CN102526717A一種吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的制備方法

CN102526717A一種吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的制備方法 (10)申請(qǐng)公布號(hào)102526717A (43)申請(qǐng)公布日xx.07.04102526717A*102526717A* (21)申請(qǐng)?zhí)杧x10382612.8 (22)申請(qǐng)日xx.11.25A61K39/116(xx.01)A61P31/04(xx.01)A61K39/05(xx.01)A61K39/08(xx.01)A61K39/10(xx.01) (71)申請(qǐng)人成都康華生物制品有限公司地址610100四川省成都市國(guó)家經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)北京路182號(hào) (72)發(fā)明人侯文禮廖常茹馮曉趙志鵬鐘澤榮 (74)專(zhuān)利代理機(jī)構(gòu)四川省成都市天策商標(biāo)專(zhuān)利事務(wù)所51213代理人劉興亮 (54)發(fā)明名稱(chēng)一種吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的制備方法 (57)摘要本發(fā)明涉及利用百日咳、白喉、破傷風(fēng)菌種培養(yǎng)類(lèi)毒素制備百白破疫苗的方法，所述方法采用硫酸銨鹽析、密度梯度離心、戊二醛脫毒的方式來(lái)制備包含有效抗原PT和FHA的無(wú)細(xì)胞百日咳原液，通過(guò)將制備所得到的百日咳原液與精致純化得到的白喉類(lèi)毒素和破傷風(fēng)毒素混合最終制備得到可用于預(yù)防百日咳、白喉、破傷風(fēng)三種疾病的無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗。 (51)Int.Cl.權(quán)利要求書(shū)2頁(yè)說(shuō)明書(shū)10頁(yè)附圖1頁(yè) (19)中華人民共和國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局 (12)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)權(quán)利要求書(shū)2頁(yè)說(shuō)明書(shū)10頁(yè)附圖1頁(yè)1/2頁(yè)21.一種制備吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其通過(guò)將制備所得到的百日咳原液與精致純化得到的白喉類(lèi)毒素和破傷風(fēng)毒素混合最終制備得到可用于預(yù)防百日咳、白喉、破傷風(fēng)三種疾病的無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗，其特征在于，所述方法包括如下步驟 (1)采用包括戊二醛解毒步驟的方法來(lái)制備包含有效抗原PT和FHA的無(wú)細(xì)胞百日咳原液，其中戊二醛解毒是將梯度離心后的中間品用PBS稀釋為50gPN/ml，然后加入戊二醛使其最終濃度為0.5，置于20脫毒，每1小時(shí)振搖一次，然后加入賴(lài)氨酸溶液，使其最終濃度為0.2，置于20作用3小時(shí)； (2)采用包括甲醛解毒步驟的方法來(lái)制備白喉類(lèi)毒素和破傷風(fēng)毒素，其中制備白喉類(lèi)毒素時(shí)甲醛解毒的具體操作條件為選擇0.5的甲醛，經(jīng)調(diào)pH至7.07.2，在3739下脫毒，然后加入賴(lài)氨酸(9.125)，脫毒42天左右；制備破傷風(fēng)毒素時(shí)甲醛解毒的具體操作條件為甲醛0.15，放置于37溫箱中加溫脫毒25天。 2.權(quán)利要求1所述的制備吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于用于制備百日咳原液的菌種為百日咳I相菌種58003(CS)。 3.權(quán)利要求1所述的制備吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于百日咳I相菌種58003(CS)的接種發(fā)酵罐培養(yǎng)條件為將配制好SSM培養(yǎng)基加入10L發(fā)酵罐，接種細(xì)菌的培養(yǎng)濃度為3.0108/ml，培養(yǎng)溫度為37，通氣量4060L/min，壓力0.1kg/cm2，攪拌器的轉(zhuǎn)速設(shè)定為350rpm。 4.權(quán)利要求1所述的制備吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于制備無(wú)細(xì)胞百日咳原液的方法還包括硫酸銨鹽析、密度梯度離心步驟。 5.權(quán)利要求4所述的制備吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于制備無(wú)細(xì)胞百日咳原液的硫酸銨鹽析是二次鹽析。 6.權(quán)利要求5所述的制備吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于硫酸銨鹽析的具體操作條件如下收集培養(yǎng)物并加入低濃度的硫酸銨進(jìn)行一次鹽析，7日后經(jīng)3500rpm離心40分鐘，棄上清，沉淀中加入PBS進(jìn)行一次浸提，每天攪拌2次，每次40分鐘，經(jīng)7000rpm離心60分鐘棄沉淀、上清液中加高濃度的硫酸銨二次鹽析、經(jīng)9000rpm離心60分鐘，收集沉淀加入PBS二次浸提3天，每天攪拌2次，每次1小時(shí)，包袋透析，銨根檢測(cè)合格后，透析內(nèi)液經(jīng)16000rpm離心3小時(shí)后收取上層清液。 7.權(quán)利要求4所述的制備吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于制備無(wú)細(xì)胞百日咳原液的密度梯度離心是經(jīng)30000rpm蔗糖密度梯度離心1820小時(shí)除去內(nèi)毒素，收集糖濃度為412之間的樣品。 8.權(quán)利要求1所述的制備吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于在制備無(wú)細(xì)胞百日咳原液時(shí)，進(jìn)行戊二醛脫毒后，將所得原液包透析袋，每袋200300ml，置于28，透析7日，進(jìn)行戊二醛殘量檢測(cè)。 9.權(quán)利要求1所述的制備吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于制備得到的百日咳原液、白喉類(lèi)毒素和破傷風(fēng)毒素后，配置13mg/ml的氫氧化鋁，高壓滅菌，將氫氧化鋁用生理鹽水稀釋至24mg/ml，將百日咳原液、精制白喉和破傷風(fēng)類(lèi)毒素加入氫氧化鋁，于20-25攪拌吸附4小時(shí)。 10.權(quán)利要求9所述的方法制備得到的吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗，其特征在于獲得百日咳有效抗原PT和FHA，經(jīng)過(guò)檢測(cè)這兩種有效抗原的純度達(dá)到85以上，且含無(wú)細(xì)胞權(quán)利要求書(shū)102526717A22/2頁(yè)3百日咳疫苗效價(jià)應(yīng)不低于4.0IU，白喉疫苗效價(jià)應(yīng)不低于30IU，破傷風(fēng)疫苗效價(jià)應(yīng)不低于40IU。 權(quán)利要求書(shū)102526717A31/10頁(yè)4一種吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的制備方法技術(shù)領(lǐng)域0001本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及利用百日咳、白喉、破傷風(fēng)菌種培養(yǎng)類(lèi)毒素制備成百白破疫苗，用于預(yù)防百日咳、白喉、破傷風(fēng)三種疾病。 背景技術(shù)0002百日咳是一種常見(jiàn)的、傳染性極強(qiáng)的呼吸道感染性疾病。 百日咳病在中醫(yī)上稱(chēng)為天哮嗆、鷺鶿吼、疫咳等，我國(guó)早在十一世紀(jì)就有關(guān)于此病的治療方法。 1840年Monlton提到過(guò)百日咳病，1876年Sydenham詳細(xì)描述了該病，稱(chēng)之為劇烈咳嗽的病。 1900年由Bordet和Gengon在患兒的咳痰涂片內(nèi)找到了百日咳桿菌。 由于該菌初次分離營(yíng)養(yǎng)要求較高，直到1906年他們采用了血液-甘油-馬鈴薯培養(yǎng)基才獲得純種。 百日咳桿菌能引起人類(lèi)急性呼吸道傳染病，傳染力強(qiáng)，發(fā)病持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，故稱(chēng)百日咳(whoop cough或Pertussis)。 百日咳桿菌能引起人類(lèi)百日咳，以嬰幼兒患者居多，主要是易感者與患者密切接觸后，通過(guò)飛沫空氣傳播感染。 百日咳病程較長(zhǎng)，大約57周或更長(zhǎng)，常見(jiàn)有流感嗜血桿菌、A群鏈球菌和肺炎球菌的繼發(fā)感染，具有嚴(yán)重的預(yù)后結(jié)果，最常見(jiàn)的合并癥為肺炎，是導(dǎo)致百日咳患兒死亡的主要原因。 在患病的早期使用抗生素可能有效，百日咳桿菌對(duì)紅霉素、氯霉素、氨芐青霉素、多粘菌素等抗生素均有較敏感。 若在百日咳潛伏期和卡他期立即使用這些藥物可以縮短病程，減輕病情。 但是，如果進(jìn)入了百日咳痙咳期，則所有抗菌素效果都不明顯。 百日咳桿菌致病機(jī)理至今尚不十分清楚。 但體液內(nèi)存在一定的抗體水平可保護(hù)機(jī)體免受百日咳桿菌感染已被證實(shí)。 自20世紀(jì)30年代Medson等制成百日咳菌體疫苗以來(lái)，已在世界各國(guó)使用近60年。 百日咳菌體疫苗在預(yù)防和控制百日咳中發(fā)揮了巨大的作用，使百日咳成為用疫苗可以預(yù)防的傳染病，已列入世界衛(wèi)生組織推行的擴(kuò)大免疫計(jì)劃(Expend ProgrammeImmunization，EPI)中要控制的和消滅的傳染病之一。 0003破傷風(fēng)是一種嚴(yán)重的疾病，它多發(fā)生于創(chuàng)傷后，由于患者傷口被破傷風(fēng)桿菌感染，在厭氧的條件下產(chǎn)生大量的毒素，進(jìn)而侵害神經(jīng)組織，導(dǎo)致患者全身性肌肉強(qiáng)直和陣發(fā)性痙攣，死于窒息及全身性衰竭。 它多是散在發(fā)生，感染與發(fā)病也需要特定的條件，即創(chuàng)傷、污染、破傷風(fēng)桿菌及厭氧條件。 破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)生的毒素經(jīng)甲醛解毒后，形成類(lèi)毒素，可用于人群免疫接種，形成自動(dòng)免疫，該方法是1925年通過(guò)動(dòng)物法注射類(lèi)毒素后，在血清中可測(cè)出相應(yīng)的抗體，并能抗破傷風(fēng)感染。 0004白喉是一種嚴(yán)重的世界性的呼吸道傳染病，人類(lèi)是白喉?xiàng)U菌的唯一宿主。 它是由白喉棒狀桿菌侵入到上呼吸道粘膜上皮組織，生長(zhǎng)繁殖并產(chǎn)生外毒素引起炎癥，產(chǎn)生纖維性滲出和組織破壞，形成典型的假膜，這種假膜牢固的附著在粘膜上，可引起呼吸障礙甚至窒息，同時(shí)白喉外毒素不斷由病灶吸收，引起全身性中毒性癥狀、器官損害和急性死亡，主要是心肌、神經(jīng)系統(tǒng)、肝、腎及腎上腺等器官的損害。 自1923年發(fā)現(xiàn)經(jīng)用甲醛處理白喉毒素后，可使白喉毒素的毒性消失而保持免疫原性，注射動(dòng)物可產(chǎn)生中和抗體。 0005我國(guó)目前應(yīng)用于計(jì)劃免疫預(yù)防百日咳、白喉、破傷風(fēng)疾病的疫苗主要是在全細(xì)胞百日咳疫苗中加入白喉、破傷風(fēng)類(lèi)毒素的聯(lián)合疫苗。 自五十年代初我國(guó)已經(jīng)開(kāi)始生產(chǎn)該種說(shuō)明書(shū)102526717A42/10頁(yè)5疫苗，至今已使用了半個(gè)多世紀(jì)。 雖然近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，在世界范圍內(nèi)許多國(guó)家已經(jīng)廣泛應(yīng)用了疫苗，大大降低了白喉和破傷風(fēng)疾病的發(fā)病率，但有關(guān)研究表明，在疫苗接種不完全區(qū)域的人群中仍時(shí)有百日咳和白喉發(fā)生，處于地方性低水平流行。 在20世紀(jì)70年代末至80年代初，在一些發(fā)達(dá)國(guó)家，如英國(guó)、瑞典、意大利和日本等由于停止百日咳菌體疫苗接種，發(fā)病率大幅度上升。 1993年瑞典報(bào)告在未免疫的兒童中，60在10歲前發(fā)生過(guò)典型的百日咳癥狀，其中90兒童的血清百日咳毒素抗體呈陽(yáng)性反應(yīng)。 因此，百日咳疫苗接種的長(zhǎng)期性和保證完成全程免疫是非常重要和關(guān)鍵。 根據(jù)WHO近期統(tǒng)計(jì)，全球每年仍有百日咳病人近4000萬(wàn)，35.7萬(wàn)人死亡。 如非洲，發(fā)病率為2000/10萬(wàn)，5歲以下兒童的發(fā)病率高達(dá)2060。 在歐洲發(fā)病率約為0.35/10萬(wàn)85/10萬(wàn)。 在美國(guó)，百日咳的發(fā)病率從1981年的0.5/10萬(wàn)增加到1993年的2.6/10萬(wàn)；澳大利亞盡管3針基礎(chǔ)免疫覆蓋率高達(dá)90，百日咳發(fā)病率從1991年的2/10萬(wàn)增加到1994年的30.5/10萬(wàn)。 在荷蘭疫苗接種率高達(dá)95，1996年仍發(fā)生了大范圍的流行，發(fā)病率達(dá)18/10萬(wàn)。 在我國(guó)，目前尚無(wú)百日咳感染的確切流行病學(xué)資料，盡管自1985年中國(guó)推行計(jì)劃免疫，將百白破聯(lián)合疫苗納入第一批計(jì)劃免疫的疫苗，使得百日咳的發(fā)病率急劇下降。 但是，由于全細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗易產(chǎn)生的副反應(yīng)，嚴(yán)重影響了劃免疫的實(shí)施，使常規(guī)免疫的全國(guó)覆蓋率尚未真正達(dá)到85，造成百日咳的局部暴發(fā)流行的情況。 如貴州省某鎮(zhèn)1997年發(fā)生暴發(fā)流行，發(fā)病率高達(dá)20.55(285例/總?cè)丝?387)，其中7歲以下兒童占44，此次流行與疫苗接種率低、易感人群累積有關(guān)。 浙江麗水報(bào)告，1984-1992年百日咳的發(fā)病率仍達(dá)17.24/10萬(wàn)。 由于百日咳在發(fā)病的早期癥狀不典型，不易診斷，但傳染性卻很強(qiáng)，所以難以控制傳染源和切斷傳播途徑，只有通過(guò)預(yù)防接種百日咳疫苗，減少易感人群，提高人群對(duì)百日咳的免疫水平，形成免疫屏障，才能達(dá)到控制和消滅百日咳的目的。 有關(guān)流行病學(xué)調(diào)查證明全細(xì)胞百日咳疫苗對(duì)于控制百日咳疾病的流行非常有效，免疫人群后可提供中至高水平的保護(hù)作用。 英國(guó)在1978年和1981年發(fā)生了兩次因停止接種全細(xì)胞百日咳疫苗后最為嚴(yán)重的百日咳流行。 1979年日本由于疫苗接種事故停止接種疫苗，使百日咳發(fā)生率大幅度上升。 然而，由于全細(xì)胞百日咳疫苗具有復(fù)雜的生物學(xué)性狀，而且有關(guān)其效力與毒性之間的關(guān)系不甚明了，因此盡管接種全細(xì)胞百日咳疫苗后是否會(huì)引起腦病已爭(zhēng)論了許多年，但是，因接種疫苗引起或誘發(fā)嚴(yán)重副反應(yīng)仍然是一個(gè)世界性的問(wèn)題。 0006與百日咳疫苗接種相關(guān)的副反應(yīng)可以分為兩大類(lèi)。 一類(lèi)是常見(jiàn)副反應(yīng)，包括局部和全身輕微副反應(yīng)，前者如注射局部發(fā)生紅暈、疼痛、腫脹，在接種百日咳菌體疫苗后的發(fā)生率為50；后者如發(fā)燒、煩躁、嗜睡、厭食等副反應(yīng)，吸附無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗、白喉、破傷風(fēng)類(lèi)毒素聯(lián)合疫苗(DTaP)明顯比白喉和破傷風(fēng)類(lèi)毒素二聯(lián)疫苗(DT)的副反應(yīng)高。 另一類(lèi)為不尋常的副反應(yīng)，局部的有硬結(jié)和化膿，血管神經(jīng)性水腫等，全身副反應(yīng)有嘔吐、持續(xù)哭叫、蕁麻疹等，嚴(yán)重的可發(fā)生驚厥、虛脫、休克等，極少數(shù)人可引起永久性腦損傷。 我國(guó)在1988年由中國(guó)藥品生物制品檢定所組織進(jìn)行了百日咳菌體疫苗人體接種反應(yīng)觀察，體溫38.5以上的中強(qiáng)反應(yīng)6-8h為1.62-10.57，24h為2.5-11.5，48h為0-3.84。 局部中強(qiáng)反應(yīng)24h為0-4.38，48h為0-3.22，72h為0-2.63。 化膿發(fā)生率為0.87。 0007由于百白破疫苗中白喉、破傷風(fēng)兩種類(lèi)毒素是已經(jīng)被提純精制過(guò)的有效蛋白抗原，而百日咳則為全細(xì)菌體制劑，即包含所有的有效抗原和毒性成分，所以注射百白破疫苗所發(fā)生的反應(yīng)一般為百日咳所含的毒性組分所引起的異常反應(yīng)，如接種后發(fā)生的發(fā)燒、紅說(shuō)明書(shū)102526717A53/10頁(yè)6腫、硬結(jié)等，并不是疫苗本身所應(yīng)該具備的性狀，而是該疫苗本身含有除了人們所需要的有效抗原成分以外，同時(shí)所含的有害成分所引起的異常反應(yīng)。 而有害成分對(duì)于過(guò)敏體質(zhì)或已被某些細(xì)菌、病毒隱性感染的接種者較容易引起變態(tài)反應(yīng)。 而有害成分存在量也是疫苗質(zhì)量的反映。 接種百、白、破疫苗后發(fā)生的異常反應(yīng)還有以下幾種嚴(yán)重異常反應(yīng)0008過(guò)敏性合并癥1)過(guò)敏性休克；2)過(guò)敏性皮疹；3)血管神經(jīng)性水腫；0009神經(jīng)系統(tǒng)合并癥1)腦病；2)神經(jīng)炎及神經(jīng)根炎；3)變態(tài)性腦脊髓炎。 0010百白破疫苗中的百日咳菌體易誘發(fā)潛伏感染，或使原有的疾病加重。 尤其過(guò)敏體質(zhì)和已被某些細(xì)菌、病毒隱性感染的接種者容易發(fā)生嚴(yán)重異常反應(yīng)。 但是根據(jù)計(jì)劃免疫的要求，白、破兩種類(lèi)毒素幾乎總是與百日咳疫苗合并使用，用于兒童計(jì)劃免疫，因此菌體百日咳引起的副反應(yīng)大大干擾了白喉和破傷風(fēng)類(lèi)毒素的免疫接種。 有些國(guó)家在百日咳發(fā)病率大幅度降低的情況下，由于接種疫苗后所引起的上述嚴(yán)重副反應(yīng)，使人們抵制接受百日咳疫苗，如英國(guó)、瑞典和日本等國(guó)都一度停止了百日咳疫苗的接種，隨后這些國(guó)家的百日咳發(fā)病率急劇上升。 鑒于此種情況自20世紀(jì)70年代起對(duì)百日咳桿菌進(jìn)行了更加深入的研究，研制和純化了包百日咳毒素、絲狀血凝素、百日咳粘著素等近20種百日咳菌的生物活性成分。 本在研究的基礎(chǔ)上，于1981年率先研制成功主要含有百日咳毒素和絲狀血凝素?zé)o細(xì)胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaine，APV)，并替代百日咳菌體疫苗(whole cell pertussis vaine，WPV)，用于免疫2歲以上兒童，并于1989年開(kāi)始使用吸附無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗、白喉、破傷風(fēng)類(lèi)毒素聯(lián)合疫苗(adsorbed acellularpertussisvaine，iphtheria toxiod，tetanus toxoidbined vaine；DTaP)，用于3月齡嬰兒的基礎(chǔ)免疫，至今已累計(jì)使用了幾千多萬(wàn)針次，使百日咳的發(fā)病率重新下降，并且達(dá)到歷史最低點(diǎn)。 20世紀(jì)90年代以來(lái)在瑞典、美國(guó)、德國(guó)、意大利、塞內(nèi)加爾以及中國(guó)等國(guó)家，對(duì)近20多種不同的DTaP免疫效果、接種反應(yīng)等進(jìn)行了臨床觀察。 結(jié)果證明，盡管不同DTaP的免疫保護(hù)率有所差異，但DTaP具有與吸附百日咳全細(xì)胞疫苗、白喉、破傷風(fēng)類(lèi)毒素聯(lián)合疫苗(adsorbed wholecellpertussisvaine，diphtheriatoxiod，tetanus toxoidbinedvaine；DTwP)同樣免疫保護(hù)效果。 此外，不論從日本歷年累計(jì)的接種反應(yīng)資料，還是其他國(guó)家的臨觀察資料，都證明DTaP的副反應(yīng)明顯低于DTwP23。 目前從世界范圍內(nèi)，各國(guó)的百日咳疫苗都處于更新?lián)Q代的階段，即新的無(wú)細(xì)胞百白破疫苗逐步取代傳統(tǒng)的菌體百白破疫苗。 至今已有近30個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)使用DTaP或正在進(jìn)行DTaP的臨床評(píng)估。 目前，歐美、加拿大和日本等國(guó)已普遍使用無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗。 我國(guó)是于80年代中期開(kāi)始研制無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗，90年代中期獲得正式生文號(hào)。 無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗的生產(chǎn)工藝是沿用日本的無(wú)細(xì)胞百日咳生產(chǎn)工藝進(jìn)行生產(chǎn)。 工藝基本上包括大發(fā)酵罐培養(yǎng)細(xì)菌，硫酸銨沉淀，高鹽濃度提取、透析和糖梯度離心等。 由于我國(guó)人口眾多，每年出生嬰兒逾二千萬(wàn)，目前無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗生產(chǎn)廠家的生產(chǎn)量較低，只有極少數(shù)兒童才能使用無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗，因此，從我國(guó)的計(jì)劃免疫預(yù)防工作的安全性和與國(guó)際接軌的要求來(lái)看，我國(guó)急需大力生產(chǎn)和發(fā)展自己的無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗，滿足每年出生嬰兒逾二千萬(wàn)的免疫接種的需要，從而在我國(guó)實(shí)現(xiàn)以安全、有效的無(wú)細(xì)胞百白破疫苗全面替代全細(xì)菌體百白破疫苗，造福于廣大兒童。 0011 2、各國(guó)的無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的現(xiàn)狀00121981年日本的佐藤教授等人在純化出LPF和FHA兩種抗原的基礎(chǔ)上，在世界上第一次研制成功了含有兩種抗原成分的無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗，并且與白喉和傷風(fēng)類(lèi)毒素聯(lián)合成說(shuō)明書(shū)102526717A64/10頁(yè)7無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗。 該疫苗在日本開(kāi)始正式使用，目前日本已經(jīng)全部取代了老的菌體百白破疫苗用于兒童計(jì)劃免疫接種。 1992年美國(guó)正式批準(zhǔn)使用日本生產(chǎn)的無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗。 中國(guó)自80年代開(kāi)始研制無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗，目前我國(guó)已有無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗正式產(chǎn)品，已經(jīng)在我國(guó)許多省份用于兒童計(jì)劃免疫，由于該類(lèi)型疫苗接種反應(yīng)好于老的百白破疫苗，很受?chē)?guó)內(nèi)歡迎，產(chǎn)品供不應(yīng)求。 0013目前，無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗的配方在國(guó)際上有所不同，白喉和破傷風(fēng)類(lèi)毒素的使用量也不同，成品中的吸附劑含量也有區(qū)別，按照含有百日咳抗原的類(lèi)型主要分為幾種1)PT+FHA；2)PT+FHA+Prn；3)PT+FHA+Prn+Agg2，325。 歐洲使用比較多的是第2和第3種。 美國(guó)使用的主要是第1和第2種，中使用的是第一種配方，生產(chǎn)工藝是參照日本的無(wú)細(xì)胞百日咳生產(chǎn)工藝進(jìn)行生產(chǎn)，我國(guó)的無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗已納入中國(guó)生物制品規(guī)程2000版中。 0014 3、吸附無(wú)細(xì)胞百白破疫苗使用情況00151981年日本率先研制成功含有PT、FHA的無(wú)細(xì)胞百白破疫苗，到目前日本全國(guó)已經(jīng)全部使用無(wú)細(xì)胞百、白、破疫苗用于預(yù)防百日咳、白喉和破傷風(fēng)三種嚴(yán)重傳染病，日本自1989年起累計(jì)使用了3千多萬(wàn)人次。 世界衛(wèi)生組織自1986年組織在瑞典進(jìn)行了第一次臨床試用無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗起，至今世界上有十多個(gè)國(guó)家已經(jīng)使用了該類(lèi)疫苗。 美國(guó)每年從日本進(jìn)口無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗原液，用于兒童免疫預(yù)防百日咳。 亞洲除日本外，印尼、泰國(guó)、韓國(guó)和臺(tái)灣地區(qū)都從日本進(jìn)口無(wú)細(xì)胞百白破疫苗用于免疫接種。 中國(guó)許多較發(fā)達(dá)地區(qū)已經(jīng)開(kāi)始大范圍使用無(wú)細(xì)胞百白破疫苗，但是由于生產(chǎn)的疫苗數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要，造成很大的疫苗供應(yīng)缺口。 發(fā)明內(nèi)容0016要解決的技術(shù)問(wèn)題0017本發(fā)明的目的之一是提供一種副反應(yīng)更小，免疫原性更高，接種更安全，接種人群更廣泛的新疫苗及其制備方法。 0018本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，通過(guò)將制備所得到的百日咳原液與精致純化得到的白喉類(lèi)毒素和破傷風(fēng)毒素混合最終制備得到可用于預(yù)防百日咳、白喉、破傷風(fēng)三種疾病的無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗，其特征在于，所述方法采用包括戊二醛解毒步驟的方法來(lái)制備包含有效抗原PT和FHA的無(wú)細(xì)胞百日咳原液，其中戊二醛解毒是將梯度離心后的中間品用PBS稀釋為50gPN/ml，然后加入戊二醛使其最終濃度為0.5，置于20脫毒，每1小時(shí)振搖一次，然后加入賴(lài)氨酸溶液，使其最終濃度為0.2，置于20作用3小時(shí)；采用包括甲醛解毒步驟的方法來(lái)制備白喉類(lèi)毒素和破傷風(fēng)毒素，其中制備白喉類(lèi)毒素時(shí)甲醛解毒的具體操作條件為選擇0.5的甲醛，經(jīng)調(diào)pH至7.07.2，在3739下脫毒，然后加入賴(lài)氨酸(9.125)，脫毒42天左右；制備破傷風(fēng)毒素時(shí)甲醛解毒的具體操作條件為甲醛0.15，放置于37溫箱中加溫脫毒25天。 制備百日咳原液的菌種為百日咳I相菌種58003(CS)，其接種發(fā)酵罐培養(yǎng)條件為將配制好SSM培養(yǎng)基加入10L發(fā)酵罐，接種細(xì)菌的培養(yǎng)濃度為3.0108/ml，培養(yǎng)溫度為37，通氣量4060L/min，壓力0.1kg/cm2，攪拌器的轉(zhuǎn)速設(shè)定為350rpm。 制備無(wú)細(xì)胞百日咳原液的方法還包括硫酸銨鹽析、密度梯度離心步驟，其中的硫酸銨鹽析是二次鹽析，硫酸銨鹽析的具體操作條件如下收集培養(yǎng)物并加入低說(shuō)明書(shū)102526717A75/10頁(yè)8濃度的硫酸銨進(jìn)行一次鹽析，7日后經(jīng)3500rpm離心40分鐘，棄上清，沉淀中加入PBS進(jìn)行一次浸提，每天攪拌2次，每次40分鐘，經(jīng)7000rpm離心60分鐘棄沉淀、上清液中加高濃度的硫酸銨二次鹽析、經(jīng)9000rpm離心60分鐘，收集沉淀加入PBS二次浸提3天，每天攪拌2次，每次1小時(shí)，包袋透析，銨根檢測(cè)合格后，透析內(nèi)液經(jīng)16000rpm離心，3小時(shí)收上清。 制備無(wú)細(xì)胞百日咳原液的的密度梯度離心是經(jīng)30000rpm蔗糖密度梯度離心1820小時(shí)除去內(nèi)毒素，收集糖濃度為412之間的樣品。 在制備無(wú)細(xì)胞百日咳原液時(shí)，進(jìn)行戊二醛脫毒后，將所得原液包透析袋，每袋200300ml，置于28，透析7日，進(jìn)行戊二醛殘量檢測(cè)。 制備得到百日咳原液、白喉類(lèi)毒素和破傷風(fēng)毒素后，配置13mg/ml的氫氧化鋁，高壓滅菌，將氫氧化鋁用生理鹽水稀釋至24mg/ml，將百日咳原液、精制白喉和破傷風(fēng)類(lèi)毒素加入氫氧化鋁，于20-25攪拌吸附4小時(shí)。 0019本發(fā)明采用硫酸銨鹽析法，再經(jīng)過(guò)蔗糖密度梯度離心，去除內(nèi)毒素，獲得百日咳有效抗原PT和FHA，經(jīng)過(guò)檢測(cè)這兩種有效抗原的純度完全可以達(dá)到國(guó)家藥典要求的“純度達(dá)到85以上”的標(biāo)準(zhǔn)。 0020 1、選取菌株制備培養(yǎng)基00211.1菌株00221.1.1百日咳I相菌58003(CS)菌株中國(guó)藥品生物制品檢定所00231.1.2白喉棒狀桿菌菌株(PW8)菌株中國(guó)藥品生物制品檢定所00241.1.3破傷風(fēng)厭氧芽孢桿菌菌株(L58)菌株中國(guó)藥品生物制品檢定所00251.2培養(yǎng)基00261.2.1包-姜氏培養(yǎng)基00271.2.2改良林氏培養(yǎng)基00281.2.3半固體碎肉培養(yǎng)基00291.2.4綜合培養(yǎng)基和半綜合培養(yǎng)基00301.2.5改良馬丁培養(yǎng)基和牛肉消化的林氏培養(yǎng)基00311.2.6雙胨培養(yǎng)基0032上述培養(yǎng)基均由公司培養(yǎng)基組提供00331.3試劑00341.3.1百日咳I相標(biāo)準(zhǔn)血清(93-1)中國(guó)藥品生物制品檢定所00351.3.2百日咳分型血清 1、 2、3型(84-1)中國(guó)藥品生物制品檢定所0036所用化學(xué)試劑均為分析純，0037 2、菌種庫(kù)的建立及鑒定00382. 1、百日咳菌種庫(kù)的建立及檢定0039將原始種子批的凍干菌種啟開(kāi)后接種于包-姜氏(含25羊血)培養(yǎng)基上，于3537，培養(yǎng)不超過(guò)72小時(shí)，以后各代不超過(guò)48小時(shí)，傳至第4代，培養(yǎng)24小時(shí)，刮下菌苔，于脫脂牛奶內(nèi)混勻，分裝后冷凍干燥，真空封口，-20保存，為主代種子批菌種。 0040主代種子批菌種檢定啟開(kāi)1支主代種子批菌種，于改良B-G固體培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)72小時(shí)，檢查菌落生長(zhǎng)情況為光滑凸起，灰白色不透明露滴狀小菌落，菌落周?chē)胁磺逦苎h(huán)。 傳3代，37培養(yǎng)48小時(shí)，菌苔生長(zhǎng)不透明，灰白色，光滑，濕潤(rùn)；刮取菌苔，進(jìn)行以下檢定說(shuō)明書(shū)102526717A86/10頁(yè)900412.1.1菌落形態(tài)為光滑凸起，灰白色不透明露滴狀小菌落，菌落周?chē)胁磺逦苎h(huán)。 00422.1.2革蘭氏染色革蘭氏陰性短小卵圓形桿菌。 00432.1.3血清學(xué)特性標(biāo)準(zhǔn)診斷血清購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。 0044試管凝集試驗(yàn)百日咳I相標(biāo)準(zhǔn)血清批號(hào)93-1；刮取菌苔，用比濁法測(cè)定菌液濃度，并用0.85NaCl溶液稀釋至30億/ml。 血清稀釋度200、400、800、1600、3200、6400、12800，每管加入以上稀釋度血清0.5ml，加菌液(30億/ml)0.5ml，使之實(shí)際血清稀釋度為400、800、1600、3200、6400、12800，混勻，置3過(guò)夜，再靜置室溫2小時(shí)，判斷凝集效。 0045玻片凝集試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)分型因子血清批號(hào)84-1( 1、 2、3型)，將標(biāo)準(zhǔn)分型血清分別與刮下的菌苔進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)。 00462.1.4生化檢定0047各管加菌液(60億/ml)0.5ml，混勻后置35-37培養(yǎng)7日，00482.1.5皮膚壞死試驗(yàn)0049用在37培養(yǎng)48小時(shí)的菌苔混懸液稀釋?zhuān)嗍笃?nèi)注射0.1ml，觀察72小時(shí)，記錄出血性壞死部位，用“+”表示。 00502.1.6菌種毒力試驗(yàn)0051用體重1618g之小鼠隨即分為3組，每組免疫10只，在麻醉狀態(tài)下從鼻腔滴入經(jīng)培養(yǎng)2028小時(shí)以PBS稀釋的菌液0.05mL，觀察14天，記錄小鼠生死情況，按ReedMuench法計(jì)算LD50，00522.1.7免疫效力試驗(yàn)0053分別用標(biāo)準(zhǔn)品和待檢品的不同稀釋度免疫小鼠(8只/組)，每只小鼠腹腔注射0.5ml。 免疫14天后，每只小鼠腦內(nèi)攻擊0.03ml含8萬(wàn)個(gè)菌的菌液 (18323)；同時(shí)進(jìn)行對(duì)照組毒力測(cè)定，對(duì)照組每稀釋度攻擊10只小鼠。 攻毒后，記錄小鼠14天內(nèi)死亡情況，計(jì)算出對(duì)照組LD50；并計(jì)算待檢菌種的IU值。 00542. 2、白喉棒狀桿菌菌種庫(kù)的建立及檢定0055將凍干的原始白喉棒狀桿菌菌種 (38007)啟開(kāi)后，接種于改良林氏培養(yǎng)基中管，34培養(yǎng)2448小時(shí)，再傳代于改良林氏培養(yǎng)基中管中，連續(xù)傳4代，離心后將菌體放置于脫脂牛奶內(nèi)混勻，分裝后冷凍干燥，真空封口，-20保存，為主代種子批菌種。 0056白喉棒狀桿菌菌種檢定將凍干的主代種子批白喉棒狀桿菌菌種 (38007)啟開(kāi)后，接種于改良林氏培養(yǎng)基中管，34培養(yǎng)2448小時(shí)，按照中國(guó)生物制品規(guī)程2000版中白喉菌種的檢定方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)凍干的白喉棒狀桿菌的主代種子批進(jìn)行以下菌種檢定。 00572.2.1培養(yǎng)及形態(tài)特性0058將培養(yǎng)好的白喉棒狀桿菌分別接種于以下三種不同的培養(yǎng)基上，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)特性的檢查。 0059方法和判定0060呂氏斜面培養(yǎng)菌苔呈灰白色，表面光滑突起；菌落圓形，邊緣整齊。 0061亞碲酸鉀平板培養(yǎng)菌落呈灰黑色具金屬光澤。 說(shuō)明書(shū)102526717A97/10頁(yè)100062血瓊脂平板培養(yǎng)菌落呈灰白色，不透明，不產(chǎn)生溶血素。 00632.2.2鏡檢及染色特性0064方法和判定0065將培養(yǎng)好的白喉棒狀桿菌進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察為深紫色，說(shuō)明革蘭氏染色陽(yáng)性，并且具有異染顆粒，桿狀的菌體呈一端或兩端膨大，菌體排列呈柵欄、X或Y。 00662.2.3生化特性0067將菌液接種于各生化培養(yǎng)基中，3537培養(yǎng)7日。 00682.2.4特異性中和反應(yīng)0069將接種于改良林氏培養(yǎng)基中管，34培養(yǎng)2448小時(shí)的白喉主代種子批的細(xì)菌接種于呂氏培養(yǎng)基上，進(jìn)行毒力測(cè)定。 0070方法和判定0071Elek平板毒力試驗(yàn)用濃度為1000Lf/ml的白喉抗毒素制成抗毒素濾紙條，平整鋪于Elek瓊脂培養(yǎng)基或適宜的白喉產(chǎn)毒培養(yǎng)基的雙碟上，倒置雙碟約1小時(shí)。 用白金接種環(huán)挑取呂氏培養(yǎng)物，與濾紙垂直劃線接種。 置于37孵箱，培養(yǎng)4872小時(shí)，觀察菌種生長(zhǎng)邊緣是否有白色沉淀線。 00722. 3、破傷風(fēng)芽孢桿菌菌種庫(kù)的建立及檢定0073將凍干的原始破傷風(fēng)厭氧芽孢桿菌菌株(L58)菌種啟開(kāi)后，接種于半固體碎肉培養(yǎng)基中管，放置于34孵箱，培養(yǎng)48小時(shí)，連續(xù)傳4代，離心后將菌體放置于脫脂牛奶內(nèi)混勻，分裝后冷凍干燥，真空封口，-20保存，為主代種子批菌種。 將破傷風(fēng)厭氧芽孢桿菌菌株(L58)主代種子批菌種啟開(kāi)后，接種于半固體碎肉培養(yǎng)基中管，放置于34培養(yǎng)48小時(shí)，收集菌體，用于以下菌種檢定內(nèi)容。 00742.3.1培養(yǎng)及形態(tài)特性由于破傷風(fēng)是專(zhuān)性厭氧桿菌，將培養(yǎng)好的破傷風(fēng)桿菌接種于不同培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)基形態(tài)特征檢測(cè)。 0075方法和判定0076在庖肉培養(yǎng)基中培養(yǎng)肉湯呈渾濁，產(chǎn)生氣體，具腐敗性惡臭。 0077血瓊脂平板培養(yǎng)菌落呈彌漫生長(zhǎng)。 0078半固體培養(yǎng)基經(jīng)48-72小時(shí)培養(yǎng)，穿刺線呈毛刷樣生長(zhǎng)，表現(xiàn)菌體鞭毛動(dòng)力。 00792.3.2鏡檢及染色特性0080方法和判定0081將破傷風(fēng)桿菌的初期培養(yǎng)菌體進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，少見(jiàn)芽孢。 培養(yǎng)48小時(shí)以后，可見(jiàn)芽孢，菌體呈鼓槌狀，芽孢位于頂端為正圓形。 00822.3.3生化特性0083將菌液接種于各生化培養(yǎng)基中，3537培養(yǎng)7日，00842.3.4產(chǎn)毒試驗(yàn)0085方法和判定0086破傷風(fēng)桿菌經(jīng)液體產(chǎn)毒培養(yǎng)基培養(yǎng)，過(guò)濾取培養(yǎng)液注射至少4只體重1822g小鼠，每只小鼠尾根部皮下注射0.1ml，于注射后1224小時(shí)觀察小鼠，出現(xiàn)尾部僵直豎起、后退強(qiáng)直痙攣或全身肌肉痙攣等癥狀。 00872.3.5特異性中和反應(yīng)說(shuō)明書(shū)102526717A108/10頁(yè)110088方法和判定0089取適量產(chǎn)毒培養(yǎng)濾液與相應(yīng)稀釋的破傷風(fēng)抗毒素經(jīng)體外中和后，注射4只體重18-22g小鼠，同時(shí)設(shè)立不結(jié)合破傷風(fēng)抗毒素的培養(yǎng)濾液注射小鼠，作為陽(yáng)性對(duì)照。 注射后每日觀察，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)明顯破傷風(fēng)癥狀并死亡，試驗(yàn)組小鼠存活。 附圖說(shuō)明0090圖1為吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗成品生產(chǎn)工藝流程圖。 具體實(shí)施方式0091例1無(wú)細(xì)胞百日咳原液、精制白喉和破傷風(fēng)類(lèi)毒素的制備00921. 1、無(wú)細(xì)胞百日咳原液的制備00931.1.1百日咳I相菌種58003(CS)接種與BG血培養(yǎng)基大管培養(yǎng)34代0094培養(yǎng)時(shí)間選擇3844小時(shí)，控制pH值8.5左右時(shí)，百日咳桿菌的菌體濃度和血凝活性較高。 00951.1.2接種發(fā)酵罐培養(yǎng)0096將配制好SSM培養(yǎng)基加入10L發(fā)酵罐，接種細(xì)菌的培養(yǎng)濃度為3.0108/ml，培養(yǎng)溫度為37，通氣量4060L/min，壓力0.1kg/cm2，攪拌器的轉(zhuǎn)速設(shè)定為350rpm。 培養(yǎng)至26個(gè)時(shí)開(kāi)始測(cè)量發(fā)酵液的pH，濃度，血凝，每隔3h取樣測(cè)量以上參數(shù)，共檢測(cè)發(fā)酵時(shí)間為50小時(shí)。 00971.1.3硫酸銨鹽析0098收集培養(yǎng)物并加入低濃度的硫酸銨進(jìn)行一次鹽析、7日后經(jīng)3500rPm離心40分鐘，棄上清，沉淀中加入PBS(0.05MPB、1MNaCl、0.1g/L硫柳汞、pH8.0)進(jìn)行一次浸提，每天攪拌2次，每次40分鐘。 經(jīng)7000rPm離心60分鐘棄沉淀、上清液中加高濃度的硫酸銨二次鹽析、經(jīng)9000rPm離心60分鐘，收集沉淀加入PBS(0.05MPB、1MNaCl、0.1g/L硫柳汞、pH8.0)二次浸提3天，每天攪拌2次，每次1小時(shí)，包袋透析，銨根檢測(cè)合格后，透析內(nèi)液經(jīng)16000rPm離心3小時(shí)收上清。 00991.1.4密度梯度離心0100經(jīng)30000rpm蔗糖密度梯度離心1820小時(shí)除去內(nèi)毒素，收集糖濃度為412之間的樣品。 其中含有PT和FHA組分。 01011.1.5戊二醛脫毒0102戊二醛解毒的濃度為，在222的溫度下解毒時(shí)間4小時(shí)。 0103將梯度離心后的中間品用PBS稀釋為50gPN/ml，然后加入戊二醛使之最終戊二醛濃度為0.5，置于20脫毒。 每1小時(shí)振搖一次。 然后加入賴(lài)氨酸溶液，使之最終濃度為0.2，置于20作用3小時(shí)。 01041.1.6無(wú)細(xì)胞百日咳原液0105包透析袋，每袋200300ml，置于28。 透析7日，進(jìn)行戊二醛殘量檢測(cè)。 合格后可收液，否則繼續(xù)透析，透析過(guò)程每日換透析液2次。 01061.1.7檢測(cè)及肯定的檢測(cè)結(jié)果0107經(jīng)檢測(cè)可以確定上述制備方法最終制備得到的產(chǎn)品中包含目標(biāo)抗原PT和FHA，且說(shuō)明書(shū)102526717A119/10頁(yè)12含量達(dá)到相應(yīng)的要求。 01081.2精制白喉類(lèi)毒素的制備01091.2.1菌種培養(yǎng)0110采用改良的林氏液體培養(yǎng)基，采用靜止培養(yǎng)和深層培養(yǎng)兩種培養(yǎng)方式。 深層培養(yǎng)方式可以補(bǔ)加氨基酸，調(diào)整pH，通過(guò)攪拌和控制通氧量及溫度，使得產(chǎn)毒水平大幅度增加。 0111a)大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)菌時(shí)發(fā)酵溫度控制在2435；0112b)pH的變化控制為開(kāi)始發(fā)酵時(shí)pH為7.88.2，以后隨著培養(yǎng)時(shí)間會(huì)逐步下降，約12小時(shí)以后，pH會(huì)從8.0逐步降到7.0，然后再逐步回升到8.0，通過(guò)補(bǔ)入適當(dāng)?shù)奶羌右钥刂苝H，在這種條件下說(shuō)明細(xì)菌生長(zhǎng)茂盛，產(chǎn)毒較好。 如果pH不斷下降，說(shuō)明細(xì)菌生長(zhǎng)不佳。 0113c)根據(jù)培養(yǎng)條件補(bǔ)充碳源和氮源，麥芽糖作為碳源，在pH發(fā)生變化時(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充。 在白喉?xiàng)U菌深層培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)氨基氮從1.41.6mg/ml下降到0.40.7mg/ml時(shí)，補(bǔ)充谷氨酸鈉，胱氨酸及生長(zhǎng)因子可使產(chǎn)毒單位從150Lf/ml提高到400Lf/ml。 控制培養(yǎng)時(shí)間在4550小時(shí)之間，這時(shí)的白喉毒素的Lf/ml產(chǎn)量基本保持穩(wěn)定，并且pH值也基本恒定在8.0左右的生產(chǎn)條件下較為合適。 01141.2.2上清硫酸銨鹽析0115采用硫酸銨分段沉淀法，第一段加入硫酸銨24-27(w/v)，過(guò)濾后收集濾液，第二段加入硫酸銨15-18(w/v)，過(guò)濾后收集沉淀。 經(jīng)過(guò)透析去除-NH4離子，再經(jīng)過(guò)除菌過(guò)濾，獲得大于1500Lf/ml的精制白喉類(lèi)毒素。 01161.2.3脫毒0117我們采用的解毒方式是首先將生產(chǎn)的精制毒素，毒素濃度過(guò)大，不宜解毒完善，精制后的毒素經(jīng)適當(dāng)稀釋至濃度為40Lf/ml左右時(shí)，再進(jìn)行解毒，解毒效果較完全，毒性不易發(fā)生逆轉(zhuǎn)。 然后再進(jìn)行解毒的工藝，這樣可以減少所生產(chǎn)的毒素?fù)p失。 精制毒素的解毒選擇了0.5的甲醛濃度，經(jīng)調(diào)pH至7.07.2，在3739下脫毒，經(jīng)一步脫毒和兩步的加深脫毒試驗(yàn)的比較，采用加入賴(lài)氨酸(9.125)，脫毒42天左右，控制了毒性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，并且能有效的保持抗原性。 01181.2.4除菌過(guò)濾