【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）胸膜肺炎放線桿菌ApxⅢA基因的克隆表達(dá)及毒力因子免疫原性的測(cè)定預(yù)防獸醫(yī)學(xué)碩士論文

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士 學(xué)位論文 胸膜肺炎放線桿菌 A 基因的克隆表達(dá)及毒 力因子 免疫原性的測(cè)定 A A I 摘 要 豬傳染性胸膜肺炎 (由胸膜肺炎放線桿菌 (起的以肺出血、壞死和纖維素性滲出為主要病變的高度接觸性傳染病。自 1957 年 次報(bào)道本病以來，該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，并給各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于 易產(chǎn)生耐藥性，疫苗接種是防控本病的主要措施。目前，國(guó)內(nèi)主要使用滅活疫苗預(yù)防和控制本病。但由于 清型較多，滅活疫苗的保護(hù)效果十分有限。因此，開發(fā)新型疫苗已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。 本研究通過基因工程方法 ，重組表達(dá) 一種毒力因子，制備了重組亞單位疫苗，并進(jìn)行了免疫保護(hù)效果的探討。研究表明， 泌的外毒素（ 外膜蛋白（ 不僅是 要的毒力因子，同時(shí)也是重要的免疫原性因子。 1 成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體 A。并將 3 種重組表達(dá)載體 A 、 二種為實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好）分別在大腸桿菌 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得 3 種重組蛋白 A（ 、 大小分別約 41、 41 和 45析表明， 3 種重組蛋白具有良好的抗原性。 2 將 合作為疫苗組， ， 、 3、 7 型菌制備的滅活疫苗作為疫苗組，作為空白對(duì)照組，進(jìn)行家兔的免疫試驗(yàn)。免疫共分 3 次，每次間隔兩周。通過間接血凝試劑盒檢測(cè)血清特異性抗體、評(píng)價(jià)重組亞單位疫苗的免疫保護(hù)效果。結(jié)果表明，疫苗組的抗體水平均顯著 高于疫苗組，但是疫苗組抗體水平不如疫苗組，其血清效價(jià)最高滴度為 1： 256。 關(guān)鍵詞 ： 胸膜肺炎放線桿菌 ， 毒力因子 ， 克隆 ， 表達(dá) ， 重組亞單位疫苗 ， 免疫試驗(yàn) is a is by in 957, it in in PP a to At an is CP PP 5 so of is a an PP in It mp as 1 A mp 2 of r r ); of 、 3 ( of of of of of :256. 錄 第一章 引言 . 1 傳染性胸膜肺炎的概況 . 1 原學(xué) . 1 行病學(xué) . 2 床癥狀和病理變化 . 3 . 3 理變化 . 4 . 4 . 4 生物學(xué)診斷 . 4 清學(xué)診斷 . 5 子生物學(xué)診斷 . 7 . 8 . 8 . 8 . 9 . 9 . 10 . 10 . 11 . 11 . 11 . 12 . 12 苗 . 12 . 13 . 15 第二章 胸膜肺炎放線桿菌 A 基因的克隆和原核表達(dá) . 17 料與方法 . 17 株與質(zhì)粒 . 17 要試劑 . 17 要儀器 . 17 菌的培養(yǎng) . 18 . 18 目的 . 20 隆重組質(zhì)粒的鑒定 . 21 達(dá)載體的構(gòu)建 . 22 組菌的誘導(dǎo)表達(dá) . 26 果與分析 . 26 . 26 . 26 . 27 . 28 論 . 29 第 三 章 毒素、外膜脂蛋白的表達(dá) 及重組蛋白的純化 . 30 料與方法 . 30 株及質(zhì)粒 . 30 要試劑 . 30 要儀器與設(shè)備 . 30 組質(zhì)粒的表達(dá)及鑒 定 . 31 組蛋白的提純與復(fù)性 . 34 果與分析 . 37 組蛋白的鑒定 . 37 論 . 39 第 四 章 動(dòng)物免疫試驗(yàn) . 40 料與方法 . 40 組表達(dá)蛋白和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 . 40 要試劑 . 40 苗的制備 . 40 物分組及免疫 . 41 體監(jiān)測(cè) . 41 果與分析 . 43 論 . 44 第 五 章 全文總結(jié) . 46 參考文獻(xiàn) . 47 致謝 . 56 作者簡(jiǎn)歷 . 57 附錄 1 . 58 V 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 A 基喋呤 原 芐青霉素 硫酸銨 血清白蛋白 -(1-(環(huán)己氨基 )磺酸 氨基聯(lián)苯胺 甲基亞砜 氧核糖核苷三磷酸 硫赤蘚糖醇 硫蘇糖醇 乙二胺四乙酸 二醇雙（ 2乙酸 聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 原型谷胱苷肽 化型谷胱苷肽 胱甘肽 H 黃嘌呤 丙基硫代 乳苷 那霉素 B 培養(yǎng)基 文縮寫 英文全稱 中文名稱 NC 酸纖維素 苯二胺 酸鹽緩沖液 酸鹽吐溫緩沖液 乙二醇 二烷基硫酸鈉 酮酸鈉 T 腺嘧啶 羥甲基氨基甲烷 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引言 傳染性胸膜肺炎的概況 豬傳染性胸膜肺炎（ 由胸膜肺炎放線桿菌 (起的高度接觸性呼吸道疾病。該病主要以肺出血、壞死和纖維素性滲出為病變特征。它可致各年齡段的豬發(fā)生急性和慢性感染， 常與巴氏桿菌等混合感染。病豬發(fā)熱 (可達(dá) 42 )，呼吸困難，食欲不振；剖檢可見纖維素性胸膜肺炎，多感染兩側(cè)， 65%的肺葉病變嚴(yán)重； 發(fā)病率和死亡率 常在 20%以上，最急性型的死亡率可高達(dá) 80% 100%； 慢性豬傳染性膜肺炎潛伏于豬群內(nèi)，可使豬只生長(zhǎng)緩慢，平均日增重下降，飼養(yǎng)報(bào)酬降低，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，急性感染耐過或陰性感染的豬只將是帶菌者，成為本病再次爆發(fā)和流行的潛在傳染源，是本病防控和根除的隱患。另外 , 感染 由于胸椎間膿腫壓迫脊髓而引起后軀麻痹。自 1957年在英國(guó)首次報(bào)道以來，歐洲、美洲和亞洲的許多國(guó)家和地區(qū)都先后報(bào)道本病流行嚴(yán)重，成為世界性工業(yè)養(yǎng)豬的主要疫病之一。 20世紀(jì) 80年代以來 , 由該菌引起的呼吸道傳染病在我 國(guó)陸續(xù)報(bào)道以來 ,廣泛流行，且呈逐年上升趨勢(shì)。 本病幾乎遍及全世界所有養(yǎng)豬國(guó)家，流行日趨嚴(yán)重，成為世界性規(guī)?；B(yǎng)豬的重要疫病之一。 原學(xué) 胸膜肺炎放線桿菌 (豬傳染性胸膜肺炎的病原菌，原名為副溶血嗜血桿菌 (胸膜肺炎嗜血桿菌（ （ et 1981）。后來因該菌在形態(tài)、生化特性及 源性方面與李氏放線桿 （ 系密切，于 1983 年被歸入放線桿菌屬，正式命名為胸膜肺炎放線桿菌 (et 1983) 。 革蘭氏陰性小球桿菌，有時(shí)呈線狀或多形性。有莢膜或不完全莢膜。不形成芽孢且無(wú)鞭毛。有菌毛，直徑約 2度約 60 450菌為兼性厭氧菌，且營(yíng)養(yǎng)要求較高。初次分離時(shí)應(yīng)供給 5% 10%最適合生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為巧克力瓊脂平板和綿羊血瓊脂平板 （張耀相等 , 2004） 。 根據(jù) 長(zhǎng)是 否需 要煙 酰胺 腺嘌 呤二 核苷 酸 （ 分為兩個(gè)生物型，即生物 賴菌株）和生物 賴型） (et 1992; et 1997)。其血清型的劃分是依據(jù)莢膜多糖 (P)和脂多糖(抗原性。根據(jù)抗原性的不同，又分為 15個(gè)血清型。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 2 其中 et 2002)。生物 12型和 15型，生物 3型和 14型 （ et 1999） 。各血清型之間的交叉保護(hù)性不強(qiáng)，其中 1、 4和 6型之間及 3、 6和 8型之間有交叉反應(yīng)，這種交叉反應(yīng)主要是由于在外膜蛋白上存在共同的抗原決定簇。其中生物型對(duì)豬具有致病性。生物型中的 1、 5、 9、 10、 11等 5種血清型致病力最強(qiáng)。生物型 (13和 14)分布于歐洲及美國(guó)，其致病性比生物型要弱。多數(shù)國(guó)家為復(fù)合型感染。 生物 血瓊脂平板上難以生長(zhǎng)或不生長(zhǎng)，而需在培養(yǎng)基上劃一條金黃色葡萄球菌線，其產(chǎn)生的較多 37培養(yǎng) 24葡萄球菌附近可形成表面光滑、圓形、稍突起、邊緣整齊、針尖大小的菌落，呈明顯的 一現(xiàn)象被稱為“衛(wèi)星現(xiàn)象”。生物 37培養(yǎng) 24樣呈 溶血素周圍產(chǎn)生一個(gè)不斷增大的溶血區(qū)，越靠近劃線的菌苔，溶血區(qū)越大，形似杯狀，這一現(xiàn)象稱為 et 995)。許多試驗(yàn)數(shù)據(jù)已證明生物 型菌。一般來說，分泌 、5、 9、 10和 11型比其他血清型毒力強(qiáng)，最常見于嚴(yán)重爆發(fā)、高死亡率和嚴(yán)重的肺臟病變。其他血清型的毒力較弱，死亡率也較低。血清 3型和 6型的毒力通常被認(rèn)為很低 (et 1990)。 括莢膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白、蛋白酶、溶血外毒素、粘附因子和菌毛等，其中溶血外毒素是引起宿主肺部病變的最主要因素 (et 1990; 王春來等 , 2001)。 外界環(huán)境的抵抗力弱， 60 15燥情況下易 死亡， 對(duì) 常 用消毒劑敏 感。但 對(duì)結(jié)晶紫 有一 定 的 抵抗力 。 該菌對(duì)氟苯尼考、頭孢拉啶、甲氧芐啶、頭孢噻呋等抗菌藥敏感，對(duì) 桿菌 肽 、林 可 霉 素、 壯觀霉 素 、 鏈霉素、青霉素、紅霉素、氟哌酸、卡那霉素和復(fù)方磺胺等藥物不敏感 (et 2005)。 行病學(xué) 感染胸膜肺炎放線桿菌的母豬群表現(xiàn)典型的血清學(xué)陽(yáng)性反應(yīng)，這些母豬通過初乳傳遞高滴度的母源抗體給它們的后代。仔豬大約在 4 周齡時(shí)將失去母源抗體的保護(hù)，到 9 周齡時(shí)母源抗體 消失，此時(shí)仔豬就處于 威脅之下。研究表明，豬胸膜肺炎的發(fā)生與 感染劑量有關(guān)，當(dāng)生長(zhǎng)豬遭受到數(shù)倍于感染劑量的 擊時(shí)，胸膜肺炎就會(huì)暴發(fā)，這就是臨床上常見的豬胸膜肺炎多發(fā)于 12麥的 J P 個(gè)曾發(fā)生過肺炎的育肥豬群，當(dāng)豬在 20，采用 術(shù)發(fā)現(xiàn)豬舍空氣中存在胸膜肺炎放線桿菌，而同一批豬上市(80，豬舍空氣中卻沒有發(fā)現(xiàn) 表明，豬在進(jìn)入育肥舍后不久，經(jīng)空氣傳播的胸膜肺炎會(huì)突然發(fā)生，其后將逐漸減少，并可能恢復(fù)正常和獲得 免疫力。 自 1957 年 首次報(bào)道豬傳染性胸膜肺炎以來，世界大部分國(guó)家相繼報(bào)道了本病的暴發(fā)和流行。 如歐洲、美國(guó)、加拿大、墨西哥、南美、韓國(guó)、日本、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 3 中國(guó)臺(tái)灣省、澳大利亞國(guó)。 清型較多，不同的國(guó)家和地區(qū)流行的血清型不同。血清 1、 5 和 7 型在北美較為多見 （ et 1990） ；血清 2 型在瑞士和瑞典發(fā)現(xiàn)的最多 （ et 1992）； 丹麥主要流行血清 2、 6 和 12 型；加拿大主要流行 1、 3 和 5 型；而大多數(shù)歐洲國(guó)家則以血清 1、 2、 5、 7、和 9 型為主 （ et 1993）。 我國(guó)在上世紀(jì) 80 年代以前主要以分散飼養(yǎng)為主，沒有豬傳染性胸膜肺炎報(bào)道。 90 年代后，隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模的逐漸擴(kuò)大，加上國(guó)家由外引種及地區(qū)之間引種工作的頻繁進(jìn)行，該病在我國(guó)流行開來。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所楊旭夫等于首次于國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)臨床病例，并通過病原分離、鑒定、血清分型、人工接種及血 清學(xué)檢查等證明了該病在我國(guó)的存在和流行 。 隨著集約化養(yǎng)豬業(yè)的突飛猛進(jìn)，該病的發(fā)生呈逐年上升趨勢(shì)。自 2000 年以來，豬傳染性胸膜肺炎在國(guó)內(nèi)多處出現(xiàn)暴發(fā)性流行。上海、浙江、廣東、湖北、湖南、河南等 地尤為嚴(yán)重，據(jù)報(bào)道，僅杭州郊區(qū)某豬場(chǎng)因該病就造成近 3 萬(wàn)頭豬只死亡。近年來，我國(guó)大多數(shù)省市報(bào)道有此病的發(fā)生，但不同地區(qū)流行的血清型有所差異。但主要以 1、 3 和 7 型為主。 床癥狀和病理變化 床癥狀 自然感染潛伏期為 1更久，人工感染可在 6病。根據(jù)豬的免疫狀態(tài)、不利環(huán)境的應(yīng)激和對(duì)病原體的暴露程度不同，臨床癥狀存在著差異，可以分為最急性、急性和慢性三種。最急性型 同舍或不同舍個(gè)別豬只突然發(fā)病，體溫升高可達(dá) 上，精神沉郁，食欲不振，有短暫的輕微腹瀉和嘔 吐，無(wú)明顯的呼吸道癥狀。疾病后期出現(xiàn)高度呼吸困難，呈犬坐姿勢(shì)，鼻孔流出泡沫樣淡血色的分泌物，脈搏增速，心衰，耳、鼻、四肢皮膚出現(xiàn)紫斑， 在 24死亡。個(gè) 別 幼 齡 豬 只 因 敗 血 癥 死 亡 ， 但 并 不 出 現(xiàn) 上 述 臨 床 癥 狀 。 病 死 率 高 達(dá) 80% et 1988)。急性型同舍或不同舍的許多豬只患病，體溫上升到 41，精神沉郁，食欲不振 ,呼吸困難，常出現(xiàn)心臟衰竭。病程根據(jù)肺部病變程度及開始治療時(shí)間的不同而異，可能發(fā)生死亡，也有可能轉(zhuǎn)為亞急性或慢性型 (et 1994)。亞急性和慢性型多由急性型轉(zhuǎn)化而來，體溫不升高或很少升高，也有的可達(dá) 40。病情較輕豬只呈連發(fā)性或間歇性咳嗽，食欲不振，日增重減慢，出現(xiàn)一定程度的異常呼吸。這種癥狀經(jīng)過數(shù)日乃至一周，或治愈或進(jìn)一步惡化。慢性感染期的豬群癥狀表現(xiàn)不明顯。在首次爆發(fā)本病的豬群中還可能出現(xiàn)流產(chǎn)病例，特別是 群。個(gè)別豬只可發(fā)生關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎以及不同部位出現(xiàn)囊腫，在慢性感染豬群中常存在隱性感染豬，一旦其他病原體（如副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌等）經(jīng)呼吸道感染，可使癥狀加重。最近有報(bào)道，感染了 豬只還可患中 耳炎。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 4 理變化 通過解剖感染豬只可以發(fā)現(xiàn)，呼吸道的損傷主要在肺部 （ 1992） 。在疾病早期，其組織學(xué)病變包括壞死，出血，嗜中性白細(xì)胞浸潤(rùn)，巨噬細(xì)胞和血小板激活，血管內(nèi)血栓形成。后期則主要以巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)為特征（ 吳家強(qiáng)等 , 2002） 。最急性型 可見患豬流血色鼻液，氣管和支氣管充滿泡沫狀血色黏液性分泌物。其早期病變頗似內(nèi)毒素休克性病變，表現(xiàn)為肺泡與間質(zhì)水腫，淋巴管擴(kuò)張，肺充血、出血和血管內(nèi)有纖維素性血栓形成。肺炎病變多發(fā)于肺的前下部，而在肺的后上部，特別是靠近肺門主支氣管周圍， 常出現(xiàn)周界清晰的出血性突變區(qū)或壞死區(qū)(et 1990)。急性型 肺炎多為兩側(cè)性，常發(fā)生于尖葉、心葉和膈葉的一部分。病灶區(qū)呈紫紅色，堅(jiān)實(shí)，輪廓清晰，間質(zhì)積流血色膠樣液體，纖維素性胸膜炎明顯。肺臟以外的病變表現(xiàn)為腎小球毛細(xì)血管、入球動(dòng)脈和小葉間動(dòng)脈有透明血栓，血管壁纖維素樣壞死，此為內(nèi)毒素血癥所致 (et 1986)。亞急性型 肺部可能發(fā)現(xiàn)大的干酪性病灶區(qū)或含有壞死碎屑的空洞。由于繼發(fā)細(xì)菌感染，致使肺炎病灶轉(zhuǎn)為膿腫，后者常與肋胸膜發(fā)生纖維性粘連。慢性型常于膈葉見到大小不等的 結(jié)節(jié)。其周圍有較厚的結(jié)締組織環(huán)繞，肺胸膜粘連。感染了慢性傳染性胸膜肺炎豬只很難進(jìn)行確診。因?yàn)榛技毙詡魅拘孕啬し窝缀笏斐傻姆尾繐p傷在幾周后會(huì)減輕，而患慢性傳染性胸膜肺炎所形成的肺部損傷很難與其他的病原所形成的損傷相區(qū)別 （ et 1994） 。這些肺部的損傷多為紅色的斑塊，纖維化程度較輕 （ et 1990） 。 斷方法 臨床診斷 本病發(fā)生突然，傳播迅速，并伴發(fā)高熱和嚴(yán)重呼吸困難，死亡率高。死后剖檢可見肺臟和胸膜有特征性的纖維素性壞死性和出血 性肺炎、纖維素性胸膜炎，通過以上臨床癥狀、病變以及流行病學(xué)可以作出初步診斷，進(jìn)一步確診則需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷和血清學(xué)診斷。 生物學(xué)診斷 片鏡檢 無(wú)菌采集新鮮肺、肝、腎臟觸片，革蘭氏染色鏡檢，鏡下可見革蘭氏陰性的球狀桿菌，無(wú)芽孢，有莢膜。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 引言 5 原分離 新鮮病料較容易從支氣管、鼻腔分泌物或肺部病變中分離得到病原。初次分離可用 10%綿羊血液瓊脂平板，與表皮葡萄球菌交叉劃線， 10%37溫箱培養(yǎng)24見劃線附近有 小菌落。其周圍完全溶血，呈典型的 是一種快速的細(xì)菌診斷方法。然后，可以挑取可疑菌落純培養(yǎng)后作細(xì)菌特性鑒定。 清學(xué)診斷 同血清型有各自的型特異性抗原（主要是莢膜多糖和脂多糖的抗原性不同），大多數(shù)血清型之間沒有交叉反應(yīng)。但在某些血清型之間，莢膜多糖和脂多糖卻非 常相似，所以交叉反應(yīng)又時(shí)有發(fā)生。交叉反應(yīng)最易發(fā)生在血清3、 6、 8， 1、 9和 11型及 4和 7型之間 （ et 2000） 。這些交叉反應(yīng)不僅阻止了分離株的分型，對(duì)于疾病暴發(fā)時(shí)流行病學(xué)調(diào)查也 是一個(gè)障礙。尤其是不同血清型 此，使得 異、快速且有效的診斷方法。 體結(jié)合試驗(yàn) ( 本方法是最早用于胸膜肺炎放線桿菌血清學(xué)診斷的實(shí)驗(yàn)之一，由于其靈敏度與準(zhǔn)確性高，又不需要特殊設(shè)備，因此至今仍是一些傳染病診斷的常用方法。 1971年， 979)。國(guó)內(nèi)朱士盛等人于 1987年對(duì)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)方法，診斷豬胸膜肺炎獲得滿意結(jié)果，混合抗原與單價(jià)抗原的敏感性欲特異性比較，一般前者比后者高一倍。因此，最佳混合抗原的應(yīng)用有利于該病的流行病學(xué)調(diào)查。 有較好的敏感性和特異性，檢出率可達(dá) 100%，能夠區(qū)分胸膜肺炎放線桿菌和豬副嗜血桿菌 (et