雙水相萃取脂肪酶

雙水相萃取脂肪酶雙水相萃取脂肪酶 摘要 摘要 本實(shí)驗(yàn)主要研究用雙水相萃取法分離和提純脂肪酶的技術(shù) 探究了雙水 相的形成條件及不同濃度的雙水相體系對脂肪酶的提純效果 同時(shí)也介紹了一 些蛋白質(zhì)含量及酶活檢測的基本方法 前言前言 脂肪酶 Lipase EC 3 1 1 3 是一種能催化長鏈脂肪酸甘油酯水解的酶 在生物體內(nèi)是一種重要的代謝酶 在食品加工 新型生物材料 生物傳感器 生物醫(yī)學(xué)以及環(huán)境 能源等領(lǐng)域也有非常廣泛應(yīng)用 1 2 工業(yè)上常用的脂肪酶大多是由微生物發(fā)酵得到 但是發(fā)酵得到的只是含 有雜質(zhì)較多的粗酶液 要得到能夠滿足工業(yè)生產(chǎn)要求的脂肪酶還需要經(jīng)過進(jìn)一 步的分離和純化 現(xiàn)在用于脂肪酶分離純化的方法大多是常見的蛋白質(zhì)分離方 法 比如各種層析 電泳以及離心等方法 但是在酶的分離過程中還需要考慮 到保持酶活 提高回收效率以及降低成本等因素 一般的分離方法對酶的分離 提純的效果并不很理想 所以尋找一種高效實(shí)用的提純方法對脂肪酶在工業(yè)生 產(chǎn)中的應(yīng)用是非常重要的 雙水相萃取技術(shù)是近年來基于液 液萃取理論并考慮保持生物活性所開 發(fā)的一種新型分離方法 是利用生物大分子物質(zhì)在由高聚物 高聚物 水或者高聚 物 無機(jī)鹽 水形成的體系中的分配系數(shù)不同而實(shí)現(xiàn)對生物大分子的分離的 1956 年 瑞典 Lund 大學(xué)的 Albertsson 首次利用雙水相萃取技術(shù)來分離生物物質(zhì) 研 究了蛋白質(zhì) 核酸 病毒 細(xì)胞及細(xì)胞顆粒在雙水相體系中的分配行為 這是 雙水相萃取方法在生物大分子分離提純中的最早應(yīng)用 3 國內(nèi)對于雙水相萃取 方法的研究也早在 20 世紀(jì) 60 年代就已經(jīng)開始了 與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離提純方法相比 雙水相萃取方法具有很多優(yōu)點(diǎn) 體 系含水量高 可達(dá) 80 以上 蛋白質(zhì)在其中不易變性 界面張力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于水 有機(jī)溶劑兩相體系的界面張力 一般為 0 5 10 4mN m 1 有助于強(qiáng)化相際間的 質(zhì)量傳遞 系統(tǒng)中的傳質(zhì)和平均速度快 能耗小 分相時(shí)間短 一般只要 5 15min 易于放大和進(jìn)行連續(xù)性操作 萃取環(huán)境溫和 生物相容性高 聚合 物對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定和保護(hù)作用等 4 5 雙水相萃取的方法在蛋白質(zhì) 酶 核酸 氨基酸 多肽 細(xì)胞器等產(chǎn)品的分離和純化等領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用 所以這種分離方法在蛋白質(zhì)以及酶的分離提純中有著很大的應(yīng)用前景 現(xiàn)在研究最多的雙水相體系有高聚物 高聚物以及高聚物 無機(jī)鹽體系 常 用的高聚物有聚乙二醇 PEG 和葡聚糖等 無機(jī)鹽主要有磷酸鹽 硫酸鹽等 本實(shí)驗(yàn)所采用的就是 PEG 硫酸鹽體系 另外對于一種不是很常見的雙水相體系 表面活性劑雙水相體系也做了一些探究 一 實(shí)驗(yàn)原理 雙水相萃取法分離提純蛋白質(zhì)是利用蛋白質(zhì)在兩種物質(zhì)所形成的雙水相 中的分配系數(shù)的不同而進(jìn)行分離的 當(dāng)雙水相體系中的兩種物質(zhì)濃度達(dá)到一定 比例時(shí) 就會形成兩個(gè)穩(wěn)定的且互不相溶的兩相 由于脂肪酶在這兩相中的分 配系數(shù)不同 就會自動的向分配系數(shù)高的一相中移動 而其它的雜質(zhì)則分配到 另一相 這樣就達(dá)到了分離提純的目的 由于兩相都是水相 所以一般對于酶 的活性及穩(wěn)定性不會有太大的影響 為了得到適合的兩相配比 就要通過繪制相圖來進(jìn)行分析 相圖的繪制 就是通過調(diào)整兩相比例 得到能夠分相的臨界點(diǎn) 從而得到相圖 蛋白質(zhì)含量測定方法為考馬斯亮藍(lán)法 利用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色 然后 檢測吸光度 對照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到蛋白質(zhì)含量 酶活的檢測方法則有滴定法和 pNPP 法 滴定法是以橄欖油乳化液為底 物 通過檢測脂肪酶水解橄欖油得到的脂肪酸來確定其活性 而 pNPP 法則是 利用脂肪酶水解 4 硝基苯基磷酸二鈉鹽 pNPP 得到有顏色的對硝基苯酚 pNP 11 然后通過分光光度計(jì)檢測其吸光度 對照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到酶活 脂肪酶經(jīng)過雙水相的初步分離后 還要通過凝膠過濾的方法對其進(jìn)行進(jìn) 一步的分離和純化 從而達(dá)到更高的純度 但是經(jīng)過雙水相后 體系中有大量 的 PEG 脂肪酶主要分配在 PEG 相 從而不能直接經(jīng)過凝膠過濾 還需要采取 一定手段去除過量的 PEG 可以采用 PEG 沉淀的方法或者反萃取來去除多余的 PEG 本實(shí)驗(yàn)采用的是 PEG NH4 2SO4體系和 SDS CTAB 體系兩種雙水相 PEG NH4 2SO4體系是較為常用的一種雙水相體系 以前也有人做過相關(guān)的 研究 證明這種體系對于脂肪酶的分離提純效果比較好 6 8 SDS CTAB 體系 是一種表面活性劑雙水相體系 國內(nèi)也有對此類雙水相體系的分配行為及在蛋 白質(zhì)及氨基酸等大分子物質(zhì)的分離提純中的應(yīng)用 但并沒有人將其用于脂肪酶 的分離提純 9 10 二 實(shí)驗(yàn)用品 實(shí)驗(yàn)材料 假單胞菌脂肪酶 由假單胞菌發(fā)酵制備 實(shí)驗(yàn)儀器 紫外可見分光光度計(jì) 離心機(jī) 乳化機(jī) 恒溫?fù)u床 恒溫水浴鍋 PH 計(jì) 實(shí)驗(yàn)藥品及配制方法 PEG1000 NH4 2SO4 十二烷基硫酸鈉 SDS 十六 烷基三甲基溴化銨 CTAB 橄欖油 2 聚乙烯醇 PVA 溶液 糊精 蛋白 胨 K2HPO4 3H2 O MgSO4 7H2 O 0 05mol L NaOH 溶液 酚酞指示劑 EDTA pNPP 乙腈 Tris HCl PH8 5 稱取 6 055gTris HCl 溶于約 800ml 蒸餾水中 用 HCl 調(diào) 節(jié) PH 至 8 5 定容至 1000ml 即可 橄欖油乳化液 將 2 PVA 溶液與橄欖油按 3 1 的比例進(jìn)行混合 在乳化儀上 以 3000r min 的速度乳化 每次 3min 重復(fù)乳化 3 次 發(fā)酵培養(yǎng)基 0 5 糊精 1 5 蛋白胨 0 18 K2HPO4 3H2O 0 07 MgSO4 7H2O 0 14 尿素 2 橄欖油乳化液 調(diào)節(jié) PH 8 4 左右 接種量 2 考馬斯亮藍(lán) 考馬斯亮藍(lán) G 250 100mg 溶于 50ml 95 乙醇 加入 100ml 85 H3PO4 用蒸餾水稀釋至 1000ml 抽慮出去雜質(zhì) 最終試劑中含 0 01 W V 考馬斯亮藍(lán) G 250 4 7 W V 乙醇 8 5 W V H3PO4 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 純的牛血清血蛋白 預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量 根據(jù)其純度同 0 15mol LNaCl 配制成 100ug ml 蛋白溶液 pNPP 底物 將 pNPP 溶于乙腈中使終濃度為 10mmol L 依次加入乙醇和 50mmol L Tris HCL 緩沖液 PH8 5 使乙腈 乙醇 Tris HCl 體積比為 1 4 95 由于該溶液很不穩(wěn)定 需要現(xiàn)配現(xiàn)用 保存時(shí)則是不加 Tris HCl 置 于 20 下保存 三 實(shí)驗(yàn)方法 1 雙水相相圖的制作 12 13 PEG NH4 2SO4體系雙水相相圖制作方法 根據(jù) Albertsson 的方法繪制相圖 取一定量的 40 的 PEG 原液置于試管中 然后加入 40 的硫酸銨原液 混合直至試管中出現(xiàn)沉淀為止 記錄加入的硫酸 銨的量 再加入適量的水 使體系變得澄清 記錄所加入的水 并繼續(xù)加入硫 酸銨使系統(tǒng)再次變混濁 如此反復(fù)操作 計(jì)算達(dá)到混濁時(shí) PEG 與硫酸銨在體系 中所占的質(zhì)量百分?jǐn)?shù) 以硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo) 以 PEG 濃度為縱座標(biāo)即 可得到相圖的雙節(jié)點(diǎn)曲線 表面活性劑雙水相體系相圖的制作方法 分別配制濃度為 0 05mol L 的 CTAB 和 SDS 溶液計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù) 做為 純組分 分別占據(jù)三元相圖的兩個(gè)頂點(diǎn) 以水作為另一個(gè)頂點(diǎn) 在三元相圖上 均勻的取點(diǎn) 按規(guī)定濃度混合配制樣品在一定溫度下恒溫一段時(shí)間 具體時(shí)間 待定 觀察其分相情況 記錄分相時(shí)間及組成 繪制三元相圖 2 粗酶液的制備 按上述配方配制假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)基 100ml 分裝到 2 個(gè) 250ml 錐心瓶中 滅菌后向每瓶中分別接種 1ml 活化后的假單胞菌種 置于 28 左右的搖床中培 養(yǎng) 60h 將所得溶液在 4000r min 條件下離心 10min 取上層清液即為所需的粗 酶液 3 雙水相萃取脂肪酶 PEG NH4 2SO4雙水相體系 先將 PEG1000 和 NH4 2SO4分別配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 50 和 40 兩種濃度 然后按照一定的比例混合 保證體系中的 PEG1000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 15 20 25 NH4 2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 15 20 25 的濃度 即 有 9 組不同的體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 取上述 9 種體系 8g 置于 10ml 刻度試管中 向其 中加入 2g 粗酶液 靜置 15min 左右 觀察分相情況并記錄上下相體積比 分別 取出上下相溶液留待后面實(shí)驗(yàn)使用 SDS CTAB 雙水相體系 分別配制 0 05mol L 的 CTAB 和 SDS 溶液 并按 1 5 1 1 75 1 1 1 1 1 75 1 1 5 等濃度比混合 使其形成 5 種不同的 雙水相體系 在不同的水浴溫度下進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 研究溫度以及體系配比對于表面 活性劑雙水相體系萃取效果的影響 4 蛋白質(zhì)含量測定 本實(shí)驗(yàn)采用的蛋白質(zhì)含量測定方法為考馬斯亮藍(lán)法 先用標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 用分光光度計(jì)檢測 595nm 處的吸光度 并對照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得 到體系中蛋白質(zhì)含量 若測得吸光度值過高可稀釋后再測 5 酶活檢測 滴定法測酶活 向 50ml 錐形瓶中加入 5mlTris HCl PH8 5 4ml 橄欖油乳化液在 45 水浴 鍋中預(yù)熱 4 5min 加入脂肪酶液 1ml 在 45 水浴鍋中反應(yīng) 10min 反應(yīng)完后 立即用 15min 中止液 乙醇 丙酮 1 1 混合液 中止反應(yīng) 向反應(yīng)后溶液中加 入酚酞指示劑 用 0 05mol LNaOH 進(jìn)行滴定 對照組為加入脂肪酶液后不反應(yīng) 而立即中止 酶活的定義為單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生脂肪酶的量 計(jì)算公式為 實(shí)驗(yàn) 組 對照組 10 pNPP 法測酶活 取 4mlpNPP 底物置于 45 水浴鍋中預(yù)熱 5min 加入 50 l 稀釋后的酶液 在 45 下反應(yīng) 5min 后 加入 10 l 的 0 05mol L EDTA 溶液后立即放入冰水 中中止反應(yīng) 用紫外可見分光光度計(jì)測定 405nm 波長處的吸光度 根據(jù)所產(chǎn) 生的對硝基苯酚 pNP 濃度來計(jì)算酶活 單位酶活定義為 45 下 PH8 5 時(shí) 每分鐘分解 pNPP 并釋放 1 l 對硝基苯酚所需酶量 6 PEG 沉淀 取雙水相體系中的上相溶液 PEG 相 脂肪酶主要分布于上相 分別向 其中加入 PEG 使體系中 PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 20 30 40 50 60 等 室溫下靜置 10h 以上 8000r min 離心 收集沉淀并溶于蒸餾水中 留待層析時(shí) 使用 7 分子篩層析純化脂肪酶 層析方法參考課件 所使用的凝膠為實(shí)驗(yàn)室中用于純化脂肪酶的葡聚糖凝膠 四 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論 1 雙水相相圖 PEG NH4 2SO4雙水相體系 實(shí)驗(yàn)中加入 NH4 2SO4以及水的量如下表 初始加入 PEG 量為 5ml NH4 2SO4 m 650190220260260 H2O m400400400400200 NH4 2SO4 m 140160140160140 H2O m200200180200180 NH4 2SO4 m 140140130 5100120 H2O m180150150150100 NH4 2SO4 m 40110 510010065 H2O m100100100100100 NH4 2SO4 m 8080959095 H2O m100100100100 所得的相圖如下 PEG NH4 2SO4 相圖 0 5 10 15 20 25 30 35 40 4789910101011 NH4 2SO4 PEG SDS CTAB 雙水相相圖 該相圖為三角形相圖 引用自文獻(xiàn) 12 在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)在室溫下基本 無法分相 而且很多都凝成了固體裝物質(zhì) 無法搖動 在 45 水浴下也只有 3 號有分相現(xiàn)象 即上圖中的左邊 1 區(qū)域 而右邊的雙水相區(qū)則沒有看到 而且 該體系分相所需的時(shí)間也比較長 所以在后面的實(shí)驗(yàn)中并沒有使用該體系 2 雙水相萃取 PEG NH4 2SO4體系 配制的雙水相體系如下表 12345678 PEG15 15 15 20 20 20 25 25 NH4 2SO415 20 25 15 20 25 15 20 分相后所的到的體系中 上下相比例如下 其中 1 號未分相 可能是由于濃度 太低 2345678 上相 ml 6 26 65 64 442 83 2 下相 ml 2 82 63 24 655 85 6 3 蛋白質(zhì)含量測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖 試管編號0123456 100ug ml 標(biāo)準(zhǔn)蛋白 ml 0 00 10 20 30 40 50 6 0 15mol L NaCl ml 10 90 80 70 60 50 4 考馬斯亮藍(lán)試劑 ml 5555555 搖勻 1h 內(nèi)以 1 號管為空白對照 在 595nm 處比色 A595nm00 09670 16470 2430 30930 41430 4873 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線 y 0 008x 0 0049 R2 0 9972 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 010203040506070 蛋白質(zhì)含量 ug 吸光度 595nm A 實(shí)驗(yàn)中 測得的各組的上 下相體系蛋白質(zhì)含量測定值對照標(biāo)準(zhǔn)曲線為 所檢測的樣品量為 1ml 編號2 上2 下3 上3 下4 上4 下5 上 吸光度 0 5730 4180 5560 3890 5150 5480 404 蛋白質(zhì)含量 ug 8 0926 1577 8805 7957 3687 7805 982 編號5 下6 上6 下7 上7 下8 上8 下 吸光度 0 550 5250 6770 5960 5140 7720 72 蛋白質(zhì)含量 ug 7 8057 4939 3908 3797 35510 5769 927 4 酶活測定 實(shí)驗(yàn)中用滴定法測酶活由于滴定終點(diǎn)不好判斷 測得的酶活不夠準(zhǔn)確 而 且測定過程較復(fù)雜 所以后來改用 pNPP 法進(jìn)行測定 實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線如下 y 17 137x 0 0141 R2 0 9967 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 1 2 1 4 1 6 1 8 2 00 020 040 060 080 10 12 pNP濃度 mM OD405 實(shí)驗(yàn)所測得的數(shù)據(jù)對照標(biāo)準(zhǔn)曲線可得各管內(nèi)的上下相酶活 實(shí)驗(yàn)編號2 上2 下3 上3 下4 上4 下5 上 吸光度 405nm 1 0591 0381 051 0261 0661 0821 003 酶活 12 52312 27812 41812 13812 60512 79211 870 實(shí)驗(yàn)編號5 下6 上6 下7 上7 下8 上8 下 吸光度 405nm 1 1061 0881 1331 0360 4351 2190 416 酶活 13 07212 86213 38712 2555 24114 3915 019 綜合上述數(shù)據(jù)可得下列表格 其中所反應(yīng)的為體系中總的蛋白質(zhì)含量及酶活 實(shí)驗(yàn)編號體積比總蛋白質(zhì)含量總酶活 2 上 6 225 086441552 9512 2 下 2 88 62022687 6072 3 上 6 626 004331639 2684 3 下 2 67 53389631 2124 4 上 5 620 631241411 816 4 下 3 212 44848818 7008 5 上 4 413 16151044 5776 5 下 4 617 951961202 6516 6 上 414 98621028 976 6 下 523 4771338 74 7 上 4 920 5297751201 0292 7 下 5 821 33182607 9908 8 上 4 624 326641323 9812 8 下 5 426 80452542 106 由上表數(shù)據(jù)可以看出 2 號和 3 號中兩相的分配系數(shù)差別最大 所以萃取 脂肪酶的最適條件為 PEG 15 NH4 2SO4 20 25 由于時(shí)間原因 后面的實(shí)驗(yàn) PEG 沉淀還沒有完成 層析也沒有做 只有初 步的實(shí)驗(yàn)方案 5 實(shí)驗(yàn)總結(jié) 在本次的生計(jì)大實(shí)驗(yàn)中 我們都學(xué)到了很多以前都沒有學(xué)到過的東西 首 先就是實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)以及對于實(shí)驗(yàn)的總體把握 與以前的實(shí)驗(yàn)不同的是 本次實(shí) 驗(yàn)基本都是我們自己設(shè)計(jì)并安排的 而以前的實(shí)驗(yàn)教學(xué)我們則是按照老師所給 的現(xiàn)成實(shí)驗(yàn)方案來做 雖然也能學(xué)到一寫實(shí)驗(yàn)基本技術(shù) 但卻無法從總體上了 解一種問題的研究方法 實(shí)驗(yàn)中 我們從最初的查找資料到設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 對于雙水相這種技術(shù)也有了 越來越明確的概念 同時(shí)也對于其中所應(yīng)用到的各種技術(shù)有了更加深入的了解 比如測定酶活及蛋白質(zhì)含量 以前雖然也做過 但都是單純的測定 與這次的 實(shí)際問題的應(yīng)用中是完全不一樣的 其中還要考慮到很多其它的因素 這次的生計(jì)大實(shí)驗(yàn)教會了我們在實(shí)際問題的研究中的一些基本的過程及方 法 雖然這次的實(shí)驗(yàn)由于時(shí)間關(guān)系沒有完成 而且在實(shí)驗(yàn)過程中也經(jīng)歷了幾次 的失敗 但是每次的失敗對于我們來說都是一次鍛煉和學(xué)習(xí)的機(jī)會 讓我們知 道了在這類問題的研究中應(yīng)該注意的一些問題 從而避免在以后的學(xué)習(xí)及研究 中再