有關(guān)物質(zhì)測(cè)定hplc方法的建立.doc

有關(guān)物質(zhì)測(cè)定hplc方法的建立一、開始之前必須明白：1、有關(guān)物質(zhì)來源的兩種途徑：1）合成過程中的中間體和副產(chǎn)物；2）儲(chǔ)存過程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物；2、分析你的樣品結(jié)構(gòu)，熟悉樣品的基本性質(zhì)；3、樣品中可能含有的中間體；4、樣品的基本穩(wěn)定性和可能產(chǎn)生的降解產(chǎn)物；二、準(zhǔn)備工作1、查閱文獻(xiàn)，看看是否同行已經(jīng)做過類似的工作，有的話就簡(jiǎn)單了，直接奔主題了。2、沒有文獻(xiàn)（苦！），那就很是麻煩了。1）分析結(jié)構(gòu)，看看有無紫外吸收，有就比較簡(jiǎn)單，選用紫外檢測(cè)器就行了，沒有的話那就麻煩，可以選用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等；2）分析結(jié)構(gòu)，看看選用何種色譜方式進(jìn)行分離（正相或者反相色譜）；3）分析結(jié)構(gòu)，看看流動(dòng)相該如何選擇，要不要選用一些離子對(duì)試劑。4）分析結(jié)構(gòu)。5）與同類產(chǎn)品進(jìn)行比較；三、開工（以紫外檢測(cè)為例）1、流動(dòng)相的選擇（采用粗品進(jìn)行選擇）1）、有文獻(xiàn)，按文獻(xiàn)進(jìn)行優(yōu)化。不過我得提醒一下，文獻(xiàn)的方法參考是可以的，要想完全按照他的條件做出來是很難的。2）、沒有文獻(xiàn)。a、紫外掃描一下，看看哪里有最大吸收。將能得到的中間體、副產(chǎn)物、分解產(chǎn)物、樣品配成相同濃度，在紫外掃描分光光度計(jì)上掃描一下，選擇所有物質(zhì)具有相同的最大吸收處的波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。要是有pda檢測(cè)器就不需要這一步了。b、還是得找一些資料，看看類似的樣品的流動(dòng)相，以它為起始流動(dòng)相進(jìn)行選擇，如果沒有，那就找專業(yè)書吧，看看它是怎么教你選擇流動(dòng)相的。2、最低檢測(cè)限3、系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，給出系統(tǒng)評(píng)價(jià)報(bào)告4、考察中間體及副產(chǎn)物和樣品的分離度。同時(shí)定出中間體在色譜圖中的出峰位置，為定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。5、考察降解產(chǎn)物和樣品的分離情況。這個(gè)一般是通過破壞性試驗(yàn)來考察。常用的一般是高溫、強(qiáng)光、氧化、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿五個(gè)因素進(jìn)行考察，通過考察，應(yīng)該可以知道色譜圖中那些峰是由于什么因素產(chǎn)生，這個(gè)也可為定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。6、根據(jù)上面的試驗(yàn)，應(yīng)該可以知道樣品的一些大概情況了，樣品中有哪些雜質(zhì)應(yīng)該比較明確了?，F(xiàn)在對(duì)三批樣品進(jìn)行測(cè)定，通過歸一化來觀察，應(yīng)該可以知道雜質(zhì)的大概情況，根據(jù)這個(gè)可以定出相應(yīng)采用自身對(duì)照法測(cè)定的雜質(zhì)限量。一般情況下還應(yīng)定出最大的單一雜質(zhì)限量。如果樣品中的雜質(zhì)可以很好得到純品，那么你就可以采用外標(biāo)法來準(zhǔn)確定量。7、雜質(zhì)的限量必須根據(jù)你的樣品本身性質(zhì)來定。關(guān)于HPLC主成分自身對(duì)照法檢查有關(guān)物質(zhì)時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)確定的討論審評(píng)二部 張玉琥有關(guān)物質(zhì)檢查，包括對(duì)產(chǎn)品中殘留合成原料、中間體、副產(chǎn)物及可能的降解產(chǎn)物的檢查，是控制藥品質(zhì)量的重要指標(biāo)，目的是檢查藥品中所含的上述雜質(zhì)是否符合安全性的要求,同時(shí)也是藥品穩(wěn)定性評(píng)價(jià)中需重點(diǎn)考察的項(xiàng)目。有關(guān)物質(zhì)檢查常用的方法之一是HPLC主成分自身對(duì)照法（紫外檢測(cè)器），即將HPLC色譜圖中雜質(zhì)峰面積與主成分自身對(duì)照液峰面積進(jìn)行比較，以確定雜質(zhì)限度是否合格。采用此方法時(shí)確定的檢測(cè)波長(zhǎng)是否合理直接影響到方法的可行性，因此檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇是方法學(xué)研究的重要內(nèi)容。在審評(píng)中發(fā)現(xiàn)一些申報(bào)單位在采用HPLC主成分自身對(duì)照法檢查有關(guān)物質(zhì)時(shí)直接或間接地以主成分的最大吸收波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，由于有關(guān)物質(zhì)檢查的對(duì)象是雜質(zhì)，若將主藥的最大吸收波長(zhǎng)確定為檢測(cè)波長(zhǎng)，則雜質(zhì)在此波長(zhǎng)下的吸收可能偏低，某些雜質(zhì)甚至無吸收，這樣會(huì)造成對(duì)雜質(zhì)含量的低估甚至漏檢，從而不能反映產(chǎn)品的真實(shí)質(zhì)量，影響了對(duì)品種質(zhì)量可控性及穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)。在有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)波長(zhǎng)確定方面，申報(bào)資料中比較常見的做法有：1直接將主藥的最大吸收波長(zhǎng)選作檢測(cè)波長(zhǎng)。2簡(jiǎn)單地套用含量測(cè)定的色譜條件。在HPLC法進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，為提高方法的靈敏度，降低干擾，往往選用主成分的最大吸收波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。若套用含量測(cè)定的色譜條件，實(shí)際仍是以主藥的最大吸收波長(zhǎng)作為有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)波長(zhǎng)。3以樣品進(jìn)行破壞性試驗(yàn)（酸、堿、熱、光照、氧化等）后的溶液做紫外掃描，將掃描圖譜中最大吸收波長(zhǎng)確定為有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。因破壞性試驗(yàn)后溶液中存在尚未破壞的主藥、降解產(chǎn)物、輔料等，此溶液的紫外吸收為各成分紫外吸收的加和，并不能反映降解產(chǎn)物的紫外吸收特性。由于未破壞主藥所占比例較大，故破壞性試驗(yàn)后溶液的最大吸收波長(zhǎng)一般仍為主藥的最大吸收波長(zhǎng)。采用HPLC主成分自身對(duì)照法檢查有關(guān)物質(zhì)，其前提之一是需檢查的雜質(zhì)與主成分在確定的檢測(cè)波長(zhǎng)下應(yīng)有相近的紫外吸收（響應(yīng)值接近），選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)需對(duì)產(chǎn)品中可能存在的雜質(zhì)（合成原料、中間體、副產(chǎn)物以及降解產(chǎn)物）的紫外吸收特性進(jìn)行研究。已知雜質(zhì)的紫外吸收特性可采用對(duì)其流動(dòng)相溶液直接進(jìn)行掃描的方法考察，未知雜質(zhì)（如未知降解產(chǎn)物等）可通過二極管陣列檢測(cè)器考察其紫外吸收情況，根據(jù)各主要雜質(zhì)及主成分的紫外吸收特性，選取響應(yīng)值基本一致的波長(zhǎng)作為有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。若對(duì)不同雜質(zhì)難于找到均適宜的檢測(cè)波長(zhǎng)，可考慮選擇在不同波長(zhǎng)下分別測(cè)定，也可考慮采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法。只有經(jīng)試驗(yàn)研究確認(rèn)主成分的最大吸收波長(zhǎng)符合有關(guān)物質(zhì)檢查對(duì)測(cè)定波長(zhǎng)的要求時(shí)，為方便操作，可選作有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)，以與含量測(cè)定的色譜條件一致。另外，HPLC主成分自身對(duì)照法檢查有關(guān)物質(zhì)比較適用于對(duì)微量雜質(zhì)總量的控制，也可用于單個(gè)雜質(zhì)的限度（一般不超過0.5%）控制。對(duì)于具有明確歸屬的已知雜質(zhì)，建議采用雜質(zhì)對(duì)照品法進(jìn)行檢查。對(duì)于有毒有害雜質(zhì)，更應(yīng)采用雜質(zhì)對(duì)照品法單獨(dú)測(cè)定，并制定嚴(yán)格的限度。關(guān)于原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查方法建立的思考作者: lcc666發(fā)布日期: 2007-1-10 查看數(shù): 73 出自: table=96%trtd/td/trtrtd=1,1,60正文/tdtd 審評(píng)四部七室 趙慧玲【摘要】本文針對(duì)審評(píng)原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查方法中存在的問題，介紹歐洲和英國藥典關(guān)于原料藥已知雜質(zhì)的研究現(xiàn)狀和有關(guān)物質(zhì)方法建立及質(zhì)量控制，以供申請(qǐng)人參考?！娟P(guān)鍵詞】有關(guān)物質(zhì)、方法學(xué)、分離度。筆者審評(píng)原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查方法中發(fā)現(xiàn)，大多申請(qǐng)人越來越多地認(rèn)識(shí)到控制原料藥有關(guān)物質(zhì)的重要性，自行建立方法考察原料藥中存在的有關(guān)物質(zhì)。但在研究中往往片面認(rèn)為樣品通過了破壞性試驗(yàn)和1自身對(duì)照法后的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)就符合了要求。因此，忽視對(duì)主成分中雜質(zhì)產(chǎn)生原因的分析，忽視儀器的檢測(cè)靈敏度的分析、忽略色譜柱（柱效）的選擇、流動(dòng)相及比例的選擇、檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。忽視主成分和可能產(chǎn)生的雜質(zhì)分離度的問題。原料藥有關(guān)物質(zhì)方法建立應(yīng)關(guān)注的問題：原料藥中的雜質(zhì)來源于合成的中間體、副產(chǎn)物、以及降解產(chǎn)物，建立方法初期，僅采用破壞性試驗(yàn)的方法考察降解產(chǎn)物的做法是片面的。由于降解產(chǎn)物的量較小，如果選擇的方法不好，比如，柱效低，波長(zhǎng)選擇不合理、流動(dòng)相及流動(dòng)相比例不合適，即使有降解產(chǎn)物，也達(dá)不到有效的靈敏度和有效的分離。因此，一個(gè)好的分析方法的建立首要問題應(yīng)是圍繞主成分和雜質(zhì)的分離度和檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行。對(duì)于生產(chǎn)原料藥的企業(yè)來講，由于可以通過工藝得到中間體、副產(chǎn)物，在方法建立初始，首先應(yīng)該將可能的中間體和副產(chǎn)物作為雜質(zhì)對(duì)待，進(jìn)行柱效、流動(dòng)相及流動(dòng)相比例、波長(zhǎng)和分離度等方法學(xué)的研究。方法建立成熟后，可根據(jù)中間體和副產(chǎn)物的安全性和工藝得到的難易程度決定是否固定為已知雜質(zhì)。如果工藝中難以得到，且比較安全，可考慮采用雜質(zhì)校正因子加上相對(duì)保留時(shí)間的方法?；虿捎秒s質(zhì)相對(duì)保留時(shí)間加上自身對(duì)照方法。上述三種方法均有好的分離度和響應(yīng)值（靈敏度）作保證。也是研發(fā)和審評(píng)中應(yīng)當(dāng)提倡的。如果原料合成中確實(shí)得不到副產(chǎn)物，對(duì)于有紫外吸收的樣品可以用二極管陣列檢測(cè)器，考察未精制的粗品，并對(duì)比已精制過的樣品，確定粗品中各成分的分離度和樣品中可能雜質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。方法確立后，可采用自身對(duì)照方法或面積歸一化法控制雜質(zhì)。對(duì)于后一方法，在研發(fā)和審評(píng)中應(yīng)當(dāng)慎重選用。如果證明上述四個(gè)方法是比較成熟的方法后，如果再加上破壞性試驗(yàn)考察降解產(chǎn)物，其方法就更加完整和適用。介紹歐洲和英國藥典控制有關(guān)物質(zhì)關(guān)注的問題歐洲和英國藥典的原料藥標(biāo)準(zhǔn)后面，大部分都附有可能產(chǎn)生的中間體和副產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，在有關(guān)物質(zhì)質(zhì)量控制中有些采用已知雜質(zhì)的方法；有些采用雜質(zhì)校正因子加上相對(duì)保留時(shí)間的方法；雜質(zhì)相對(duì)保留時(shí)間加上自身對(duì)照方法和自身對(duì)照方法或面積歸一化法。例如：核黃素磷酸鈉的有關(guān)物質(zhì)檢查就是采用HPLC的已知雜質(zhì)核黃素、其他雜質(zhì)相對(duì)保留時(shí)間加上自身對(duì)照的方法。取本品0.1g，用水50ml溶解，并用流動(dòng)相稀釋至100ml，取該溶液8ml，用流動(dòng)相稀釋至50ml，作為供試品溶液。另取核黃素對(duì)照品60mg，加鹽酸試液1ml溶解，用水稀釋至250ml, 取該溶液4ml，用流動(dòng)相稀釋至100ml，作為對(duì)照品溶液(a)。再另取核黃素磷酸鈉對(duì)照品0.1g，用水50ml溶解，并用流動(dòng)相稀釋至100ml，取該溶液8ml，用流動(dòng)相稀釋至50ml，作為對(duì)照品溶液(b)。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（填充劑粒度：5m；柱長(zhǎng)：0.25m；內(nèi)徑：4.6mm）；以甲醇7.35g/L磷酸二氫鉀溶液（150：850）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)266nm；流速2ml/分。5單磷酸核黃素的保留時(shí)間為20分鐘；其他相對(duì)保留時(shí)間：3，4二磷酸核黃素大約0.2；3，5二磷酸核黃素大約0.3；4，5二磷酸核黃素大約0.5；3單磷酸核黃素大約0.7；4單磷酸核黃素大約0.9；核黃素大約2。取對(duì)照溶液（a）100l注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)主峰高度為滿量程的50；再注入對(duì)照溶液（b）100l，記錄色譜峰直到核黃素的峰面積能被準(zhǔn)確計(jì)算，且4單磷酸核黃素峰與5單磷酸核黃素峰的分離度應(yīng)不小于1.5。精密量取供試品溶液、對(duì)照溶液（a）和對(duì)照溶液（b）各100l，分別注入液相色譜儀，供試品溶液的色譜圖中，如有與核黃素峰保留時(shí)間相應(yīng)的色譜峰，其峰面積不得大于對(duì)照溶液（a）主峰面積（6.0），二磷酸核黃素面積的和不得大于對(duì)照溶液（a）主峰面積（6.0），且均應(yīng)以干燥品計(jì)。結(jié)合國內(nèi)研發(fā)核黃素磷酸鈉的狀況提幾點(diǎn)建議在審評(píng)核黃素磷酸鈉原料和注射劑有關(guān)物質(zhì)的過程中發(fā)現(xiàn)，申請(qǐng)人常參照中國藥典收載的核黃素磷酸鈉及注射液標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目進(jìn)行。忽視了國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)和國內(nèi)同品種質(zhì)量的調(diào)研，盲目申報(bào)。一些資料中單磷酸核黃素的分離度并不好，從圖譜看起來，表面上其質(zhì)量比國外標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量好，但實(shí)際上是單磷酸核黃素等多個(gè)組分并未得到有效分離。雖然國外將各單磷酸鹽均看成有效成分，而未作為雜質(zhì)控制，但在方法學(xué)研究中，的確關(guān)注了各單磷酸鹽的分離度，這應(yīng)是方法學(xué)研究的重點(diǎn)。如果建立的方法不能使每一個(gè)成分分離，這個(gè)方法就不是一個(gè)好的方法。從這個(gè)例子分析，審評(píng)中不能簡(jiǎn)單認(rèn)為雜質(zhì)個(gè)數(shù)少了，質(zhì)量就好，雜質(zhì)個(gè)數(shù)多了，質(zhì)量就差，一定要結(jié)合分析方法的好壞，經(jīng)過綜合分析判斷后下結(jié)論。否則，容易犯主觀主義和片面主義的錯(cuò)誤，將由于因分析方法的分離度較差而導(dǎo)致的雜質(zhì)個(gè)數(shù)少的藥品誤認(rèn)為質(zhì)量好。其實(shí)，藥品中包含著沒有分開的成分，這個(gè)成分很可能是最不安全的成分。因此，一個(gè)藥品的有關(guān)物質(zhì)方法的評(píng)價(jià)更應(yīng)重視分離度方法的評(píng)價(jià)，在分離度合適的情況下，比較檢出雜質(zhì)的個(gè)數(shù)才有意義，不能簡(jiǎn)單的以檢出雜質(zhì)的個(gè)數(shù)多少論質(zhì)量。 對(duì)核黃素磷酸鈉，引起重視的應(yīng)是分離度方法的問題，在有了好的分離度方法基礎(chǔ)上，再根據(jù)每一個(gè)成分的安全性和生產(chǎn)工藝的成本，考慮對(duì)每一個(gè)成分的合理控制，這是有關(guān)物質(zhì)研究的重點(diǎn)。在可能的情況下，推薦使用國外藥典標(biāo)準(zhǔn)的有關(guān)物質(zhì)檢查方法和限度。建議在仿制原料藥時(shí)，首先應(yīng)查閱國外藥典同品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，借鑒國外的有關(guān)物質(zhì)檢查方法和限度，減少建立方法學(xué)和質(zhì)量研究工作的盲目性。在未有文獻(xiàn)可借鑒時(shí)，根據(jù)我國實(shí)際的研究水平，建立有關(guān)物質(zhì)的檢查方法。其二，由于國內(nèi)仿制的原料藥是可以豁免臨床研究的，不同的合成工藝對(duì)主藥的影響不同，而可能的中間體、副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物會(huì)不同。有關(guān)物質(zhì)方法的確定一定要以工藝中的理論上的各成