nèi)采集的。Figure 2. Fluorescence spectra of 5 nM QDs in DI water and 5 nM ZnSe after the CXAmp with 500 M Ag+ and 3 M FluoZin-3 in 10 mM HEPES buffer, pH 7.4. The autouorescence of FluoZin-3 was measured in the CXAmp buffer. Figure 3. CX efciency in ZnSe NCs without or with different surface modication, i.e., 27 nt DNA and ZnSe - IgG. Zn content in NCs was determined by ICP-AES. The CXAmp buffer contained 500 M Ag+ and 3 M FluoZin-3 in 10 mM HEPES buffer, pH 7.4. 在使用ZnSe納米晶體進行生物傳感時，ZnSe納米晶體會隨之溶解是個很大的問題，因為這會降低納米結(jié)晶的總數(shù)，對檢測的有效性產(chǎn)生影響。與更大顆粒的晶體相比，納米結(jié)晶大的比表面更能增加溶解性。ZnSe的溶解度是1.9 10-10 M?？紤]到每個ZnSe納米晶體中包含的Zn2+的總數(shù)，這個溶解度可以認為是在檢測過程中ZnSe納米晶體的濃度應(yīng)該保持在0.56 pM以上，防止納米晶體的溶解損失。另一個溶液情況，例如pH值和鹽分，會影響溶解平衡和改變?nèi)芙舛?。因此我們在典型的免疫分析和保存條件下測試了納米晶體的穩(wěn)定性。這個測試是在10 000 Da (YM-10)在NMWC中使用 Amicon 濾光片來從完整的納米晶體中分離溶解在溶液中的金屬離子。在使用YM-10過濾完ZnSe-抗免疫球蛋白E的存儲溶液后，從ZnSe納米晶體中釋放的Zn2+會流過色譜柱，而完整的ZnSe-抗免疫球蛋白E鍵合體會保留在過濾器的頂部。隨后，在有500 M Ag+和3 M FluoZin-3的情況下使用熒光檢測存在Zn2+的上清液和流出液，用FluoZin-3的熒光強度對Zn2+的濃度作標準曲線圖。因為ZnSe -抗免疫球蛋白G的陽離子交換效率接近100%，溶解的和沒有溶解的ZnSe納米晶體的數(shù)目能夠用鋅離子的濃度除以3400的比值很容易地計算出來。為了評估ZnSe -抗免疫球蛋白G在常規(guī)免疫檢測中的穩(wěn)定性，微粒必須保存在PBS緩沖溶液中，溶液也必須每隔1h取一次樣。只有微量的ZnSe -抗免疫球蛋白G共軛體會在5h的檢測期間里以鋅離子的形式（如支持信息圖S5a所示）溶解并留出過濾器。這種持續(xù)時間接近真實的一般免疫檢測的持續(xù)時間。另一方面，通過測量發(fā)現(xiàn)，保留在Amicon lter頂部的ZnSe -抗免疫球蛋白G共軛體的數(shù)目是個常數(shù)。而且研究證明，ZnSe -抗免疫球蛋白G在0.1 M pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液中具有長期的穩(wěn)定性。納米晶體每隔一周取一次樣這樣持續(xù)一個月。再次觀察發(fā)現(xiàn)沒有Zn2+泄露出來（如支持信息圖S5b所示）。高穩(wěn)定性可以歸因于覆蓋試劑MAA的使用。它和ZnSe納米晶體表面的鋅能很好地協(xié)調(diào)，而且能夠提供足夠多的負電荷使納米晶體在水溶液中自由分配。隨著抗體與ZnSe納米晶體共軛使陽離子交換反應(yīng)快速完整地進行和在檢測保存中令人滿意的穩(wěn)定性，ZnSe納米晶體能夠在免疫分析中用作標記物。Figure 4. Relative change of signal over background of IgG detection by comparing ZnSe NCs based CXAmp to ELISA. ZnSe陽離子交換信號放大的檢測性能。酶聯(lián)免疫分析測定(ELISA)是以酶為信號放大因素提供低檢測限的免疫分析的黃金法則。因此，為了能更好地評估陽離子交換信號放大卓越的檢測性能，我們比較了ZnSe陽離子信號放大和酶聯(lián)免疫分析測定中最常用的辣根過氧化酶信號放大的性能。結(jié)果顯示，山羊抗人免疫球蛋白G既能跟辣根過氧化酶標記也能跟ZnSe納米晶體標記。兩種標記方法的信號放大效率用信號對背景的相對變化即(信號-背景)/背景100%來表示，如圖4所示就是其對免疫球蛋白G濃度的曲線圖。很明顯地可以看到陽離子交換信號放大的信號值比用辣根過氧化酶標記的信號值上升地更快，它們都有一個可比較的動態(tài)范圍。陽離子交換信號放大也有一個非常低的檢測限。10 ng/mL免疫球蛋白G的量能經(jīng)過陽離子交換信號放大很明顯地檢測到，這個值比我們以前報道的CdSe陽離子交換信號放大所得到的檢測限低5倍。31計算出的上述（黑色，HRP）檢測限（LOD，等于3倍的標準偏差(SD)）是3.7ng/mL（如支持信息圖S6a所示）。陽離子交換信號放大也具有很好的檢測重現(xiàn)性，相對標準偏差（SRD）的平均值為2%。與此相對，使用辣根過氧化酶標記的檢測免疫球蛋白G的最低限度是50 ng/mL，計算得出的檢測限是34 ng/mL，相對標準偏差的平均值為6%（如支持信息圖S6b所示）。如圖S6所示兩條標準曲線的斜率也顯示出在檢測免疫球蛋白G時，陽離子交換信號放大比辣根過氧化酶靈敏20倍。另外，對量子點和使用熒光染料標記物性能的檢測分別使用的是QDot525nm和熒光標記山羊抗人免疫球蛋白G。但這兩者在最低可檢測10 g/mL的免疫球蛋白G時顯示比較差的靈敏度。低靈敏度同樣會導致較窄的檢測范圍和測量中顯著的大標準偏差值（如支持信息圖S7所示）。通過夾心檢測法使用ZnSe陽離子交換信號放大對免疫球蛋白E進行檢測。上述免疫球蛋白G的檢測性能是二元相互作用格式的一種形式。更通常的做法是夾心檢測用于陣列傳感器。因此，為了更進一步地展示ZnSe陽離子交換信號放大在生物分子檢測中的性能，在夾心法檢測中我們將它作為一種樣品抗原用于人免疫球蛋白E的檢測。免疫球蛋白E是人體5種同型免疫球蛋白(Igs)中的一種。31跟其他的免疫球蛋白相比，體內(nèi)的免疫球蛋白E的濃度非常低。例如，免疫球蛋白E在冷血液中的濃度低于1 U/mL (1 U =2.4 ng)。免疫球蛋白E濃度上升通常跟過敏性失調(diào)疾病有關(guān)，例如過敏癥、免疫缺陷綜合征或其他炎癥。在大多數(shù)放射免疫鑒定法中，檢測限低達0.5 U/mL (1.2 ng/mL)。43過敏原特異性免疫球蛋白E數(shù)量的定量仍然需要技術(shù)在自動化、精度、周轉(zhuǎn)時間和靈敏度方面的改進，以便在臨床重要的工作中精確測量免疫球蛋白E。44Figure 5. Human IgE detection by ZnSe NCs based CXAmp with a sandwich assay format. 免疫球蛋白E分子包含有兩個完全相同的抗免疫球蛋白E抗原決定簇FcRI位點和FcRII位點對稱地位于兩個-重鏈旋轉(zhuǎn)軸中心部位。45因此，可以預(yù)期能同時連接兩個完全相同的抗免疫球蛋白E分子。在我們的夾心法免疫檢測中，存在于樣品中的免疫球蛋白E能跟抗免疫球蛋白E抗體發(fā)生反應(yīng)，那些抗免疫球蛋白E抗體吸收在檢測器表面，能用ZnSe納米晶體標記的相同的抗免疫球蛋白E抗體進行檢測。圖5顯示了用陽離子交換信號放大檢測人免疫球蛋白E的標準曲線。線性檢測范圍可達100 ng/mL，熒光持續(xù)增加當免疫球蛋白E達到飽和時熒光信號超過1 g/mL（如圖5中插入圖所示）。跟使用放射性同位素標記法相比43，這種方法的檢測限可達1ng/mL。這種以陽離子交換信號放大為基礎(chǔ)的檢測方法能夠用于純凈人血清中免疫球蛋白E和一系列血清稀釋物（使用1 PBS緩沖溶液稀釋）的檢測。稀釋的血清包含更低量的蛋白質(zhì)，其中的量化結(jié)果可能很少受到背景中非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的影響。事實上，每一種由標準免疫球蛋白E檢測曲線得到的血清溶液中免疫球蛋白E的濃度會隨著稀釋溶液中血清的體積比而逐漸增加。然而，血清比例低于30%的緩沖溶液的增加斜率顯然比高血清比例高的緩沖溶液的增加斜率大（如圖6所示），這包括了背景蛋白質(zhì)中更高蛋白質(zhì)的含量可以降低對免疫球蛋白E的檢測能力。檢測平板上相關(guān)蛋白質(zhì)對抗免疫球蛋白E抗體的非特異性結(jié)合可以阻止免疫球蛋白E的捕獲和降低最終的檢測信號。具有較高血清稀釋因素，如像9%-33%這樣更低的血清含量百分比，我們計算出來的免疫球蛋白E的濃度始終在261.1 15.8 ng/mL，這顯然是成年人血漿中一個合理的水平。44Figure 6. Calculated IgE concentration in human serum dilutions with 1 PBS plotted against the serum volume percentage. The dilution fold was 1-, 2-, 3-, 5-, and 10-fold, respectively. IgE in serum with or without dilution was tested with ZnSe CXAmp, and the concentration of IgE was calculated based on the standard curve. 陽離子交換信號放大信號強靈敏度高，使利用高稀釋血清降低大量基體蛋白質(zhì)的影響成為可能。因為可以應(yīng)用更多特異性捕獲劑和報道分子，所以能夠?qū)崿F(xiàn)對免疫球蛋白E的更精確測量。而且在我們的夾心法測量中，每一個免疫球蛋白E分子都鍵合了兩個完全相同的免疫球蛋白E抗體。通過免疫球蛋白E的變形來進行相互結(jié)合，這樣會增加分子內(nèi)部的張力。45對結(jié)合位點的競爭和結(jié)構(gòu)變形的阻止都能夠降低檢測的靈敏度?？梢灶A(yù)期，使用兩種類型的抗免疫球蛋白E來識別免疫球蛋白E分子的不同抗原位點能夠提高檢測的靈敏度。人免疫球蛋白E的幾種單克隆抗體和特殊的核酸適合體已經(jīng)制造出來，46-48它們可以很容易地和具有強大信號策略的陽離子交換信號放大法結(jié)合使用，這樣在免疫球蛋白E檢測中可以得到更強的特異性和更高的靈敏度。結(jié)論在最近的研究中對陽離子交換信號放大進行了的一些技術(shù)上改進。水環(huán)境中合成的具有生物相容性的ZnSe納米晶體被證明在免疫檢測中同陽離子交換信號放大結(jié)合用于信號處理具有很好的穩(wěn)定性。和傳統(tǒng)標記物包括熒光染料、量子點和生物酶相比，ZnSe納米晶體陽離子交換信號放大獲得更高的靈敏度和更低的檢測限。它的檢測能力在檢測人血清中免疫球蛋白E的過程中得到了很好的體現(xiàn)。當前的發(fā)展也指出使用不同類型的納米晶體用于陽離子交換進行信號放大可以滿足不同的實驗要求。然而，為了提高陽離子交換信號放大法操作簡單、實現(xiàn)高信號和得到高靈敏度，我們還有很多工作要做。例如，可以開發(fā)出一種更穩(wěn)定的納米晶體用于不同的樣品基底和納米晶體的簇能夠夠釋放出更強的信號放大功能。陽離子交換和熒光觸發(fā)過程能更進一步地簡化從而適用于不同的檢測平臺。陽離子交換信號放大中的背景問題源于金屬相應(yīng)染料的自發(fā)熒光，可以使用鍵合瀾系元素標記和時間選通數(shù)據(jù)征用技術(shù)加以解決。49致謝這項工作的啟動資金是由加州大學濱河分校的Zhong先生提供的。非常感謝Le He，Tao Wu兩位先生提供投射電子顯微鏡和X射線衍射協(xié)助我們進行檢測。提供的支持信息文中標記的附加信息。這些信息通過因特網(wǎng)免費提供.參考文獻：(1) Gauglitz, G. 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