【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）馬鈴薯四倍體栽培種莖段組織的EMS誘變研究蔬菜學碩士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 碩士學位論文 馬鈴薯四倍體栽培種莖段組織 的 變研究 on in on in I 摘 要 誘變育種是解決育種資源不足的一種有效的育種技術。化學誘變劑 用于活或失活基因功能，經(jīng)過篩選和鑒定，能夠創(chuàng)造或改良作物的性狀。這種方法在許多作物上已有運用并育成品種。由于多倍體染色體間更為復雜的互作，多倍體作物的誘變效率尚不確定 。本研究通過誘變劑 理馬鈴薯四倍體栽培種的莖段組織，探討 馬鈴薯四倍體（ 4X）的誘變效果。 試驗中，以馬鈴薯四倍體栽培種（ 管苗帶頂芽、腋芽、側(cè)隱芽的莖段組織和愈傷化莖段組織為試驗材料，研究了 理的誘變效應，對處理后代的試管生長和大棚生長進行了跟蹤觀察及群體分析。試驗結(jié)果如下： 1. 濃度 1%的 液對中薯 2 號馬鈴薯栽培種莖段組織具有誘變效應。誘變劑 夠進入莖段組織中，使側(cè)隱芽及周圍組織呈現(xiàn)白化，數(shù)天后從白化組織中再生出綠色小芽。使側(cè)腋芽呈現(xiàn)部分白化，腋芽經(jīng) 歷一個生長減慢或停滯的時期，在 20 50d 內(nèi)逐步恢復生長速度。不同品種對誘變劑的耐受能力不同，誘變后對處理的反應也不同。經(jīng) 1% 察到的如下變異：植株矮化、花器官變異、葉形變異、莖色變異及薯色變異。 2. 對無性系帶側(cè)隱芽和側(cè)腋芽莖段的誘變后代群體的生長發(fā)育狀況和形態(tài)色澤的觀察以及塊莖主要成分的測試統(tǒng)計分析表明：經(jīng)誘變的 4 個群體與同等條件下培養(yǎng)的對照在生長發(fā)育狀況指標 株高、莖粗、結(jié)薯數(shù)和花蕾上存在不同程度的差異；植株的莖、葉形態(tài)和色澤也有一定比例的變異。其中葉形變異在棚栽二代表現(xiàn)出可遺傳的 特性，表明 時，雖然誘變后代塊莖干物重和淀粉含量并未出現(xiàn)超常的變異范圍，但干物質(zhì)中還原糖含量表現(xiàn)出了 3 倍于正常群體的變異系數(shù)和較大的變幅，說明 馬鈴薯四倍體誘變還原糖含量方面具有較大的育種潛力。 a) 帶側(cè)隱芽和側(cè)腋芽莖段的誘變后代兩次棚栽試驗中都觀察到了莖色變異性狀，可以作為輔助性狀進行觀察篩選；莖形、葉色、花蕾性狀的變化可能是性狀對應結(jié)構基因的改變。由于這些性狀表現(xiàn)同時發(fā)生相關的變化，也可能反應植株的成熟期控制基因的變化，可以用作品種成熟期變異的指示性狀。 b) 生長 中遇 溫天氣條件時，對照群體中 植株發(fā)生紅斑并不能正常生長， 株全株壞死，葉形變異群體中 28%發(fā)生少量紅斑，無因寒冷而死亡的個體，表現(xiàn)出了良好的抗寒性。該結(jié)果表明 時植株的形態(tài)變異可能與其他變異相關聯(lián)，有望成為潛在的指示性狀。 綜上所述，本研究證實了 用于 馬鈴薯四倍體 栽培種離體莖段組織，能夠產(chǎn)生明顯的誘變效果，具有一定的育種潛力。同時，本研究表明， 變是一種馬鈴薯育種手段的有效補充。 關鍵詞 馬鈴薯 組 織培養(yǎng) 變 突變體篩選 is an to in of is is of NA of of of MS in is to be to n in is In we MS to y . , MS in in of % h. as in a B5 to in MS of t in of of nt 1. We in MS a to in 0 of in 0% of 0 of 2. In of s of of of of in of so in nd in of a 3 a) In nd in in a 34C of of of g in 8% of of b) We MS is to in a in in a to a to in be as a 錄 第一章 文獻綜述 1 物誘變研究進展 1 1 化學誘變劑的誘變譜 3 體細胞無性系變異 3 突 變體的篩選 4 嵌合體及其純化 5 物誘變在馬鈴薯育種上的應用 6 項研究的意義和目的 7 第二章 研究材料與方法 8 究材料 8 研究方法 9 第三章 研究結(jié)果與討論 13 段胚性愈傷組織誘導 13 同品種對莖段胚 性愈傷組織 的反應 13 株的不同部位愈傷誘導效果的差異 13 段的不同部位對胚性愈傷組織形成的影響 13 代次數(shù)對愈傷組織誘導和再生植株的影響 14 16 處理效果 16 理不同組織的誘變效應 16 理不同品種的誘變效應 16 理對植株植物學形態(tài)的影響 17 理后代的田間表現(xiàn) 21 株矮化 21 官顏色變異 22 器官形態(tài)變異 23 異植株的耐低溫表現(xiàn) 23 變第 6 代（ 栽試驗結(jié)果與分析 26 生長量變異狀況分析 26 莖主要成分變異狀況分析 26 植株外觀及生育性狀變異狀況分析 28 遺傳因素和栽培因子對植株生長、結(jié)薯狀況的影響 29 尖染色 31 第四章 結(jié)論與討論 32 參考文獻 35 致謝 40 作者簡歷 41 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒 論 變研究進展 1 誘變作用機理 損傷及生物修復系統(tǒng)的功能 自然條件下， 傷和發(fā)生復制差錯的頻率都是很高的。 1989)對鼠肝臟因氧化作用引起的 傷作了統(tǒng)計，核基因組每 130， 000 1 個損傷，線粒體 每 8000一個堿基損傷。 制的錯誤包括轉(zhuǎn)座、倒位、移碼和丟失。 988)報道 “ 制錯誤頻率大約是 10每一個復制的基因中會出現(xiàn)一個錯誤”。而個體突變的頻率僅為 1010因是這些錯誤“大部分被各種 復系統(tǒng)在復制中或復制后修復”。因而，修復系統(tǒng)的高效率是物種維持遺傳穩(wěn)定的決定因素。 991)曾對高等植物除紫外修復以外的 復提 出了疑問，原因是當時關于修復系統(tǒng)的研究都集中在關于微生物、酵母和擬南芥上，大多數(shù) 復系統(tǒng)的研究都基于低等生物和少數(shù)模式植物。由近年來的研究看來，修復系統(tǒng)的作用是明顯的，只不過它的功能并不是精確無誤的。 et 1988）年提出，實驗表明細菌可以選擇性發(fā)生有利于存活的突變。 為在選擇壓力下為獲得適應性作的基因水平的突變似乎是被允許的，有選擇性壓力比中性環(huán)境更多獲得基因的突變。突變形成只出現(xiàn)在包含允許錯誤修復的 合酶 編碼基因 的克隆里，篩選條件既可以刺 激 變體的反轉(zhuǎn)突變 也可以促使野生型基因發(fā)生適應性突變。 E.， C（ 1994）用 變大腸桿菌報道了 賴型的突變。在 白過量表達的細胞中富含 )和另一基因 )突變率增高。他們的研究也表明導產(chǎn)生的突變位點在細胞饑餓時被 化的重組修復方式修復。正常情況下 化的重組修復方式是避免復制錯誤發(fā)生的途徑，但在代謝活躍的細胞里，由于有 譯合成的 合酶 3 全酶復合體的出現(xiàn)，也會以易產(chǎn)生差錯的修復途經(jīng)進行修復。以上研究不同程度地表明生物體為在逆境中求生是可以產(chǎn)生適應性突變的。 2002）等人對阻遏蛋白 碼基因進行誘變，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌中 效突變體是致死突變，也就是說 效突變體不是突變效應的增效基因。這一結(jié)果和大腸桿菌中一樣。進一步研究表明： 特殊修復方中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 2 式的作用因子。能造成 傷或復制受抑制的逆境會引發(fā)一系列稱為應急反應（ 復雜的 誘導修復效應。在不利環(huán)境中當突變有利于生物的生存的情況下，細胞為避免死亡而啟動這項特殊的求生功能，包括 傷修復、誘變效應、細胞分裂的抑制以及溶原性細菌釋放噬菌體等。 統(tǒng)有 復和導致變異兩條支路，具有雙重功效。該反應由 白和 遏蛋白相互作用引起。 白是 應系統(tǒng)的發(fā)動因子，單鏈 在時， 白被激活促進 遏蛋白水解，使 應的一系列基因得到表達，其中包括紫外線損傷的修復基因 別編碼切除酶的亞基 )以及 因本身，與誘變作用有關的基因 細胞分裂有關的基因 等。 從突變的后果看，并非所有的堿基改變都能影響基因的功能和表型。突變可能的后果有三個，即基因功能的丟失、新功能的獲得和對基因表達完全沒有影響，分別由編碼區(qū)的突變和非編碼區(qū)的突變引發(fā)?；蚓幋a區(qū)的突變可能會引起單個堿基的替換、缺失等造成合成的蛋白質(zhì)類型改變，因而造成基因功能的丟失或新功能的獲得；或者因移碼引起閱讀框改變合成了另一種蛋白質(zhì)或提前終止轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯而不合成有功能蛋白，也能造成基因功能改變或尚失 。而非編碼區(qū)的突變是否影響基因功能就有很強的選擇性，以 讀框上游 35 非保守區(qū)發(fā)生堿基突變并不影響下游基因的啟動轉(zhuǎn)錄，但 50 和 40區(qū)， 的突變就影響很大，可以引起基因功能的變化甚至表型變化。起始位點上，甚至單獨一個堿基的突變都造成基因表達失活，產(chǎn)生表型變異。 誘變劑 用的機理 文名為甲基磺酸乙酯。無色液體，分子量 124，分子式 中溶解度為 8%， 件下在水中半衰期 20時是 93h， 30時 26h。 烷化劑的一種。烷化劑通常帶有 1 個或多個活性烷基 ,此基團能夠轉(zhuǎn)移到其它電子密度高的分子上去 ,使堿基許多位置上增加了烷基 ,從而在多方面改變氫鍵的能力。證明是最為有效而且負面影響小的誘變劑。與其他烷化誘變劑類似是通過與核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反應來誘發(fā)突變。 發(fā)的突變主要通過兩個步驟來完成 , 首先鳥嘌呤的 置被烷基化 , 成為一個帶正電荷的季銨基團 ,從而發(fā)生兩種遺傳效應 :一是烷化的鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對 ,代替胞嘧啶 ,發(fā)生轉(zhuǎn)換型的突變 ;二是由于鳥嘌呤的 糖苷鍵斷裂造成脫嘌而后在 烷基化鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對 ,導致堿基替換 , 即 G C 變?yōu)?A T。誘變劑也可與核苷結(jié)構的磷酸反應 , 形成酯類而將核苷酸從磷酸與糖分子之間切斷 , 產(chǎn)生染色體的缺失。這些 構上的變化都可能促使不表達的基因或區(qū)段被激活，而表現(xiàn)出被掩蓋的性狀。 學誘變產(chǎn)生點突變的頻率較高 ,而染色體畸變相對較少 ,可以對作物的某一種特殊性狀進行改良。與其它誘變劑相比 ,變后產(chǎn)生的突變頻率高 ,且多為顯性突變體 ,易于突變體的篩選。是目前運用最中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 3 廣泛也是公認最為有效的 化學誘變劑的誘變譜 人們觀察到的突變現(xiàn)象中，雄性不育的突變成為觀察到較多的性狀，原因是兩種不同類型的不育都在誘變譜的范圍里。細胞質(zhì)不育是報道最早的突變類型之一。而在 2003 年 et 四倍體棉花誘發(fā)突變后代中分離出，分離比接近 1： 1 的核基因不育型個體，證實核不育也在誘變譜中。 生產(chǎn)中需要的矮化類型，也在誘變譜內(nèi)，而且已證明是單基因控制的性狀；此外，觀賞植物需要的突變類型集中在花型和葉型上也是誘變最敏感，易觀察到的性狀。葉片的蠟質(zhì)、有毛或無毛性狀有非常多的報道。根 據(jù)筆者的試驗，有關葉綠素的突變?nèi)琰S化和白化也是高頻發(fā)生的誘變性狀。其他報道較多的突變性狀還有抗病性及一些產(chǎn)量、品質(zhì)相關的性狀如穗粒數(shù)、糖含量等。 不同的誘變劑有不同的誘變譜。谷愛秋等（ 1994）采用三種烷化試劑 酸二乙脂），和 烯亞胺）對黑龍江地區(qū)的大豆推廣品種進行誘變，得到形態(tài)變異頻率大致相同，而早熟突變頻率差異很大，豐產(chǎn)性狀突變率以 最佳，并從中選育出高抗、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的大豆新品種，以 變處理后也獲得了優(yōu)異的新品種。 體細胞無性系變異 體細胞無性系變異的特點 體細胞無性系變異已被認為是改良植物性狀的一種潛在的技術手段，并已運用于馬鈴薯品種的改良中（ 992）。在組織培養(yǎng)中人們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過組培過程的再生植株存在可以觀察到表現(xiàn)型發(fā)生變異的個體，這種現(xiàn)象稱為體細胞無性系變異。進一步的研究證明：這些變化有的是與細胞核質(zhì)內(nèi)的基因突變、基因重排、基因擴增和轉(zhuǎn)座基因有關的（ 是可遺傳的變異。誘發(fā)的因素往往是培養(yǎng)基中的激素類物質(zhì)（ J， 1981； F 和 K， 1986）及高濃度的鹽類物質(zhì)（ 1986）。普遍的研究和生產(chǎn)實踐證實，大量的 染色體變異發(fā)生在愈傷組織誘導初期，利用含有葉、莖和芽基的幼嫩組織，則可保持正常的 體細胞無性系用于誘變的優(yōu)勢 發(fā)生在愈傷組織誘導初期的 染色體變異，對獲得愈傷組織再生植株突變體有利。愈傷組織的誘導相對容易，利用這條途徑獲得體細胞無性系變異體具有簡便、有效的優(yōu)勢。 體細胞無性系的特點是繁殖快速，而含芽的莖葉外植體往往具有正常的 以保持品種穩(wěn)定的遺傳特性，因此在馬鈴薯脫毒苗工廠化生產(chǎn)中具有廣泛而成功的運用?；瘜W 誘變試劑作用于含芽的試管苗莖葉外植體，誘變后能快速地擴大篩選群體，快速稀釋誘變劑在植株體內(nèi)的殘留量以達到盡快讓遺傳物質(zhì)穩(wěn)中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 4 定的目的，一旦發(fā)現(xiàn)突變體也能快速擴繁、快速檢驗，繼代中可以保留所有的細胞，也有利于將突變的非生長點細胞擴繁并最終純化篩選出來。將化學試劑誘變建立在莖葉外植體的組織培養(yǎng)平臺上，具有操作便捷、變異誘因單一便于分析、篩選效率高等優(yōu)點，是一條新的值得嘗試的育種途徑。 突 變體的篩選 誘變是否成功很大程度取決于育種者的目標是什么。篩選不同的性狀的難易不同，而不同的性狀有各自不同的遺傳力 。遺傳力高的性狀穩(wěn)定性好，不容易受到環(huán)境因素的影響，反之亦然。因此，選擇遺傳力高的性狀比遺傳力低的性狀容易成功。單基因控制的性狀更易篩選、觀察，如花色、葉形態(tài)、葉表面蠟質(zhì)、絨毛、矮化、核雄性不育以及一些抗病、抗生素抗性性狀等等都是遺傳力很高的表現(xiàn)型。這些性狀比多基因性狀容易被發(fā)現(xiàn)、確定和選擇。 而產(chǎn)量性狀的考察對象包括種子、葉子、花朵、果實、嫩莖、塊莖、塊根等等，涉及到株形、產(chǎn)量、蛋白、淀粉、糖、纖維含量、可溶性固形物含量、次生代謝產(chǎn)物及抗病性等。相應成分的檢測，經(jīng)典的方法是在油菜油酸上采用的“半子葉法”， 即取種子中一半的子葉用于氣相色譜分析微量成分，種子其余部分仍正常生長篩選其他性狀。 篩選方法分為常規(guī)方法和特殊方法。常規(guī)方法指對作物突變后代進行外觀性狀、豐產(chǎn)性狀、品質(zhì)性狀、育性和抗逆、抗病性狀的觀察、檢測及評價，從中篩選出具有源材料不具備的性狀或某一數(shù)量性狀表達量顯著高于源材料的突變體。 非常規(guī)方法往往是在植物誘變的不穩(wěn)定期施加額外的選擇壓，如在微生物誘變時 ,在培養(yǎng)基中添加不利生長的成分以協(xié)迫細胞發(fā)生有利存活的變異。 1 篩選方案的選擇 對于嚴格自交的作物 1979）提供 了四個確定 群體大小的可選擇的方案：）每個 植株只收獲一粒種子； 2）每個 植株獲取一個可繁殖器官如果實、豆莢、穗等；）每個 植株收取多個可繁殖器官果實、豆莢、穗 ；）把從 植株不同部位收取的種子混在一起 。 對于一些遺傳力低的復雜性狀， 1975）對燕麥使用間接篩選的方法，通過計算顆粒與生長量比值作為豐產(chǎn)指數(shù)，進行篩選。這個方法化繁為簡，能高效地篩選表現(xiàn)好的個體。缺點是可能會漏選個別低生長量但高產(chǎn)的突變體。 2 起始篩選世代的確定 受到誘變處理的材料 習慣上看作是 此產(chǎn)生種子萌發(fā)的植株是 性繁殖材料，相應稱為 考慮到誘變后細胞和染色體極不穩(wěn)定的結(jié)構和修復損傷的需要，同時誘變劑的后效作用也需要通過世代傳遞來消除，通常突變體的篩選從 開始。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 5 選擇產(chǎn)量性狀之類多基因控制的性狀，有人認為篩選工作必須在突變表型穩(wěn)定的 以后才能開始進行。應用數(shù)量遺傳學計算可知，由于種子誘變中出現(xiàn)的突變基因中最初的幾代中會因減數(shù)分裂而經(jīng)歷較高的丟失率，其概率函數(shù)為（ Z） Z 1。在第一代突變基因絕跡率為，令 （ 0） 0 1 二代及其后世代為 （ 0）（ 就是說種子誘變的突變基因必須在 7 代以后才能相對穩(wěn)定，因此嚴格的育種者對田間突變體的選擇往往從第 7 代開始。 對于抗病性，冷的忍受性，固氮特性可以在 苗期進行篩選。 種子本身是個基因型復合體。種皮來自母細胞，胚和胚乳是新的基因型。如果突變發(fā)生在種皮上，必須在 能進行篩選 ，如果突變發(fā)生在胚乳上，就會隨著胚的萌發(fā)和胚乳的程序性死亡而變成無效突變。 3 篩選規(guī)模的確定 理論上，規(guī) 模越大越有利突變體的篩出，但育種者對材料的處理能力是有限的，因此篩選的規(guī)模常常視育種者的處理能力而定。種子突變體篩選時常以十萬為數(shù)量的最小值。 而花粉誘變時處理群體較小。 1978）和 1991）等認為：花粉處理平均每個位點單個基因的隱性和顯性突變率可達 1010者以上。因此一套 30005000 的 體應該包括所有隱性突變，可以篩選到所需要的質(zhì)量性狀突變體。 嵌合體及其純化 嵌合體在多細胞組織自發(fā)或誘導突變中都很常見，是由于突變細胞在組織 中處于次要位置造成的，但仍然很有用的。許多無性繁殖的植物如菊、康乃馨等的嵌合體足夠穩(wěn)定，可以直接用于生產(chǎn)。而大多數(shù)的嵌合體不夠穩(wěn)定，受周圍正常細胞和 復系統(tǒng)的影響和作用，常發(fā)生反向突變（“ 而恢復正常的表達狀態(tài)。要使嵌合體純化，以得到穩(wěn)定可用的突變，對于可以進行種子繁殖的植物，長期的田間觀察和選擇是必要的，也是可行的。對于可以快速大量繁殖的試管繁殖材料，使每一個芽都大量繁殖并觀察其后代有利于發(fā)現(xiàn)和純化嵌合體。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 6 1 2 植物誘變在馬鈴薯育種上的應用 馬鈴薯（ 2n=4X=48），茄科茄屬中能形成塊莖的栽培種植物。是世界第四大糧食作物 ,是我國產(chǎn)業(yè)調(diào)整的重要發(fā)展對象。 馬鈴薯原產(chǎn)南美洲安第斯山 (隨著哥倫布探險美洲大陸而傳播到世界各國。由于資源引入來源狹窄，加之 19 世紀中期爆發(fā)的大面積顛覆性歐洲馬鈴薯晚疫病 (影響，造成了現(xiàn)有品種及其育種材料基因狹窄 (1974)的特點。常規(guī)雜交育種是目前使用最多的形成品種最多的育種方法，我國最近 50 多年來通過引進資源和雜交育種方法育成 100 多個 品種，其中的 30 個品種占全國每年種植面積的 90%。 1974 年作的共祖率分析表明，美國現(xiàn)有馬鈴薯栽培種間普遍存在親緣關系。由于我國馬鈴薯系近代由歐美引進，存在更為嚴重的類似問題，因此狹窄的基因背景，已使得雜交育種的優(yōu)勢難以體現(xiàn)。 人工誘變用于植物由來已久，目前仍以代謝生理、發(fā)育生理、抗性、疫苗等研究性的工作為主。直接用于誘變育種方面較少，但也有成功運用，如在棉花、小麥、油菜、和一些花卉上都形成了品種。限制人工誘變方法直接用于育種的因子主要是基因型純化、固定上的困難、后代篩選周期過 長（穩(wěn)定的種子繁殖突變體需經(jīng) 7 代選擇）和分子檢測中不能確定突變方向以及品種專利等問題。而無性繁殖植物無需經(jīng)歷減數(shù)分裂繁殖后代，具有突變相對易穩(wěn)定易保存的特點，篩選和觀察可以從無性二代開始，因而用于誘變具有特有的優(yōu)越性。以無性繁殖方式栽培的荷蘭鮮花，其栽培品種中約有 70%是突變體后代繁殖。此外，無性繁殖植物分子鑒定時，由于建立的是純的近等基因系，分子作圖沒有假陽性標記，得到的標記能真實反應突變的單基因或控制同一性狀的多基因的多態(tài)性。這一點也有利于突變篩選或進一步的機理研究。因此在以無性繁殖為主要繁殖方式的馬鈴 薯育種中使用人工誘變方式可能取得高于種子繁殖作物的育種效率。 體細胞的自然突變選種國內(nèi)外都有較為典型的例子。自然突變中利用得最多的是芽變。芽變是一種對已育成品種的不良性狀自發(fā)進行修飾產(chǎn)生穩(wěn)定的可遺傳的突變。芽突變具有較好的穩(wěn)定性。如美國的馬鈴薯品種“麻皮布爾斑克”就是自然芽突變選出的品種，在美國已育成 100 多年，至今仍在生產(chǎn)上廣泛使用。我國的“壩豐收”等馬鈴薯品種也來源于自然芽突變并運用多年。但自然芽變率是非常低的，在高等植物中僅為 100且得到的突變體性狀不可預測，這就大大制約了天然芽變的有 效利用。利用組織培養(yǎng)方式，可以在較小的空間內(nèi)得到較大的群體，并能在一個生長季多次對易感組織或細胞進行誘變，從而大大增加誘變的次數(shù)和獲得變異的概率；組織培養(yǎng)誘變比純理化誘變的突變率大約高一倍，因此可以大大增加誘變的效率。對無性繁殖作物而言，一旦獲得突變材料，可以立即快繁擴大群體或加以保存，最大限度地穩(wěn)定住好的突變材料。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 7 項研究的意義和目的 作者所在的貴州省馬鈴薯種植面積自 1999 年以來以較快的速度逐年增加，目前已近 800 萬畝，國內(nèi)排名第二。但育種工作起步較晚，缺乏相應的資源和研究背景，自主育成的 品種極少。 據(jù) 供數(shù)據(jù)表明：現(xiàn)存馬鈴薯資源中，茄屬有 235 個結(jié)塊莖的種，但只有為數(shù)不多的幾個可與馬鈴薯栽培種（ 親緣關系、互交可育。現(xiàn)有栽培種多為四倍體，野生種多為二倍體，野生資源中的抗逆性等優(yōu)異性狀因倍性原因不能直接利用，需要分解育種方法，如 2N 配子途徑才能引入新的基因型對現(xiàn)有栽培種進行改良。盡管 2N 配子為野生種的利用開辟了新的途徑，但貴州省缺乏相應的研究基礎，短期較難上馬；轉(zhuǎn)基因育種方式在貴州省還處在起步階段，不能較快直接運用。而從國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀來看，由于高等植物的基因載 體裝載能力限制著許多基因的轉(zhuǎn)移效率，高等植物轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定性和基因沉默等問題一直困擾著轉(zhuǎn)基因研究的迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因目前未必是解決問題的理想途徑。 基于貴州省馬鈴薯育種的現(xiàn)狀，接合貴州省農(nóng)業(yè)科研的現(xiàn)有條件，針對生產(chǎn)中存在品種問題，我們選擇在無性繁殖的四倍體馬鈴薯上進行體細胞誘變，通過研究作用于 構的誘變劑 四倍體馬鈴薯莖段等組織的有效性，證實 索對誘變后繼代 4 次并經(jīng) 2 次棚栽的個體或群體進行株系選擇的可行性，確定可用于篩選突變的性狀，提高人工誘變的效率、建 立相對完整的誘變體系，為貴州省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供優(yōu)良品種進行育種途徑的探索。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第二章 研究材料與方法 8 第二章 研究材料與方法 愈傷組織誘導試驗： 選用貴州省農(nóng)業(yè)科學院生物技術所建立的“米拉”、“克新 4 號”和“夏坡蒂” 3 個馬鈴薯品種的脫毒試管苗，及中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供的 “中薯 2 號”馬鈴薯脫毒試管苗。取無腋芽的試管苗莖段，于 5+2,+食用白糖 2 +瓊脂 養(yǎng)基上誘導，待莖段略微膨脹，兩端愈傷化時用于誘變處理。 變試驗： 選用中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供的“中薯 2 號”和“夏坡蒂”馬鈴薯脫毒試管苗。將試管苗切成約 1、帶有 1 2 個腋芽的莖段，在150角瓶內(nèi)培養(yǎng)擴繁，繼代 3 次，待試管苗擴繁至約 400 株，苗長至 6 8 片葉時切取莖段用于誘變處理及對照設置。試管苗擴繁條件：培養(yǎng)基為 2食用白糖 脂， 養(yǎng)溫度 25，光照 13h/d，光強 2000代時間約 46 周。 再生苗移栽、大棚觀察選用“中薯 2 號”誘變后代無性系。大棚栽培條件：廂面寬 質(zhì)壤土，實行霧化噴灌補充水 、適量肥及少量藥。 試驗時間地點 試驗于 2004 年 7 月至 2006 年 2 月分別在中國農(nóng)業(yè)科學院花卉蔬菜研究所和貴州省生物技術研究所完成。試驗材料準備和 變工作在中國農(nóng)業(yè)科學院花卉蔬菜研究所茄科實驗室進行；誘變后代的試管觀察及棚栽觀察試實驗在貴州省生物技術研究所進行。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第二章 研究材料與方法 9 無性系建立 取 健 康 試 管 薯 的 飽 滿 芽 ， 經(jīng) 消 毒 處 理 后 在 解 剖 鏡 下 剝 去 外 層 葉 片 ， 切 完整芽原基，置于 L L 3蔗糖 脂培 養(yǎng)基上，約 50d 后形成新的植株，繼代 35 次，取莖段形成愈傷組織的試驗，盡量使用單株后代以消除基因型和營養(yǎng)狀況不同對愈傷形成的影響。 莖段愈傷組織誘導 取莖頂部到基部不帶芽莖段，切成 1，區(qū)分為莖上部、莖中部和莖下部三個部位，分別接種到含 L 2， 4L 3蔗糖 脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，觀察生長狀況。每個品種每次用于試驗的莖切段數(shù)量多于 100段，重復 7 次，在莖切段培養(yǎng) 35d 時進行生長狀況統(tǒng)計。 繼代次數(shù)對愈傷誘導及再生植株變異率的影響 切取愈傷再生植株單芽莖段扦插至不含激素的 養(yǎng)基，正常轉(zhuǎn)接兩次后，以莖段同源的單芽莖扦插植株作對照，對分別由新建材料和多次繼代材料誘導的愈傷再生植株進行生長速度、葉片形狀、分枝狀況、生根情況的統(tǒng)計，比對差異計算再生植株的試管苗變異率。 用 1%（ v： v）的 液處理愈傷化莖段、帶頂芽莖段、帶側(cè)隱芽莖段和側(cè)腋芽（芽已萌發(fā)）莖段各 100 個。以未處理莖段（ 助溶劑水溶液（ 對照。 愈 傷 化 莖 段 處 理 ： 處 理 液 滴 加 在 已 略 微 膨 脹 的 脫 分 化 的 莖 段 上 ， 轉(zhuǎn) 入,T 1用白糖 2 +瓊脂 養(yǎng)基上誘導植株再生，觀察再生植株變化。 帶芽莖段處理： 將帶頂芽、側(cè)隱芽和側(cè)腋芽莖段浸泡于處理液 4 h，用無菌水清洗 3 4 次 ,轉(zhuǎn)入 2食用白糖 脂培養(yǎng)基上生長觀察。 再生苗擴繁移栽 理后的再生試管苗，在 2食用白糖 脂培養(yǎng)基上擴繁 4代，經(jīng)煉苗后移栽于 40 目防蟲網(wǎng)棚內(nèi)，繼續(xù)觀察 2 代。 棚栽試驗： 大棚內(nèi)苗床，將基質(zhì)整平、澆透水，將長度約 5 帶根試管苗，洗凈培養(yǎng)基，移栽至苗床上，株行距為 5 10 取小薯后，將小薯按大中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第二章 研究材料與方法 10 小分級后再次播種在大棚苗床上，株行距為 10 12 棚內(nèi)廂面寬 、肥、農(nóng)藥等按常規(guī)方法管理。 對經(jīng)誘變處理的材料進行四代試管擴繁、觀察和兩代大棚栽培觀察。 誘變后觀察 試管苗觀察：各處理分別于處理后 5、 20、 50 d，觀察記載試管苗生長速度、株型、莖、葉等發(fā)育的變化特征。 網(wǎng)室栽培苗及薯塊觀察：進行株高、莖粗、莖形、莖色、葉形、葉色、薯色、塊莖中淀粉含量、還原糖含量及塊莖干物重的觀察和測定。 薯塊主要成分測定 將鮮薯切薄片稱重、置于 45溫箱內(nèi)烘干。轉(zhuǎn)至玻璃干燥器中靜置 12，再次稱重，差減得到干物質(zhì)重量，用于計算干物質(zhì)含量。之后將干燥的薯片放入 粉末溶解于酒精后，分別用酒精浸提 砷鉬酸比色法和酸水解酮還原碘量法滴定測定塊莖干物質(zhì)中的還原糖和淀粉含量。 誘變第 6 代（ 栽試驗設計 為明確 變第 6 代（ 系的生長發(fā)育及塊莖主要成分變異情況，試驗采用隨機區(qū)組設計，針對不同變量分別用變異系數(shù)、百分數(shù)、平均值 和方差分析等方法對數(shù)據(jù)進行分析。 對株高、莖粗、結(jié)薯數(shù)、塊莖干物重、塊莖淀粉含量、還原糖含量等不連續(xù)變量，進行平均值、變異系數(shù)和變異范圍的計算；對莖形、莖色、分枝數(shù)、葉色、花蕾等不連續(xù)變量分別作分級處理，進行百分數(shù)計算比較其變異程度；采用方差分析的方法對遺傳因素和栽培中主要影響因子的生長性狀變異程度作估測。 數(shù)據(jù)調(diào)查時期 株棚內(nèi)生長 60查株高、莖粗、莖形、莖色、分枝數(shù)、葉色、花蕾有無及結(jié)薯數(shù)； 65降溫引起的紅色壞死斑點進行分級統(tǒng)計；塊莖收獲后 30d 用于主要成 分測定。 生長量和塊莖主要成分變異觀察 試驗設兩組對照，一組與誘變的無性系源自同一株試管苗，在同樣的培養(yǎng)環(huán)境下，經(jīng)相同繼代次數(shù)繁殖而來，用于消除環(huán)境和培養(yǎng)條件的影響；另一組來源相同的對照，由另一實驗室在相同培養(yǎng)環(huán)境下繁殖而來，用于增加對照的變異系數(shù)和范圍，消除由于人為操作造成的影響。隨機抽取 200 個植株，記錄其株高、莖粗、結(jié)薯數(shù)，測定塊莖的主要成分干物重、淀粉和還原糖在干物質(zhì)中的含量，用于計算平均值、變異系數(shù)和變異范圍。 在全部誘變后代中，完全隨機抽取 604 個植株，記錄其株高、莖粗、結(jié) 薯數(shù)，中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第二章 研究材料與方法 11 測定塊莖的主要成分干物重、淀粉和還原糖在干物質(zhì)中的含量，用于計算平均值、變異系數(shù)和變異范圍。 植株外觀及生物學性狀變異狀況觀察 設三組對照 別對應貴州省田間種植的中薯 栽后代；與誘變的無性系源自同一株試管苗，在同樣的培養(yǎng)環(huán)境下，經(jīng)相同繼代次數(shù)繁殖的棚栽后代；另一實驗室