【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）水稻抗白葉枯病基因Xa23的圖位克隆作物遺傳育種博士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 水稻抗白葉枯病基因 圖位克隆 文摘要 植物抗病基因的研究一直是植物分子生物學(xué)研究的熱點之一，到目前為止已分離了 近 70個植物抗病基因。水稻中已經(jīng)鑒定 32 個主效抗白葉枯病基因， 其中 年已被分離克隆。在眾多的水稻抗白葉枯病基因中，被育種利用的并不多 。 所以克隆和研究新的抗白葉枯病基因是水稻抗病研究的客觀要求 。 從我國普通野生稻中鑒定發(fā)掘的 具有抗譜廣、完全顯性、全生育期抗性等特點，并已培育成以 金剛 30（ 背景的近等基因系 本研究利用 2代的 2562個單株為作圖群體，對 建； 序 ；遺傳轉(zhuǎn)化等 方法克隆 要結(jié)果如下： 1. 子標(biāo)記定位：根據(jù)日本水稻基因組計劃 數(shù)據(jù)，篩選并合成 12 個 記的引物，進(jìn)行親本間多態(tài)性檢測。找到 2 個在 有多態(tài)性的標(biāo)記 2群體中的 571個感病單株進(jìn)行分子檢測和連鎖分析， 結(jié)果表明 該標(biāo)記與 記輔助選擇的正確率接近 100%。 2. 利用相關(guān)基因組文庫進(jìn)行分子標(biāo)記定位：通過篩選水稻明恢 63的 庫和廣陸矮 4號的 得 15 個末端片段， 其中 6個 末端片段 在雙親間有多態(tài)性 ，分別為 69B、 81N、 45B、45N、 84N 和 84B。 這些標(biāo)記與 遺傳距離依次為 1.1 了 一側(cè)的遺傳圖譜，并使其遺傳距離縮短到 0.4 3. 開發(fā)新的 記 進(jìn)行 據(jù)國際水稻基因組計劃測序的水稻品種日本晴的序列及上述定位的區(qū)域為依據(jù) 設(shè)計 特異 引物， 共開發(fā)出 8 個 新的分子標(biāo)記 用這些標(biāo)記對 標(biāo)記 別為 于同一側(cè)， 遺傳距離 為 于基因另一側(cè)， 0 4. 構(gòu)建了 庫，該文庫包含 36,096 個克隆，平均插入片段 108蓋水稻基因組 。 用緊密連鎖標(biāo)記 記 到 5個陽性克隆 6471916 59建立了跨疊克隆群，將 因鎖定在 隆 6經(jīng)脈沖電泳檢測其插入片段為 80 5. 對 序列測定， 成功獲得 72115 續(xù)序列。通過基因預(yù)測共有 12 個開放閱讀框（ ，分別編碼不同的基因，根據(jù) 碼產(chǎn)物的同源性比較以及分子標(biāo)記的位置，最后鎖定 6 個 侯選基因。 6. 運用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將選取的 10 個侯選基因克隆載體轉(zhuǎn)化到受體品種中，共得到 1350株轉(zhuǎn)基因苗。其中侯選基因載體 化受體牡丹江的 258 株 轉(zhuǎn)基因苗，經(jīng)田間接種鑒定，有 23 株表現(xiàn)抗病，其中 17 株表現(xiàn)高抗， 6 株表現(xiàn)中抗。其它侯選基因克 隆的轉(zhuǎn)基因苗對小種表現(xiàn)感病。 潮霉素基因 交檢測抗病株拷貝數(shù)，高抗和中抗中既有單拷貝又有雙拷貝，證明所有抗病株都是轉(zhuǎn)基因。結(jié)果 表明 有的基因就是本研究所克隆的目標(biāo)基因成功克隆 因 。 7. 已知的其它已克隆的植物抗病基因都不同源，說明 因是一類新型的抗病基因。 關(guān)鍵詞 : 水稻，抗白葉枯病基因 位克隆 is of of of It is to in BB . its In a F2 562 AC of AC as 1 on 12 in 2 ST 189 189 in 189 00%. 2 A 3 a .8 NA by of ST 189 AC AC of 5 2 9B, 81N, 45B, 45N, 84N 4B as 9B, 81N, 45B, 45N, 84N 4B to .4 0.4 0.5 0.6 0.6 cM .1 3 on of we CR 2 on on 4 6,096 an 08on a 30of .1 AC 6471916O8 9F8 a AC O8 an 0Kb as 5. O8 by a 2115bp by (0 by 189 a 58 23 6. of 17 6. we 189 to 7. is a of 錄 中文摘要 V 英文摘要 錄 略詞表 一章 文 獻(xiàn) 綜 述 . 1 植物抗病基因研究進(jìn)展 . 1 植物一病原菌互作的分子機(jī)制 . 1 植物抗病基因克隆策略及方法 . 2 已克隆的抗病基因及功能 分析 . 9 水稻白葉枯病抗性基因研究進(jìn)展 . 14 水稻白葉枯病概述 . 14 水稻對白葉枯病的抗性 遺傳研究 . 15 水稻白葉枯病抗性基因的分子定位 . 18 水稻白葉枯病抗性基因的分離克隆 . 18 水稻抗白葉枯病的分子育種 . 22 第二章 論文選題及技術(shù)路線 . 24 立題依據(jù) . 24 研究目標(biāo)、內(nèi)容及方 法 . 25 研究目標(biāo) . 25 研究內(nèi)容 . 25 研究方法 . 25 技術(shù)路線 . 26 第三章 水稻抗白葉枯病基因 精細(xì)定位 . 27 前 言 . 27 . 27 材料與方法 . 27 結(jié)果與分析 . 29 論 . 31 利用相關(guān)基因組文庫加密 . 32 材料與方法 . 32 結(jié)果與分析 . 33 討 論 . 36 開發(fā)新的 記進(jìn)行 . 37 材料與方法 . 37 結(jié)果與分析 . 38 討 論 . 41 第四章 因近等基因系 庫構(gòu)建及跨疊克隆群 . 43 前 言 . 43 材料與方法 . 43 植物材料 . 43 載體 . 43 . 44 選 . 47 結(jié)果與分析 . 47 . 47 庫構(gòu)建 . 48 篩選陽性 . 50 構(gòu)建覆蓋 . 50 侯選陽性 克隆的穩(wěn)定性檢測及插入片段大小 . 51 討 論 . 52 構(gòu)建 庫優(yōu)化體系的建立 . 52 快 速篩選文庫的方法 . 53 覆蓋 因跨疊克隆群的構(gòu)建 . 53 第五章 庫構(gòu)建、測序及生物信息學(xué)分析 . 54 前 言 . 54 材料與方法 . 54 . 54 小片段 . 54 目標(biāo)片段 庫 . 55 亞克隆文庫的測序、拼接及預(yù)測 . 56 結(jié)果與分析 . 57 . 57 目的片段 . 57 克隆文庫構(gòu)建 . 58 序及拼接 . 59 生物信息學(xué)分析 . 59 X 討 論 . 61 庫測序應(yīng)注意的問題 . 61 序列拼接中的難題 . 62 基因組中的重復(fù)序列 . 62 關(guān)于 因座位 . 62 第六章 選基因的遺傳轉(zhuǎn)化及功能驗證 . 64 前 言 . 64 材料與方法 . 64 水稻轉(zhuǎn)化受體材料 . 64 篩選 庫 . 64 電極法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 . 65 水稻轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立 . 66 轉(zhuǎn)基 因植株的鑒定 . 67 結(jié)果與分析 . 68 篩選侯選基因的 . 68 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳 轉(zhuǎn)化 . 68 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定 . 69 . 73 討 論 . 73 轉(zhuǎn)化受體的選擇 . 73 選取 達(dá)載體的優(yōu)點 . 73 田間接種鑒定驗證轉(zhuǎn)基因的可靠性 . 73 轉(zhuǎn)基因植株分子檢測與田間接種鑒定不統(tǒng)一的原因 . 74 . 74 . 74 第七章 結(jié) 論 . 76 參考文獻(xiàn) . 77 致 謝 . 88 作者簡介 . 89 文 縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 2,4,4,46芐 青 霉素 乙酰丁香酮 部基本序列搜索工具 bp 基對 羧芐青霉素 頭孢噻吩鈉 CH 解酪蛋白 蒸無菌水 化已錠 達(dá)序列標(biāo)簽 潮霉素 哚乙酸 丙基 那霉素 堿基對 激動素 氨酸重復(fù) 苷酸結(jié)合位點 等基因系 放閱讀框 丙烯酰氨電泳 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 制性片段長度多態(tài)性 福平 分鐘轉(zhuǎn)速 核苷酸多態(tài)性 單序列重復(fù) 定序列標(biāo)簽位點 g 克 l 升 43中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué) 位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文 獻(xiàn) 綜 述 植物抗病基因研究進(jìn)展 植物一病原 菌互作的分子機(jī)制 植物在其整個生長期內(nèi)都會遭受各種病、蟲不同程度的侵害， 需要不斷地抵抗病原微生物和昆蟲的侵襲， 在長期的進(jìn)化過程中，這種植物與病原菌長期并存 ,相互影響，使植物逐漸獲得了一系列防御機(jī)制來保護(hù)自己。 雖然植物缺乏像動物一樣的循環(huán)系統(tǒng)和抗體，也缺乏特異的防衛(wèi)細(xì)胞，但它有一套區(qū)別于脊椎動物免疫系統(tǒng)的抗性防衛(wèi)體系。在這一體系中，植物的每一個細(xì)胞都有對病原物的侵染產(chǎn)生組成型抗性 (of 誘導(dǎo)型抗性 (能 力。組成型抗性又稱為被動抗病性，主要靠形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的機(jī)械障礙，主要 包括細(xì)胞壁的角質(zhì)、蠟質(zhì)、木質(zhì)素、特殊的氣孔結(jié)構(gòu)、小分子抗病物質(zhì) ( 如毒性脂肪酸、酚類化合物、類萜與類黃酮類植保素以及有關(guān)的過氧化物酶、多酚氧化酶與苯丙氨酸解氨酶等 )、種子固有的抗真菌蛋白和能與真菌幾丁質(zhì)結(jié)合的凝集素、破壞真菌細(xì)胞透性的蛋白質(zhì)和核糖體失活蛋白等 (王鈞 , 1998)。 誘導(dǎo)抗性又稱為主動抗性，是在植物和病原微生物長期相互作用中產(chǎn)生的，指寄主植物被病原物侵染后，產(chǎn)生或激活的抗病特性。 寄主對病原物侵染后作出的反應(yīng)包括局部反應(yīng)和系 統(tǒng)反應(yīng)。 前者主要是指過敏反應(yīng)( 過敏反應(yīng)是一種引起被病原物攻擊的宿主細(xì)胞迅速壞死， 使病原菌不易獲取養(yǎng)分，同時又誘導(dǎo)周圍細(xì)胞合成抑制病原菌生長的物質(zhì)，從而限制了病原菌的增殖 (1996)， 這種反應(yīng)一般是局部的，起到阻止病菌擴(kuò)展，使病害癥狀局部化的作用。 一是由 是植物病原細(xì)菌在入侵非寄主植物時誘導(dǎo)產(chǎn)生的，這樣的超敏反應(yīng)主要是由植物病 原細(xì)菌中的 因家族決定的 (竇道龍等，2002)。在 胞內(nèi)還會產(chǎn)生許多生物化學(xué)的變化，如細(xì)胞中電解質(zhì)流失 (如鉀離子氫離子交換反應(yīng) )、磷脂酶活性變化、鈣流動現(xiàn)象、蛋白質(zhì)磷酸化、脂氧合酶活性變化、活性氧的產(chǎn)生以及有關(guān)防衛(wèi)基因的活化等 (et 2000)現(xiàn)象。 在 初稱為壞死 (后來被認(rèn)為是編程性細(xì)胞死亡 (et 1996)。而系統(tǒng)反應(yīng)是建立在局部反應(yīng)基礎(chǔ)之上的，又稱系統(tǒng)獲得抗性 ( 一種較為有效的抗病反應(yīng) 。它是指植物受病原菌侵染后局部的 種信號分子能誘發(fā)整個植株防衛(wèi)基因的表達(dá)， 表現(xiàn)出的更為廣譜、系統(tǒng)、長效的防衛(wèi)機(jī)制 ，從而使植物對更多的病原菌產(chǎn)生抵抗作用，其特點是不出現(xiàn)局部抗性那樣的枯斑，卻能抗多種病原物引起的病害 (et 1996)。 另外，還有誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性反 應(yīng) (，是植物根部受到促生根瘤菌定植時整個植株所獲得的抗病反應(yīng)。 植物和病原菌的互作分為親和性互作和非親和性互作兩種。 1956） 根據(jù)對亞麻銹病(的研究提出基因?qū)驅(qū)W說，認(rèn)為 寄主植物的每一個抗性基因 ( 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué) 位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 2 , 在病原菌中就存在相應(yīng)的無毒基因 (, 與 無毒 基因相對應(yīng)的是病原菌的毒性基因 ( 含有 因 的病原菌對含 R 基因的寄主分別表現(xiàn)出非親和性與親和性。只 有當(dāng)帶有無毒基因的病原與帶有抗病基因的寄主結(jié)合 ,才表現(xiàn)出抗病反應(yīng)（即非親和性） ,其他情況均表現(xiàn)為感?。?親和性） ?？共』虻漠a(chǎn)物主要作用是識別并結(jié)合無毒基因產(chǎn)物 ,啟動信號傳導(dǎo)過程 ,最終引起防衛(wèi)基因的表達(dá) ,使植物表現(xiàn)抗病。 但是對于寄主抗病基因來說，病原物為了繼續(xù)生存，遲早會出現(xiàn)毒性基因來克服寄主的抗性，因此植物抗病基因要參與同病原菌共進(jìn)化的較量，植物抗性和病原毒性不斷地相互適應(yīng) (et 2001)。在病原菌和植物的競爭過程中，植物首先產(chǎn) 生抗病基因，然后病原菌產(chǎn)生新的小種克服植物抗病基因，植物抗病基因也會隨之進(jìn)化產(chǎn)生新的抗性功能，啟動其它的防御機(jī)制來抵御病原菌的危害，實現(xiàn)植物和病原的共進(jìn)化。 植物抗病基因克隆策略及方法 植物抗病基因克隆研究隨著分子生物學(xué)及相關(guān)技術(shù)方法的不斷發(fā)展而日趨深入， 并成為目前國內(nèi)外研究的熱點 。從遺傳學(xué)的觀點來看，基因克隆的途徑可概括為正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)兩種。正向遺傳學(xué) (也就是通常所說的“功能性”克隆 (依賴目 標(biāo)基因所表現(xiàn)的功能為基 礎(chǔ)，通過鑒定基因的產(chǎn)物或某種明顯的表型突變等信息合成寡核苷酸探針，從 制備相應(yīng)的蛋白抗體，在 反向遺傳學(xué) (徑則是直接對基因本身進(jìn)行分析，通過其特定的序列或在染色體上的位置、 編碼的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)特點來 克隆 基因 。 八十年代以來分子 生物學(xué)研究技術(shù)不斷進(jìn)步， 為植物抗病基因的克隆開辟了新的途徑，主要有轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)、圖位克隆技術(shù)，以及建立在 括 位克隆法 圖位克隆 (稱定位克隆 (由英國劍橋大學(xué)986年提出的， 是根據(jù)目標(biāo)基因在染色體上的位置進(jìn)行基因克隆的一種方法 。 用該方法分離基因無需預(yù)先知道基因的 無需預(yù)先知道其表達(dá)產(chǎn)物的有關(guān)信息。對于基因組復(fù)雜的真核生物來說，許多基因的作用機(jī)制和產(chǎn)物都是未知的，該法的提出極大地推進(jìn)了高等植物基因的分離。 利用圖位克隆法克隆一個基因一般需要以下六個過程：（ 1）構(gòu)建用于分子標(biāo)記定位的作圖群體；（ 2）目的基因的定位和精細(xì)定位，即找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。目的基因與分子標(biāo)記距離越近越好；（ 3）構(gòu)建包含目的基因的 大片段基因組文庫 (如 ；（ 4）用緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選基因組文庫；（ 5）對得到的陽性克隆進(jìn)行染色體步移，構(gòu)建目的基因區(qū)域的跨疊克隆群即物理圖譜，確定含目的基因克隆；（ 6）將篩查出的包含目的基因克隆的 得侯選基因，進(jìn)行互補實驗、功能鑒定。上述每一個步驟對克隆一個基因都很關(guān)鍵。 (1)遺傳作圖群體 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué) 位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 3 要進(jìn)行分子定位和遺傳分析，質(zhì)量可靠的定位群體非常關(guān)鍵。 常用的作圖群體主要包括以下幾種 : 由兩個親本單交產(chǎn)生；回交群體 (對于自交不親和材料或研究某種特殊問題如雌雄配子交換率的差別， 就必須利用回交；重組自交系 (是由 1代個體連 續(xù)多代自交或姐妹交直到后代基因組相對純合為止；雙單倍體(H)是由 染色體加倍處理形成雙單倍體群體。 近等 基因系 (；分離群體分組分析法 (叫集團(tuán)群分法。 研究表明，近等基因系法，分離群體分組分析法是目前獲 得與目標(biāo)基因緊密連鎖標(biāo)記的最有效方法。 近等基因系（ ，是輪回親本與供體親本通過雜交以及多代回交（一般至少回交五代），除目的基因外其它性狀基本與輪回親本一致，這樣該系與輪回親本就構(gòu)成了一對 近等基因系。由于 般凡 是能在近等基因系間揭示多態(tài)性的分子標(biāo)記就很有可能與目的 基因緊密連鎖。在植物中特別是水稻中針對不同性狀構(gòu)建了許多 近等基因系。比如針對水稻抗白葉枯病的不同抗性基因，以秈稻品種 單基因為目的的從套秈稻近等基因系和小種之間的鑒別互作表現(xiàn)清晰的專化抗性。自 1986年開始，章琦等以一個高度感白葉枯病的粳稻品種沈農(nóng) 1033為輪回親本，培育了一套適合我國生態(tài)環(huán)境的粳稻近等基因系，包括 琦等， 1993， 1996）。近年，又從野生稻中挖掘出一個廣抗譜 基因 以秈稻品種金剛 30為輪回親本培育成了近等基因系 琦等， 2000）。這些含有不同抗性基因的近等基因系正廣泛用于水稻白葉枯病抗性基因的定位和克隆。 分離群體分組分析法（ 是 主要篩選目標(biāo)基因所在局部區(qū)域的分子標(biāo)記（ et 991） 。該方法將 抗病和感?。┓譃閮山M，將每組中的單株 于分組時 僅對目標(biāo)性狀進(jìn)行選 擇，因此兩個混合池之間理論上主要在目標(biāo)基因所在局部區(qū) 域有差異，這非常類似于 也稱作近等基因池法。 (2) 分子標(biāo)記遺傳連鎖圖及目的基因的精細(xì)定位 近年，隨著 遺傳標(biāo)記圖譜的迅速發(fā)展， 已有 30 多種植物構(gòu)建了分子連鎖圖譜，并且一些植物的圖譜不斷被加密。 動植物基因組作圖中最先使用、應(yīng)用最廣泛的一種分子標(biāo)記，基于 乎所有的重要農(nóng)作物都構(gòu)建了基 于 連鎖圖譜。 水稻中第一張連鎖圖譜是 用秈粳交 包含 135個 蓋染色體